全 文 ：第 36 卷 第 3 期 西北农林科技大学学报(自然科学版) Vol.36 No.3
2008 年 3 月 Journal of No rthwest A &F Univer sity(Na t.Sci.Ed.) Mar.2008
山杏种皮黑色素与 Cu2+和 Zn2+络合性质的研究＊
姚增玉1 , 2 ,李科友1 ,赵 忠1 ,马希汉1
(1 西北农林科技大学林学院 ,陕西 杨凌 712100;2中国科学院沈阳应用生态研究所 ,辽宁沈阳 110016)
[ 摘 要] 【目的】研究山杏种皮黑色素与 Cu2+和 Zn2+络合的相关性质 ,为山杏种皮黑色素以及其他植物黑色
素的开发利用提供依据。【方法】采用电位滴定 、紫外-可见光差示吸收光谱和红外光谱对山杏种皮黑色素与 Cu2+
和Zn2+的络合物进行分析。【结果】Cu2+和 Zn2+与山杏种皮黑色素络合后 , 均能促进山杏种皮黑色素酸性位点的去
质子化作用 ,但 Cu2+的促进作用更强 ,结合更为牢固;随 pH 值升高 ,山杏种皮黑色素中解离出的络合位点增多 , 络合
Cu2+能力增强。【结论】Cu2+和 Zn2+主要与山杏种皮黑色素中羰基发生络合作用 ,氨基和羟基参与了络合。
[ 关键词] 山杏种皮;黑色素;金属结合;电位滴定;红外光谱
[ 中图分类号] S718.43 [ 文献标识码] A [ 文章编号] 1671-9387(2008)03-0197-06
Investigat ion of Cu
2+
and Zn
2+
binding in melanin from
teatae of Prunus armeniaca var.ansu
YAO Zeng-yu1 , 2 , LI Ke-you1 , ZHAO Zhong1 ,MA Xi-han1
(1 Col lege o f Forestr y , Northwest A &F Universi ty ,Y ang ling , Shaan xi 712100 , China;
2 I nsti tute o f App lied E colog y , Ch inese Academ y o f S ciences , Shenyang , Liaoning 110016 , China)
Abstract:【Object ive】The coordination chemist ry of Cu2+ and Zn2+ in the melanin f rom testae of
Prunus armeniaca var.ansu was investiga ted to lay a foundation for ut ili zation o f the melanin and o ther
phy tomelanins.【Method】Po tentiome tric tit ration , ul travio let-visible (UV-Vis)dif ferential and Fourier
t ransfo rm inf rared (F T-IR)spect roscopy w ere employed.【Result】The complexation o f the metal ions
promo te depro tonation of the acidic melanin sites and Cu2+ complexat ion mo re obviously and mo re tightly
than that of Zn
2+ .T he melanin had mo re binding capacity w ith Cu2+ at high pH value than at neutral con-
dition.【Conclusion】The essential interactions of the metal ions (Cu2+ o r Zn2+)went on w ith carboxy l
groups and amine and hydroxy l w ere also involved in complexation fo rmation.
Key words:teatae Prunus armeniaca var.ansu;melanin;metal-binding;po tentiometric tit ration;inf ra-
red analy sis
从生物体内提取的黑色素中含有多种金属离
