全 文 ：檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶
综上离体实验，提示小半夏加茯苓汤及其拆方
提取物对家兔离体胃肠运动具有双向调节作用，复
方优于拆方，即:小半夏加茯苓汤 ＞ 小半夏汤 ＞
生姜 ＞半夏。对离体胃肠运动的影响可概括为:胃
缩肠舒，此结论与胃以降为顺、肠以通为用的理论相
吻合，有利于胃肠正常活动。结果显示，该方及拆方
除了对正常离体胃肠起作用，还能拮抗氯化乙酰胆
碱引起的胃肠平滑肌强直痉挛，并且对阿托品引起
的十二指肠平滑肌舒缩活动减弱具有协同作用，而
对阿托品作用后的胃底和胃窦平滑肌有兴奋作用，
揭示其对作用机制除了与 M 胆碱受体相关外，可能
还与影响胃肠运动功能的其他因素有关，具体机制
尚有待进一步深入研究。
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［责任编辑 聂淑琴］
［收稿日期］ 20110528(002)
［基金项目］ 江西省自然科学基金项目(2010GQY0010) ;江西省教育厅科技计划项目(GJJ11206)
［通讯作者］ * 程齐来，讲师，硕士研究生，从事生药学相关的教学与科研工作，Tel:18970786158，E-mail:cql_57@ 126． com
山绿茶中 ilexgenin A抗大鼠移植性肝癌的作用
程齐来 * ，李洪亮
(赣南医学院药学院，江西 赣州 341000)
［摘要］ 目的:用大鼠 Walker-256 移植性肝癌模型研究 ilexgenin A 抗肿瘤作用以及对肿瘤血管内皮生长因子(VEGF)和
微血管密度(MVD)的影响，以探讨 ilexgenin A 抗肝癌作用机制。方法:32 只大鼠移植性肝癌模型随机分为 4 组:ilexgenin A
高、低剂量(100，500 mg·kg － 1·d － 1)组，5-Fu(5 mg·kg － 1，隔日 1 次)组，模型组。于造模成功后第 8 天 ilexgenin A 治疗组及 5-
Fu 组 ip 给药，模型组分别 ig 生理盐水 10 mL·kg － 1给药，连续用药 14 d 后停药 24 h，取血处死大鼠，取出瘤块称重，常规瘤体组
织形态学观察，分离血清检测肝功能指标天冬氨酸转氨酶(AST) ，丙氨酸转氨酶(ALT) ，用免疫组化法检测瘤块中 VEGF 和
MVD 的表达情况;另设正常组饲养大鼠 8 只，不进行造模及给药，供实验结束时作空白对照用。结果:ilexgenin A 给药组瘤重
明显低于模型组 (P ＜ 0. 01) ;ilexgenin A 给药组及 5-Fu 血管条数目密集程度较模型组比较明显减少，ilexgenin A 对血清 AST，
ALT 活性升高有明显的拮抗作用，AST 的含量与模型组比较差异显著(P ＜ 0. 01) ;实验造模各组 VEGF 及 MVD 的表达水平均
明显高于正常组(P ＜ 0. 01) ;两者的表达均以模型组最高。结论:ilexgenin A 可显著抑制大鼠体内癌细胞生长，对移植性肝癌
所造成的肝功能损伤具有明显的保护作用，其作用机制可能与下调 VEGF 和 MVD 的表达水平有关。
［关键词］ ilexgenin A;血管内皮生长因子;微血管密度;作用机制
［中图分类号］ R285． 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2012)06-0196-04
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第 18 卷第 6 期
2012 年 3 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 6
Mar．，2012
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2012.06.064
Inhibition Action of Ilexgenin A from Ilex hainanensis on
Transplanted Hepatoma in Rats
CHENG Qi-lai* ，LI Hong-liang
(School of Pharmacy，Gannan Medical College，Ganzhou 341000，China)
［Abstract］ Objective:To study the effect of ilexgenin A on vascular endothelial growth factor (VEGF)
and microvessel density (MVD)of tumor in Walker-256 rat model to explore the mechansim． Method:Thirty two
Walker-256 rats were randomly divided into 4 groups，and treated with the high dose of ilexgenin A (HD group) ，
