全 文 ：295
李 军1，张乔会2，蓝晶晶3，王建中*
(北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083)
摘 要:山杏核壳是生产中的下脚料，开发利用较少。以山杏核壳为原料提取黑色素，通过响应面法优化工艺条件。
在单因素实验基础上选取实验因素与水平，根据 Box－Benhnken中心组合实验设计原理采用四因素三水平的响应面分
析法。得到最佳提取工艺为:料液比 1∶20，温度 60℃，碱液浓度 1mol /L，时间 4h;在此条件下，提取得率可达 8.33%。
关键词:山杏核壳，黑色素，响应面法，提取
Research of extraction technology of the melanin
from core－shell of wild apricots using response surface analysis
LI Jun1，ZHANG Qiao－hui2，LAN Jing－jing3，WANG Jian－zhong*
(College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China)
Abstract:With less utilization，core－ shell of wild apricot was the scarps of production.On the basis of single factor
experiments，the optimum conditions for the extraction of the melanin from core－ shell of wild apricot were obtained
through Box－Benhnken center－united experiment design and response surface methodology.The results showed that the
optimum conditions of extraction of the melanin from core － shell of wild apricot were as follows:liquid ratio 1∶20，
temperature 60℃，alkali concentration 1mol /L，time 4h.Under this condition，the maximal yield of melanin was up to 8.33%.
Key words:core－shell of wild apricot;melanin;response surface methodology;extraction
中图分类号:TS201.1 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2012)02－0295－05
收稿日期:2011－09－09 * 通讯联系人
作者简介:李军(1985－) ，男，硕士研究生，研究方向:大宗农产品深
加工。
基金项目:中央财政专项:林业公益性科研专项(201004081)。
黑色素(melanin)是一类结构复杂多样的酚类或
吲哚类生物大分子色素的总称［1］。通常与蛋白质、碳
水化合物等络合成不同类型的生物大分子物质，广
泛分布于动物、植物和微生物中［1－2］，许多植物的果
实或叶子呈黑色，可用来提取黑色素。目前，己经研
究过的植物材料主要有:黑大豆、黑香米、葵花籽
皮［3］、黑木耳［4］、黑芝麻［5］、乌饭树叶［6］等，天然植物
黑色素在食品医药方面有着重要的应用价值，已经
有许多将黑色素应用于食品行业及医药行业的研
究［7］。在植物黑色素提取中，利用山杏的较少，只有
姚增玉等利用山杏种皮提取黑色素，提取得率为
4.73%［8］。山 杏 (Prunus sibirica )为 蔷 薇 科
(Rosaceae)李亚科(Prunoideae)李属(Prunus)植
物［9］，在我国北方分布广泛，资源蕴藏量大。核壳是
杏仁加工过程中产生的下脚料，约占杏核重量的
60%，目前除了少数利用山杏核壳烧制活性炭［10］外，
无其它有关山杏核壳开发利用的报道。本研究首次
以山杏核壳为原料提取黑色素，利用响应面法优化
提取工艺，可以变废为宝，提高山杏加工废弃物的附
加值。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
山杏核壳 自制，山杏核购自北京延庆;盐酸、
氢氧化钠、无水乙醇、纤维素酶、糖化酶 苏柯汉生
物公司，酶活力 100000U /mL;氨水、邻苯三酚、蒸馏
水、双氧水(30%)、高锰酸钾、氯酸钠、重铬酸钾 均
为分析纯。
HHS4 型恒温水浴锅 上海浦东跃新科学仪器
厂;752 紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公
司;PHS－3C 型 pH 计 上海精密科学仪器有限公
司;FD－1 冷冻干燥机 北京德天佑科技发展有限公
司;KQ－500E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有