子 ,其中 Cu2+ 、Zn2+和 Fe3+含量最为丰富[ 1-4] ,已经
引起人们的普遍关注 。黑色素在生物体内通过结合
过渡金属离子使组织免受氧化胁迫伤害[ 5-7] ,但黑色
素与金属离子的结合又会影响其保护细胞免受活性
氧(ROS)和光化学诱发的自由基等电活性中心
(redox active species)伤害的能力[ 8] 。金属离子结
合饱和的黑色素可能变成细胞毒素[ 9] 。因此 ,金属
离子的含量影响着黑色素的功能 ,即决定着黑色素
对生物体是产生保护作用(清除自由基)还是毒害作
用(使黑色素具有光敏性并产生超氧阴离子和过氧
化氢等活性氧)。Liu等[ 10] 认为 ,在真黑色素中至少
＊[收稿日期] 2007-03-21
[基金项目] 国家林业局“ 948”引进项目(2004-4-52)
[作者简介] 姚增玉(1974-),男 ,陕西定边人 ,在读博士 ,主要从事森林培育研究。
[通讯作者] 赵 忠(1958-),男 ,甘肃宁县人 ,教授,博士生导师 ,主要从事森林培育研究。
DOI :10.13207/j.cnki.jnwafu.2008.03.017
有 3种不同的官能团可以参与金属离子的结合 ,分
别是羧基(COOH)、羟基(OH)和氨基(NH2)。目
前 ,对黑色素与金属离子络合的化学研究 ,主要集中
在合成黑色素及动物和微生物黑色素方面 ,而对植
物黑色素的研究几乎处于空白 。本研究对山杏
(Prunus armeniaca var.ansu)种皮黑色素与 Cu2+
和Zn2+络合的性质进行了探讨 ,以期深入了解植物
黑色素与金属离子的相互作用 ,为植物黑色素的进
一步开发利用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
去壳杏仁购于陕西省麟游县 ,热烫法手工剥取
种皮 ,自来水冲洗干净后阴干备用 。CuSO 4 ·5H 2O
和ZnCl2 均为优级纯(Johnson Mat they Chemicals
L td ,Eng land)。
1.2 山杏种皮黑色素的提取与纯化
黑色素的提取参考姚增玉等[ 11] 的方法并略有
改动 。在氮气的保护下 ,将 10 g 山杏种皮用 150
mL 0.5 mol/L NaOH 水溶液于 60 ℃水浴中提取 2
次 ,每次 12 h 。提取液用棉布粗滤后 15 000 g 离心
30 min ,盐酸酸化得黑色素沉淀 ,然后用 7 mo l/L
HCl溶液 100 ℃水解 6 h , 10 000 g 离心 30 min ,再
依次用乙醇 、乙酸乙酯 、丙酮洗涤 ,即得黑色素颗粒。
将黑色素颗粒用 0.5 mol/L N aOH 水溶液超声辅
助溶解 , 10 000 g 离心 30 min ,上清液用 2 mo l/L
HCl溶液酸化至 pH <2.5 , 所得沉淀再用 0.5
mol/L NaOH 溶解 ,如此反复沉淀 4次 ,得到的胶状
黑色素放入 -5 ℃的冰箱中冷冻。取出胶状黑色
素 ,室温下解冻 ,10 000 g 离心 30 m in ,将得到的颗
粒状山杏种皮黑色素 ,用蒸馏水洗涤至离心上清液
C1-定性检测为阴性 ,最后真空干燥 ,即得到纯化的
山杏种皮黑色素 。
1.3 山杏种皮黑色素络合物的制备
山杏种皮黑色素络合物的制备参考文献[ 8]的
方法进行 ,并略作调整 。在氮气保护下 ,将 0.020 g
黑色素溶解于 50 mL pH 11.2 的 NaOH 溶液(含
15 mmo l/L KCl)中 ,缓慢加入 5.0 mmo l/L CuSO4
或ZnCl2 水溶液 10 mL ,并不断摇动 ,然后充氮气密
封避光反应 12 h , 以形成黑色素-Cu2+或黑色素-
Zn
2+络合物 ,对照(CK)以 10 mL 除去 CO 2 的蒸馏
水代替 CuSO4 或 ZnCl2 水溶液。用 2 mol/L HCl
或 NaOH 调节溶液 pH 为 11 ,在流动氮气保护下 ,
用 0.1 mol/L HCl(含 15 mmo l/L KCl)滴定 ,每次
加入 HCl 0.05 mL ,体系温度控制在(25±0.1)℃。
pH 值用雷磁 PHS-3C 精密 pH 计(上海雷磁仪器厂
生产)测定 ,所用电极为 E-201-C pH 复合电极 ,待
pH 稳定至少 1 min后记录 pH 值。
1.4 山杏种皮黑色素络合物的紫外-可见光差示吸
收光谱测定
利用光谱法研究强吸收体系成分的变化时 ,光
谱的微小变化容易被强的本底吸收所掩盖 ,利用差