low dose of ilexgenin A，5-Fu (positive group) ，and normal saline (NS group) ，respectively． After 8 days of
modeling，corresponding drugs were administered by intraperitoneal injection for 14 days． Then，blood rats werr
executed to collect blood and remove tumors which were weighted，the morphological observation was performed，
aspartate transaminase (AST)and alanine transaminase (ALT)levels were assayed，and the expression of VEGF
and MVD in tumor was tested by immunohistochemical method． Result:In treatment group ，the weight of tumor
obviously decreased than that in model． In treatment group and 5-Fu ，the vascular article number intensive
degree，compared with model group，was obviously reduced，and ilexgenin A inhibited the elevated level of AST
and ALT，the inhibition on AST level was more obvious (P ＜ 0. 01) ，the expression of VEGF and MVD levels was
significantly decreased compared with model group (P ＜ 0. 01)． Conclusion:Ilexgenin A can significantly inhibit
growth of tumor，the mechanism may be related to down-regulating the expression of VEGF and MVD．
［Key words］ ilexgenin A;vascular endothelial growth factor;microvessel density;mechanism of action
山绿茶为冬青科植物海南冬青 Ilex hainanensis
Merr．的干燥叶经加工炮制而成，具有清热解毒，消
肿止痛，活血通脉的功效。主要用于降血压、降血
脂、降胆固醇及冠心病、脑血管意外所致的偏瘫，以
及风热感冒、肺热咳嗽、咽喉水肿、扁桃体炎、痢疾等
病症［1］。山绿茶为广西少数民族民间中草药，使用
历史悠久，目前主要作为生产降压制剂的原料药材
使用。山绿茶主要化学成分为黄酮类、三萜苷类、三
萜酸类及香豆素类等［2］。本课题组通过前期的研
究，已从山绿茶中分离鉴定出多个三萜类化合物，其
中的 ilexgenin A(IA)又名 3β，19α-羟基乌苏-12-烯-
24，28-二羧酸，属于乌苏烷型三萜，而现代研究表
明一些三萜和三萜皂苷特别是具有羧基的该类化合
物具有抗肿瘤活性［3］，乌苏烷型三萜大多是乌苏酸
的衍生物。本课题组针对 ilexgenin A 是否具有抗移
植性肝癌作用及其抗肝癌作用的机制进行研究。
1 材料
1. 1 动物 SD 雄性大鼠 40 只，体重(200 ± 20)g，
取 32 只用于制作大鼠移植性肝癌模型;断奶 Wistar
雄性大鼠 4 只，体重 60 ～ 80 g，用于癌细胞增殖传
代，购于江西中医学院实验动物中心(动物生产合
格证号 JZDW2008-0281)。
1. 2 瘤株 种鼠购于武汉大学中国典型培养物保藏
中心，为 Walker-256 腹水型 Wistar 大鼠，重约 80 g。
1. 3 药物 ilexgenin A(IA，批号 091001，含量
100%，HPLC 法)自制;氟尿嘧啶(5- Fu)注射液
(0. 25 g /10 mL)由上海旭东海普药业公司生产。
1. 4 试剂 即用型二步法免疫组化检测试剂盒，产
品编号 PV-6002;鼠抗人 VEGF 单克隆抗体，产品编
号 ZM-0264;鼠抗人 CD-34 单克隆抗体，产品编号
ZM-0045，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1. 5 仪器 LEICA-RM2135 石蜡切片机(德国产)、
ZMN-6802 漂烘处理仪、ZMN-7803 全自动组织包埋