限公司;QI－901 涡旋混合器 海门市其林贝尔仪器
制造有限公司;RE－5203 旋转蒸发仪 上海亚荣生
化仪器厂;SHB－Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城
科贸有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 山杏核壳黑色素提取方法 采用碱溶液提
取，用酶法水解、有机溶剂洗涤和反复沉淀的方法进
行提取纯化。工艺流程:碱溶液提取→酸液沉降→纤维
素酶酶解→糖化酶酶解→碱溶解→再次酸沉→有机溶剂洗涤
→二次碱溶解→去除氯离子及干燥。
操作要点:碱溶液提取:称取 5.0g 山杏核壳粉
末，放入 250 mL 锥形瓶中，按料液比 1 ∶ 20 加入
100mL浓度为 0.5mol /L的 NaOH水溶液，经过 3h 提
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.02.107
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取后，用离心机 8000r /min 离心 5min，上清液进行抽
滤除去液体中的固体物质，液体为黑色素粗提液。
酸液沉降:向黑色素粗提液中加入 2mol /L HCl
溶液直至溶液 pH ＜2.5，使黑色素沉淀，室温静置 2h，
再 8000r /min 离心 5min 除去液体，所得沉淀为山杏
核壳黑色素粗提物。
纤维素酶酶解:向黑色素粗提取物中按 0.1%的
重量比加入纤维素酶，调 pH5.0，温度 55～60℃，在电
热恒温振荡器上振荡 1h。然后 8000r /min 离心
5min，分离除去上清液。
糖化酶酶解:向纤维素酶处理后的固体中按
0.1%的重量比加入糖化酶，调 pH 至 4.5，温度 60℃，
在电热恒温振荡器上振荡 1h。然后 8000r /min 离心
5min，分离除去上清液。
碱溶解:向糖化酶处理后的固体中按料液体比
1∶30加入浓度为 0.5mol /L 的 NaOH 水溶液，用超声
波辅助溶解 30min，然后 8000r /min 离心 5min，离心
分离除去不溶解固体。
有机溶剂溶解:黑色素固体颗粒用无水乙醇洗
涤。每次溶剂用量约为黑色素颗粒质量的 20 倍，混
合振荡 30min，可以用超声波辅助洗涤，然后离心分
离，每种溶剂重复洗涤至上清液无色为止。
去除氯离子:胶状沉淀用蒸馏水洗涤至离心上
清液氯离子定性检测为阴性(加入硝酸银溶液后溶
液不变混浊) ，最后冷冻干燥至恒重。
1.2.2 黑色素的检测及提取得率的计算及性质研究
配制山杏核壳黑色素的标准溶液，检测它的紫
外－可见光吸收谱图。将 22mg纯化干燥后的黑色素
用 10mL质量分数 0.2%的氨水在氮气保护下超声辅
助溶解，用旋转蒸发仪减压抽去多余氨气，直至 pH
达 7.5，最后用去离子水稀释至所需浓度。
山杏核壳黑色素理化性质的检测:常规溶解性、
可溶性分析。对漂白剂的反应，10mL 66mg /L 山杏
核壳黑色素溶液分别与 1mL H2O2(30%)、NaClO、
KMnO4(100mg /L)和 K2Cr2O7(100mg /L)溶液混合，观
察混合溶液颜色的变化。按下式计算山杏核壳黑色素
提取得率:黑色素提取得率(%)=(m/M)×100%。
式中:m为提取所得黑色素的重量，M 为山杏核
壳的重量。
1.2.3 最佳提取工艺的确定 以温度、时间、碱液浓
度、液料比为自变量，以山杏核壳黑色素的提取得率
为响应值，设计四因素三水平的响应面分析实验实
验的因素和水平的取值见表 1，利用 design－expert7.1
软件程序分析各单因素对山杏核壳黑色素提取得率
的影响，找出最佳条件。
表 1 响应面分析因素与水平
Table 1 Analytical factors and levels for RSA
水平
因素
X1 碱液浓度
(mol /L)
X2 温度
(℃)
X3 料液比
(g /mL)
X4 时间
(h)
－ 1 0.5 20 1∶15 2
0 1.0 40 1∶20 4
1 1.5 60 1∶25 6
2 结果与分析
2.1 黑色素提取工艺单因素确定
2.1.1 碱溶液浓度对提取得率的影响 从植物材料
中提取黑色素一般采用碱溶液作为提取溶剂，多采
用氨水或 NaOH［8］，氨水作为提取溶剂，山杏核壳黑
色素的提取得率较低，且氨水加热提取时容易挥发，
若采用密闭加压提取，则操作复杂，因此本研究以不
同浓度的 NaOH溶液为提取溶剂进行对比研究。由
图 1 可见，NaOH 浓度对提取得率有显著影响，最适
浓度为 1mol /L，但 0.5mol /L浓度与 1mol /L的浓度在
提取效果上差距不太大。
图 1 碱液浓度对山杏核壳黑色素提取得率的影响
Fig.1 Effect of NaOH concentration on the yield of
melanin from core－shell of wild apricots
2.1.2 提取温度对山杏核壳黑色素提取效果的影
响 由图 2 可知，温度对黑色素得率、提取效果有比
较显著的影响，从 0℃到 60℃，提取得率随着温度的
升高而逐渐加大，基本呈正相关关系。从 60℃到