示吸收光谱则可有效地消除本底吸收 ,使光谱的微
小变化得以显现出来 。黑色素对光有着强而广谱的
吸收 ,因此一般呈现较深的颜色 ,其溶液属于强吸收
体系 ,因而本研究采用差示吸收光谱法检测山杏种
皮黑色素络合物的紫外-可见光光谱性质 。将 25
mg 山杏种皮黑色素用 25 mL 0.5 mol/L NaOH 超
声辅助溶解 ,然后用去离子水定容至 1 000 mL ,作
为母液 。在 20只小烧杯中各加入母液 20 mL ,然后
将其平均分成 4组 ,在第 1组和第 2组的各小烧杯
中分别加入 2 mL 2 ,3 ,4 ,5 , 6 mmol/L CuSO 4 水溶
液 ,第 3组和第 4组各小烧杯中分别加入 2 mL 2 ,
3 ,4 , 5 , 6 mmol/ L ZnCl2 水溶液 ,然后用 2 mo l/L
HC l或 NaOH 将第 1组和第3组溶液的pH 值调至
6.7 ,第 2组和第 4组溶液的 pH 值调至10.25。调节
好 pH 值的各组溶液在室温下反应2 h。将 20 mL母
液与 2 mL 去离子水混合并调节 pH 值至 6.7或
11.2 ,分别作为第 1组 、第3组或第 2组 、第 4组的对
照。以对照做基线 ,用 mini-1240 紫外-可见分光光
度仪(日本岛津公司生产)对络合物溶液进行扫描 。
1.5 山杏种皮黑色素络合物的红外(IR)光谱测定
黑色素-Cu2+和黑色素-Zn2+络合物的制备及其
IR光谱分析按照陈晓东等[ 12]的方法进行 ,并略作调
整。称取 25 mg 黑色素样品悬浮于 25 mL 0.02
mol/L CuSO 4 溶液或 ZnCl2 溶液中 ,用 0.1 mo l/L
HC l或 NaOH 调节 pH 值分别为 2.0 , 3.0 , 4.0 , 4.5
和 5.0 ,室温下反应 10 h后过滤。将所得络合物颗
粒用双蒸水洗涤 2次 ,然后置于放有 P2O 5 的干燥器
中 ,室温下干燥 。红外光谱测定时 ,将 2 mg 山杏种
皮黑色素或其络合物与 400 mg KBr 混合研磨压
片 ,然后在 EQUINOX-55型 FT-IR光谱仪(德国布
鲁克公司生产)上扫描。
2 结果与分析
2.1 山杏种皮黑色素络合物的电位滴定
山杏种皮黑色素及其络合物的电位滴定曲线见
图 1。
198 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 36 卷
图 1 山杏种皮黑色素与 Cu2+和 Zn2+
络合物的电位滴定曲线
-◇-.CK;-□-.山杏种皮黑色素-Cu2+;
-△-.山杏种皮黑色素-Zn2+
F ig.1 Po tentiometric titr ation curves fo r Cu2+-com plexes
and Zn2+-complexe s o f me lanin from te stae o f
Prunus armeniaca var.ansu
-◇-.CK;-□-.C u2+-com plexes;-△-.Zn2+-complexes
由图 1可以看出 ,各滴定曲线上均有 3 个缓冲
区 ,根据文献[ 8]可知 ,其归属分别为:(1)在 pH 10
附近及以上有一大的缓冲区 ,是由儿茶酚位点引起
的;(2)在 pH 6附近有一弱的缓冲区 ,是由醌胺引
起的;(3)在 pH 4以下有一强的缓冲区 ,是由羧基
引起的。加入 Cu2+或 Zn2+后 ,滴定曲线处于 CK曲
线下方 ,表明金属离子络合物的形成促进了山杏种
皮黑色素酸性位点的去质子化作用[ 8] 。加入 Cu2+
或Zn2+后的滴定曲线与 CK 的滴定曲线在形状上
较为相似 ,这是由于与加入金属离子的量相比 ,黑色
素分子中与金属离子络合官能团的量相对过剩而引
起的 ,高浓度的 Cu2+或 Zn2+会导致黑色素络合物
从溶液中沉淀出来 。加入 Cu2+后的滴定曲线较加
入Zn2+的低 ,说明 Cu2+与黑色素形成络合物时 ,其
促进黑色素中酸性官能团去质子化作用的能力较
Zn2+强 ,与黑色素结合更为牢固。加入 Zn2+的滴定
曲线与未加金属离子的黑色素溶液的滴定曲线在 pH
小于 4以后几乎重合 ,这是由于黑色素具有离子交换
特性 ,溶液 pH 值的下降促进了 Zn2+与 H+的交换 ,
发生了质子化作用 ,从而使 pH下降速度变缓 。
2.2 山杏种皮黑色素络合物的紫外-可见光差示吸
收光谱分析
图 2是在 2种不同 pH 下 ,加入不同浓度 Cu2+
后山杏种皮黑色素的紫外-可见光差示吸收光谱 。