机、ZMN-9802 全电脑自动组织脱水机、Olympas 显
微镜等。
2 方法
2. 1 造模 SD 雄性大鼠 40 只，按比随机留 8 只为
正常饲养组，其余 32 只进行造模。参照文献方法［4］
用 l mL 注射器吸取 Walker-256 荷瘤鼠腹水，注入幼
年 Wistar 大鼠皮下，长出皮下实体瘤，取瘤体边缘鱼
肉状、质地稍韧的瘤组织切成约 2 mm 小块，SD 大
鼠麻醉后打开腹腔，暴露肝脏，在肝左外叶表面切一
长 2 mm 的切口，将备用瘤块完全埋入，用可吸凝胶
海绵填塞压迫，防止瘤块脱出及出血，肝叶送入腹
腔，缝合腹壁。大鼠接种癌瘤 7 d 后肝脏中形成直
径 8 ～ 10 mm 大小的实体瘤。
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程齐来，等:山绿茶中 ilexgenin A 抗大鼠移植性肝癌的作用
2. 2 分组及给药 模型动物按比例随机分为 5 组，
IA 高、低剂量组，5-Fu 组(阳性对照组) ，模型组，每
组 8 只。正常组 8 只，不进行造模及给药，正常饲养
供实验结束时取肝脏组织作空白对照用。于造模后
第 8 天开始给药，IA 高、低剂量组分别以 100，50
mg·kg － 1 ip 给药，每日 1 次，模型组以生理盐水 10
mL·kg － 1 ig，每日给药 1 次，连续给药 14 d，5-Fu 组以
5-Fu 注射液 5 mg·kg － 1 ip 给药，隔日 1 次，共给 7 次。
2. 3 肝肾功能检测及瘤体病理组织学观察 第 14
天给药后 24 h，心脏取血检测肝功能指标 AST，
ALT，处死所有动物，给药组、模型组取出瘤块称重，
计算肿瘤抑制率。
肿瘤抑制率 =(1 －实验组平均瘤重 /对照组平均瘤重)
× 100%
正常组取肝组织，以生理盐水冲洗后，10%中性
福尔马林液固定，石蜡包埋，进行连续石蜡切片，厚
度 4 μm，常规病理组织学观察。
2. 4 免疫组化染色［5］ 病理切片观察后，取瘤体
血管周围组织，进行连续石蜡切片，厚度 4 μm 分别
进行 VEGF 及 CD-34 单抗的免疫组化染色，具体操
作按试剂盒说明书进行。主要染色步骤如下:切片
脱蜡至无水，3% H2O2 孵育消除内原性过氧化物酶
的活性，高压抗原修复，非免疫性动物血清孵育，滴
加一抗，滴加山羊抗小鼠 IgG 抗体-HRP 多聚体，以
上各步骤间均以 PBS 冲洗 3 次。DAB 显色、苏木素
精复染、乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微
镜观察。
2. 5 免疫组化结果判定［5］ VEGF 结果判定标准:
选择切片中染色反应最强的区域。在 400 倍显微镜
下，每例计数 10 个视野，以细胞浆内出现棕黄色颗
粒为阳性，染色结果综合染色程度及阳性细胞百分
比两方面进行综合计分，以二者积分和记分。染色
程度计分为:细胞无染色为 0 分，染色较弱但明显高
于背景者为 1 分，染色清晰计为 2 分，染色强计为 3
分。阳性细胞百分比计分:阳性细胞数:≤10% (0
分) ，10% ～≤25%(1 分) ，25% ～≤50%(2 分) ，＞
50%(3 分)。MVD 计数按文献报道［4］的方法进行:
先用 40 倍光镜扫视整个切片，寻找血管高密度区，
即“热点”，再在 200 倍光镜下计数被 CD-34 抗体染
成棕黄色的血管环(条)数目，每张片记数 3 个视野
区，取其平均数，同一组大鼠肿瘤的平均 MVD 作为
该组的 MVD。
2. 6 统计学处理 所有数据用 珋x ± s 表示，采用
SPSS 14. 0 统计软件进行单因素方差分析和 q 检验。
P ＜ 0. 05 有统计学意义。
3 结果
3. 1 肝肾功能检测及瘤体病理组织学观察 IA 给
药组瘤重明显低于模型组，差异显著(P ＜ 0. 01) ，IA
给药组与 5-Fu 组比较作用不及 5-Fu。实验各组大
鼠瘤体病理组织学观察显示 IA 给药组及 5-Fu 血管
条数目密集程度较模型组比较明显减少，说明 IA 显
著抑制了大鼠体内癌细胞的生长。实验各组大鼠肝
功能指标 AST，ALT 检测结果来看，IA 对血清中
AST，ALT 活性升高有明显的拮抗作用，IA 给药组
血清中 AST 的含量与模型组比较差异显著(P ＜
0. 01)。见表 1 及图 1。
表 1 各组大鼠瘤体质量及肝肾功能指标的比较(珋x ± s，n = 8)
组别 剂量 /mg·kg － 1 瘤体质量 /mg 抑瘤率 /% AST /U·L － 1 ALT /U·L － 1
IA 100 1 211． 1 ± 9． 541，2) 59． 42 121． 84 ± 22． 152) 74． 35 ± 2． 24
50 1 865． 4 ± 23． 541，2) 37． 50 99． 58 ± 32． 052) 65． 14 ± 3． 54
5-Fu 5 897． 9 ± 26． 331，2) 69． 91 165． 25 ± 18． 242) 70． 24 ± 20． 15