100℃，提取得率基本不受温度的影响，提取水平停
留在 60℃时的水平。在室温下黑色素被提取出来的
量比较少。植物黑色素是一类由酚类单体组成的大
分子物质，具有还原性，易被氧化［11］，前人的研究表
明，在氧化过程中，酚羟基转变为醌基。40℃及以下
温度对总多酚含量的影响无显著差异，但在 60 ～
100℃的温度区间，黑色素的氧化程度越低，抗氧化
能力越强。在温度高于 60℃后，虽然提取得率基本
一致，但 60℃以上提取的黑色素纯化的过程中难度
加大。考虑得率及黑色素的性质等因素，山杏核壳
黑色素的提取温度以 60℃为宜。
图 2 温度对山杏核壳黑色素提取得率的影响
Fig.2 Effect of temperature on extraction of
melanin from core－shell of wild apricots
2.1.3 提取时间对山杏核壳黑色素提取效果的影响
由图 3 可见，提取时间对黑色素得率影响分三个
阶段，积极响应阶段为 0～4h，提取得率随时间的延长
呈正相关关系。在 6～24h 时段内，提取得率随时间
的延长而逐渐增大，也呈正相关关系，增长趋势变
缓。第三个阶段为 24h 以后，提取得率基本保持不
297
表 2 响应面分析的实验结果
Table 2 Program and experimental results of RSA
实验号 X1 X2 X3 X4 Y提取得率(%) 实验号 X1 X2 X3 X4 Y提取得率(%)
1 0 0 － 1 1 7.46 15 0 1 1 0 8.22
2 0 1 0 1 8.14 16 0 0 1 － 1 7.52
3 － 1 0 0 － 1 5.30 17 1 0 0 － 1 7.90
4 － 1 － 1 0 0 4.08 18 0 － 1 0 － 1 4.30
5 － 1 1 0 0 7.90 19 0 1 － 1 0 7.36
6 － 1 0 － 1 0 7.24 20 1 － 1 0 0 4.54
7 1 0 － 1 0 7.84 21 0 0 0 0 8.10
8 0 － 1 0 1 4.96 22 － 1 0 1 0 7.70
9 0 0 1 1 8.40 23 0 0 － 1 － 1 6.54
10 1 0 0 1 8.13 24 0 － 1 1 0 4.90
11 0 0 0 0 8.16 25 － 1 0 0 1 7.78
12 0 1 0 － 1 7.44 26 1 1 0 0 8.12
13 0 0 0 0 8.08 27 1 0 1 0 8.14
14 0 － 1 － 1 0 4.66
变。考虑提取得率和黑色素的性质稳定，提取温度
以 4～6h为宜。
图 3 提取时间对山杏核壳黑色素提取得率的影响
Fig.3 Effect of reaction time on extraction of
melanin from core－shell of wild apricots
2.1.4 提取料液比对山杏核壳黑色素提取效果的影
响 用 0.5mol /L NaOH作为提取溶剂，60℃提取 3h，
研究不同料液比对提取得率的影响。由图 4 可见，
料液比对提取得率有一定的影响，但影响不如其它
几个因素显著，最适料液比为 1∶20。
图 4 料液比对山杏核壳黑色素提取得率的影响
Fig.4 Effect of reaction material to liquid ratio on
extraction of melanin from core－shell of wild apricots
2.2 黑色素提取工艺优化
2.2.1 响应面模型的建立与结果 以 X1(碱液浓
度)、X2(温度)、X3(液料比)、X4(时间)为自变量，以
山杏核壳黑色素的提取得率为响应值，设计四因素
三水平的响应面分析实验，实验的模型及结果如表 2
所示。
采用 design－expert7.1 软件程序对实验数据进行
回归分析，得出山杏核壳黑色素提取得率的回归方
程如下:
Y = 8.11 + 0.39X1 + 1.65X2 + 0.32X3 + 0.49X4 －
0.06X1X2－0.04X1X3 －0.56X1X4 + 0.16X2X3 + 1.000E－
002X2X4 + 0.01X3X4－0.33X
2
1－ 1.59X
2
2－0.17X
2
3－0.43X
2
4。
其决定系数 R2 = 0.9715，说明回归方程适用于提
取山杏核壳黑色素提取的理论预测值。对回归方程
做显著性检验与方差分析，结果见表 3。
从方差分析结果可知，模型在 P≤0.01 时水平差
异极显著，因变量与所有自变量之间的线性关系显
著(R2 = 0.9715) ，说明该模型能够较好地描述实验结
果，回归方程的一次项、二次项都显著，说明响应值
的变化相当复杂，实验因子对响应值的影响不是简
单的线性关系;失拟项 F 值很小，说明方程对实验的
拟合情况好，实验误差小。通过对 Y 的回归系数的
检验可知，各因素对山杏核壳黑色素提取得率影响
的大小顺序为:温度(X2)＞ 时间(X4)＞ 碱液浓度
(X1)＞料液比(X3)。
2.2.2 提取工艺条件的确定 根据回归方程，做出
响应面，考察拟合响应曲面的形状，分析液料比、碱