图 2 Cu2+浓度对山杏种皮黑色素-Cu2+络合物紫外-可见光差示吸收光谱的影响
F ig.2 Increa sing differences with Cu2+in the UV-Vis differential spectrum of melanins fr om
testae of Prunus armeniaca var.ansu
由图 2可以看出 ,每条曲线都在 240 ～ 250 nm
处有一最大吸收峰 ,根据对人工合成 DHI 黑色素
(dihydro xyindo le-melanin)与 Cu2+络合模型的研
究[ 8] 可知 ,该吸收峰是由儿茶酚基与 Cu2+的络合引
起的。图 2 中 , 在 540 ～ 550 nm 附近还有 1 个在
DHI黑色素-Cu2+模型中没有出现的吸收峰 ,由于
199第 3 期 姚增玉等:山杏种皮黑色素与 Cu2+和 Zn2+络合性质的研究
DHI黑色素不含羧基 ,因此根据电位滴定和 IR光
谱初步推断 ,该峰可能是由羧基与 Cu2+的络合引起
的。随着 Cu2+浓度的增加 ,在 217 nm 处也出现一
个吸收峰 ,特别是 pH =10.25 时 ,该吸收峰更为明
显。对合成 DHI 黑色素-Cu2+模型的研究表明 ,在
pH =10.25时有利于儿茶酚基的去质子化 ,Cu2+与
儿茶酚基主要以 1∶2 络合[ 8] ,但是也存在以 1∶1
络合的可能性 ,因此推测本试验 217 nm 处的吸收
峰 ,可能是由于 Cu2+浓度增加后以较高的比例参与
络合的结果 。与 pH =10.25 相比 , pH =6.7 时
Cu2+浓度为 5和 6 mmol/ L 的 2条曲线相距更近 ,
这是由于此时黑色素络合 Cu2+趋于饱和 , pH 越高
则解离出的络合位点越多所致 。
目前 ,尚未见有关黑色素-Zn2+络合物的紫外-
可见光差示吸收光谱的报道。本研究在 2种不同的
pH(pH =6.7 和 pH =10.25)下 , 加入不同浓度
Zn2+后黑色素的紫外 -可见光差示吸收曲线上均
有多个吸收峰 ,但除了在 390 ～ 400 nm 和 540 ～ 550
nm 处的 2个强而宽的吸收峰外 ,其他各吸收峰缺乏
规律性。参照 DHI 黑色素-Cu2+模型[ 8] 以及山杏种
皮黑色素-Cu2+的紫外-可见光差示吸收光谱可以
初步推断:540 ～ 550 nm 处的吸收峰是由 Zn2+与羧
基络合引起的 , 390 ～ 400 nm 处的吸收峰是由 Zn2+
与醌胺基络合引起的 。
2.3 山杏种皮黑色素的 IR光谱解析
图 3为山杏种皮黑色素的红外光谱 ,该图谱与
文献[ 8 ,11-13] 中报道的人工合成黑色素以及天然
黑色素的图谱非常相似 ,但不完全相同 。其原因是
由于黑色素是一类大分子物质 ,虽然其存在一定的
相似性 ,但是不同来源黑色素组成的单体及其比例
和连接方式等均存在着差异 。图 3 中 , 3 420 cm-1
处的吸收带为 OH 和 NH 2 的伸缩振动所致 , 2 925
cm-1和 2850 cm-1处的吸收带为脂肪族 CH 的伸缩
振动所致 , 1 705 cm-1处的吸收带为 COOH 中 C=
O 的伸缩振动所致 , 1 615cm-1处的吸收带为芳环中
C=C 、C =N 的弯曲和羧酸外的 C =O 伸缩振动 、
COO
-的对称拉伸所致 , 1 515 cm-1处的吸收带为
NH 弯曲 、CN 伸缩振动(酰胺Ⅱ带)和芳环 C=C 拉
伸所致 , 1 380 cm -1处的吸收带为 COO-的反对称
伸缩振动所致 ,1 200 ～ 1 260 cm-1处的吸收带为酚
羟基和羧基中的羟基伸缩振动和弯曲振动所致 ,
1 120 cm-1附近的吸收带为羟基振动所致 。
图 3 山杏种皮黑色素的 IR光谱
Fig.3 IR spec trum of melanin from testae of Prunus armeniaca var.ansu
2.4 山杏种皮黑色素络合物的 IR光谱解析
由以上山杏种皮黑色素 IR光谱分析结果可知 ,
山杏种皮黑色素中存在酚羟基 (OH)、羧基
(COOH)和氨基(NH 2),这些基团均是与金属离子
络合的潜在部位 , 金属离子与其络合实际上是与
H +在竞争结合位点[ 14] 。在不同 pH 值条件下 ,黑
色素-Cu2+和黑色素-Zn2+的 IR光谱见图 4和图 5。
由图 4和图 5可以看出 ,除 pH =5时 ,山杏种皮黑
色素-Cu2+在大约 590 cm -1处出现吸收带外 ,在相