模型 － 2 984． 5 ± 16． 531) － 221． 88 ± 15． 341) 86． 15 ± 14． 32
正常对照 － 0 － 74． 65 ± 0． 65 49． 37 ± 7． 05
注:与正常组比较1)P ＜ 0. 01;与模型组比较2)P ＜ 0. 01。
3. 2 各组瘤体 VEGF 及 MVD 免疫组化表达 造模
各组 VEGF 及 MVD 表达的水平均高于正常组，差异
有非常显著性意义(P ＜ 0. 01) ;两者的表达均以模
型组最高。IA 高、低剂量组、5-Fu 与模型组比较，差
异有非常显著性意义(P ＜ 0. 01)。见表 2。
4 讨论
肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病之一。目
前临床用于治疗肿瘤的化学类药物大多价格昂贵、
毒副作用大且易产生耐药，因此，从天然药物中获取
有效成分并以此为先导化合物是抗肿瘤药物研究和
开发的重要途径之一。山绿茶为冬青科植物海南冬
青的干燥叶，其主要化学成分有三萜类、黄酮类等，
现代研究表明一些三萜和三萜皂苷特别是具有羧基
的该类化合物具有抗肿瘤活性，IA 属于这一类型的
乌苏烷型三萜。本实验结果显示，和正常组比较，造
模各组 VEGF 及 MVD 的表达明显增加，以模型组最
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第 18 卷第 6 期
2012 年 3 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 6
Mar．，2012
A. IA 100 mg·kg － 1组;B. IA 50 mg·kg － 1组;C． 5-Fu 5 mg·kg － 1组;D．模型组
图 1 实验各组大鼠瘤体组织形态学观察(HE × 40)
表 2 实验各组大鼠 VEGF 及 MVD 表达水平
的比较(珋x ± s，n = 8)
组别 剂量 /mg·kg － 1 VEGF /分 MVD /条
IA 100 2. 01 ± 0. 181，2，3) 17. 43 ± 2. 211，2，3)
50 2. 61 ± 0. 241，2) 21. 82 ± 1. 791，2)
5-Fu 5 1. 26 ± 0. 051，2) 16. 47 ± 1. 561，2)
模型 － 5. 31 ± 1. 201) 25. 68 ± 1. 321)
正常对照 － 0. 87 ± 0. 05 12. 93 ± 0. 37
注:与正常组比较1)P ＜ 0. 01;与模型组比较2)P ＜ 0. 01;与 IA50
mg·kg － 1组比较3)P ＜ 0. 05。
高，与模型比较，IA 高、低剂量组和 5-Fu 组均可明
显抑制肝癌细胞中 VEGF 及 MVD 的表达;在降低
VEGF 及 MVD 的表达作用上，IA 高剂量组和 5-Fu
组的作用相似，IA 高剂量组的作用优于 IA 低剂量
组。IA 给药组瘤重明显低于模型组，与模型组比较
差异显著，病理组织学观察显示 IA 给药组及 5-Fu 血
管条数目密集程度较模型组比较明显减少，显著抑制
了小鼠体内癌细胞的生长。IA 对血清中 AST、ALT
活性升高有明显的拮抗作用，IA 给药组血清中 AST
的含量与模型比较差异显著，这说明 IA 对移植性肝
癌所造成的肝功能损伤具有明显的保护作用。
血管生成在实体肿瘤的生长、发展、转移等方面
至关重要，血管生成受血管生成促进因子和血管生
成抑制因子的共同调控［5］。VEGF 被认为是作用最
强的血管生成促进因子，它主要通过自分泌或旁分
泌与内皮细胞上的相应受体(VEGFR)结合，促进内
皮细胞分化、增殖、迁移，增加毛细血管通透性，刺激
肿瘤新生血管生成。肝癌是典型的富有血管的恶性
实体肿瘤，VEGF 在其生长及转移过程中起重要作
用，研究表明在肝癌组织中常表现为 VEGF 的高表
达，且癌组织明显高于癌周组织，VEGF 的过量表达
与肝癌病人的预后密切相关。因此在基因水平抑制
VEGF 表达，阻断 VEGF 诱发的内皮细胞信号转导，
可以抑制肿瘤血管生成［6］。MVD 直接量化反映肿
瘤血管生成的程度，不仅与肿瘤细胞的营养和供氧
有关，而且反映了肿瘤的浸润和转移能力，MVD 高
的肿瘤更易发生转移或潜在转移。国内外研究表
明，运用抗血管生成因子如内皮抑素等可有效地抑
制内皮细胞增殖，降低肿瘤组织 MVD，从而达到抑
制肿瘤细胞的生长、侵袭和转移的目的［7］。从而提
示 IA 具有一定的抑制 Walker-256 移植性肝癌血管
生成的作用，其抗肿瘤血管生成的机制可能与降低
VEGF 的表达有关，以高剂量组作用更为明显。
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［责任编辑 聂淑琴］
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