液浓度、提取温度和提取时间对山杏壳黑色素提取
得率的影响。由图 5～图 10 可知，温度(X2)对山杏
壳黑色素提取得率的影响最为显著;提取时间(X4)、
提取碱液浓度(X1)、料液比(X3)次之。利用 design－
expert7.1 软件程序对工艺条件进行优化，可得最佳方
案为:提取温度为 60℃，提取时间为 4h，提取碱液浓
度为 1.0mol /L，液料比为 1 ∶20，在此工艺条件下，山
杏壳黑色素提取得率的预测值为 8.33%。
2.3 山杏核壳黑色素的性质
当加入 KMnO4、K2Cr2O7、NaClO和 H2O2 后，首先
形成沉淀，而后溶液褪色。山杏核壳黑色素具有黑
色素典型的性质:不溶于水和常见的有机溶剂，溶于
碱溶液，pH ＜ 3 时产生沉淀，可被 H2O2、KMnO4、
K2Cr2O7 和 NaClO等强氧化剂漂白。
山杏核壳黑色素的紫外可见光谱(200～800nm，
298
表 3 二次响应面回归模型方差分析
Table 3 ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance table
方差来源 平方和 自由度 DF 均方 F值 Pr ＞ F 显著性
模型 54.02 14 3.86 29.21 ＜ 0.0001 ＊＊
X1 1.82 1 1.82 13.76 0.0030 ＊＊
X2 32.47 1 32.47 245.86 ＜ 0.0001 ＊＊
X3 1.19 1 1.19 9.02 0.0110 *
X4 2.87 1 2.87 21.74 0.0005 ＊＊
X1X2 0.01 1 0.01 0.11 0.7469
X1X3 0.01 1 0.01 0.05 0.8295
X1X4 1.27 1 1.27 9.58 0.0093 ＊＊
X2X3 0.10 1 0.10 0.73 0.4104
X2X4 0.0004 1 0.00 0.003 0.9570
X3X4 0.0004 1 0.00 0.003 0.9570
X21 0.58 1 0.58 4.40 0.0579
X22 13.42 1 13.42 101.61 ＜ 0.0001 ＊＊
X23 0.15 1 0.15 1.12 0.3116
X24 0.99 1 0.99 7.47 0.0182 *
总离差 1.58 12 0.13
失拟差 1.58 10 0.16 91.24 0.0109 *
总残差 0.0035 2 0.00
注:* 代表 5%显著水平;＊＊代表 1%显著水平。
图 5 Y = f(X1，X2)的响应面
Fig.5 Responsive surface graph of Y = f(X1，X2)
图 6 Y = f(X1，X3)的响应面
Fig.6 Responsive surface graph of Y = f(X1，X3)
图 7 Y = f(X1，X4)的响应面
Fig.7 Responsive surface graph of Y = f(X1，X4)
如图 11所示)是一条随波长增大而吸光度减小的曲
图 8 Y = f(X2，X3)的响应面
Fig.8 Responsive surface graph of Y = f(X2，X3)
图 9 Y = f(X2，X4)的响应面
Fig.9 Responsive surface graph of Y = f(X2，X4)
图 10 Y = f(X3，X4)的响应面
Fig.10 Responsive surface graph of Y = f(X3，X4)
299
线，在紫外区和可见光短波区很宽的波长范围内有较
强的吸收，在整个扫描范围内没有明显的吸收峰。但
山杏核壳黑色素在 270～280nm处有一较弱的肩峰［12］，
这一肩峰是由水解残留蛋白质中的芳族氨基酸残基对
光的吸收所引起的，与姚增玉所研究的山杏种皮黑色
素及 DOPA黑色素的紫外可见光谱图吻合［8］。
图 11 山杏核壳黑色素紫外可见光谱
Fig.11 UV－Vis spectra of melanin
from core－shell of wild apricots
3 讨论
目前，对山杏核壳的利用只局限于少量的壳用
来烧制活性炭，利用率极低，若能通过研究将山杏核
壳先提取黑色素等物质，剩余的渣制成载钯活性炭
等高质量的活性炭，能创造出巨大的经济价值，同时
也能为食品工业中的一些工艺如脱色等增加新的可
利用材料，前景良好。山杏核壳的成分多样，含有大
量的木质素，一定量的黄酮类物质等。在山杏核壳
黑色素提取过程中，如能将黄酮类物质提取、木质素
提取等有机结合起来，形成一个科学合理的提取体
系，便能很好做到节约资源和防止环境污染，且能创
造出更大的经济价值。山杏核壳黑色素的性质有待
进一步深入的研究。
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63－65.
(上接第 294 页)
极大减少了酸用量，降低了对环境的污染，且有利于
保留蛋膜的原有的物理化学性质。该法操作简单，
成本低廉，对环境污染小，提取的蛋膜纯度较高，便
于大规模蛋壳膜分离。
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