同 pH 值下 , 2种络合物的 IR光谱非常相似 ,但与
黑色素的本底谱图(图 3)相比 ,黑色素络合 Cu2+或
Zn2+后 ,随着 pH 值的增大 , 1 705 和 1 210 cm -1处
吸收带的强度下降 , 最后完全消失 , 但在 1 620 ～
1 540 cm
-1和 1 380 cm-1附近有吸收带出现或原有
吸收带加强 ,前者为 COO-的反对称伸缩振动带 ,后
者为 COO-基的对称带 , 表明羧基离子化并与
Cu2+ 、Zn2+络合。在图 4和图 5中 ,COO -基团的反
对称伸缩振动的谱带表现为在 1 590 ～ 1 540 cm-1
处出现 2 ～ 3个弱吸收带 ,与对合成多巴黑色素和天
然黑色素观察到的现象[ 12 , 15] 相似。从图 4 还可以
看出 , 1 615 cm -1处的吸收带变宽 ,并略有低频位
移 ,这是由于共轭酮的 C=O 振动因络合物中 C-
200 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 36 卷
O-Cu和 C=O -Cu 之间的共振而减弱所致[ 16] 。
与金属离子络合后 , 1 515 cm -1附近的吸收带减弱 ,
说明氨基参与了络合 ,限制了 NH 弯曲振动和 CN
伸缩振动 。另外 ,随 pH 的增加 ,山杏种皮黑色素-
Cu
2+和山杏种皮黑色素-Zn2+在 1 400 ～ 1 100 cm-1
处曲线总的走向从逐渐下降变为逐渐上升 ,山杏种
皮黑色素在 1 120 cm-1附近的平台(图 3)逐渐加强
为吸收带(图 4 ,5),说明羟基参与了络合物的形成。
图 4 不同 pH 值下形成的山杏种皮黑色素-Cu2+络合物的红外光谱
Fig.4 I nf rared spectra o f Cu2+-comple xes of melanin fr om testae of P runus armeniaca var.ansu under different pH values.
图 5 不同 pH 值下形成的山杏种皮黑色素-Zn2+络合物的红外光谱
Fig.5 IR spectr a of Zn2+-complexe s o f melanin from testae o f Prunus armeniaca va r.ansu under diffe rent pH values
3 结论与讨论
本试验结果表明 ,金属离子络合物的形成促进
了山杏种皮黑色素酸性位点的去质子化作用 ,且
Cu
2+的促进作用较Zn2+更强 ,与黑色素结合更为牢
固;溶液 pH 值的下降促进了 Zn2+与 H +的交换 ,使
Zn
2+从络合物中置换出来;山杏种皮黑色素与 Cu2+
或Zn2+形成的络合物的 IR光谱 , 受络合介质 pH
值的影响 ,在 pH 为 2.0 ～ 5.0时 ,其对山杏种皮黑
色素与 Cu2+和 Zn2+络合的影响类似 , IR光谱的改
变说明金属离子主要与羰基发生了作用[ 12-13 , 15] ;络
合物在 1 515 cm-1附近的红外光谱吸收带减弱 ,说
明氨基参与了络合。
植物黑色素通常属于异黑色素 ,与土壤腐殖质
的性质较为相似 ,且都属于黑色物质范畴 ,也有人将
土壤腐殖质归为异黑色素[ 17] 。对土壤腐殖质的研
究表明 ,通常情况下 ,金属离子主要与腐殖质和富里
酸中的羰基络合 , 位于 1 620 ～ 1 540 cm-1处的
COO
-不对称振动吸收带是由金属离子与腐殖质中
的羧基以离子型键合引起的[ 12 , 16] 。因此可以推断 ,
201第 3 期 姚增玉等:山杏种皮黑色素与 Cu2+和 Zn2+络合性质的研究
本试验 Cu2+或 Zn2+与山杏种皮黑色素形成的络合
物中 ,Cu2+或 Zn2+与羧基的键合也是离子型的 。在
图 4和图 5中可以观察到 ,随着 pH 值的增大 ,络合
物在 1 200 ～ 1 300 cm -1处的吸收带减弱 ,在 1 380
cm
-1处的吸收带加强 ,这是由于配位作用限制了
OH 的弯曲振动 ,使 C=O 基团的伸缩振动向更高
频率移动而引起的。这种迁移现象是由黑色素的羰
基和邻羟基醌与金属离子络合而导致的[ 12 , 15] 。
致谢:本研究在国家林业局黄土高原林木培育重点开放实验室
完成 ,西北农林科技大学林学院史清华老师和朱海兰老师给予了大
力支持和帮助 ,在此表示感谢。
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