全 文 ：茅莓总皂苷对局灶性脑缺血 /再灌注大鼠的比较蛋白质组学研究
王继生1 ,邱宗荫 2 ,夏永鹏 2 ,李惠芝2
(1.绵阳市第三人民医院 ,四川 绵阳　621000;2.重庆医科大学药学院 , 重庆　400016)
收稿日期:2008-09-20,修回日期:2008-11-25
基金项目:重庆市重大科技专项资助课题 [ No渝科发计字(2004)27
号 ]
作者简介:王继生(1974-),男 , 博士 ,副主任药师 ,研究方向:新药
开发的药理学及蛋白质组学, E-mail:wjs327@sina.com;
邱宗荫(1941-),男 , 教授 ,博士生导师 , 研究方向:新药
开发的药理学及蛋白质组学
中国图书分类号:R-332;R284.1;R329.25;R341;R394.3;
R743.31
文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2009)02-0201-04
摘要:目的　采用蛋白质组学技术研究茅莓总皂苷对脑缺
血 /再灌注大鼠脑组织差异蛋白的影响 , 进一步揭示茅莓总
皂苷的脑保护作用及抗损伤修复机制。方法　建立脑缺血 /
再灌注大鼠动物模型 , 分别提取蛋白质后进行 2-DE电泳分
离 , 应用相关软件比较分析 ,找出差异蛋白 ,酶切消化后进行
肽指纹图谱分析 , 通过数据检索 ,初步鉴定差异蛋白质。结
果　与模型组比较 , 茅莓总皂苷组找到 29个差异点 , 其中
18个蛋白点表达上调 , 11个蛋白点表达下调 , 鉴定了其中 7
个蛋白。结论　茅莓总皂苷对脑保护作用及抗损伤修复机
制的机制是多个蛋白质共同参与的结果。
关键词:茅莓总皂苷;脑缺血 /再灌注;比较蛋白质组
　　茅莓总皂苷(totalsaponinsofRubusParviflolius
L, TSRP)对脑缺血 /再灌注大鼠有很好保护作用 ,它
能改善行为学症状 、减少脑梗死体积 ,降低脑含水
量 ,降低血脑屏障通透性 ,不同程度提高脑缺血 /再
灌注损伤时脑组织中的 SOD, GSH-Px活性 ,降低脑
组织的 MDA含量 。减低缺血周边区凋亡细胞的数
目 。促使抗凋亡基因 Bcl-2的表达上调 ,促使凋亡
基因 Bax表达下调 [ 1, 2] 。降低 EEA含量 ,降低细胞
内钙离子浓度[ 3] ,其抗脑缺血的机制可能与抗氧化
和抗凋亡有关 ,具体作用机制不清楚 ,需要更深入的
研究。由于疾病的发生和发展 、药物的作用大多是
在蛋白质水平上进行 ,因此蛋白质组学的研究克服
了蛋白质表达和基因之间的非线性关系。蛋白质组
学技术的发展为茅莓总皂苷作用靶点及作用模式的
发现提供了可能性。本实验采用比较蛋白质组学策
略 ,希望从蛋白质层面发现 TSRP作用的可能作用
靶点。
1　材料与方法
1.1　实验设备　2K15低温离心机 SigmaCo.Ger-
man;UV-1601型紫外分光光度仪 Shimadzu(岛津)
Japan;pHS-2型酸度计(精度 pH0.02)上海第二分
析仪器厂;VoyagerDEPro基质辅助激光解吸离子
化 -飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)美国 ABI公
司;VIRTIS型冷冻干燥机为 VIRTIS公司产品 。
1.2　主要试剂　乙腈(ACN)为 Fisher公司产品;三
氟醋酸(TFA)为 Fluka公司产品;测序级胰蛋白酶
为 Promega公司产品;质谱外标混合液 Mixture2[包
括以下片段:AngiotensinI1297.51;ACTH(1-17)
2094.46;ACTH(18-39)2466.72;ACTH(7-38)
3660.19;insulin5734.59 (+1), 2867.80(+2)] ;
α-氰基 -4-羟基肉桂酸为 Sigma公司产品 。
1.3　方法
1.3.1　实验动物 　成年健康 ♂ Wistar大鼠 ,体重
250 ～ 300 g,由第三军医大学大坪医院实验动物中
心提供。合格证号:SCXK(渝)2001003,清洁级 。
1.3.2　大鼠大脑中动脉局灶脑缺血 /再灌注模型制
备[ 4] 　将大鼠用 3.5%水合氯醛 10 ml· kg-1腹腔
注射麻醉 ,仰位固定后手术。颈正中切口 , 长约 3
cm,打开颈动脉鞘 ,暴露右侧颈总动脉(CCA)、颈内
动脉(ICA)、颈外动脉(ECA);由 CCA分叉处向头
端依次游离 ,电凝 ECA所有分支 ,在甲状腺上动脉
远端结扎 、切断 ECA,使其主干游离备用;用蛙心夹
暂时夹闭 CCA和 ICA,用剪刀在 ECA残端作一环形
切口 ,将预先制备好的头端涂有聚氨酯的 0.26 mm
尼龙线插入 ICA(涂有肝素),移去蛙心夹将线栓缓
慢沿 ICA入颅方向推进 ,推进约 1.7 ～ 2.0 cm时感
到阻力 ,表明线栓已经通过大脑中动脉的起始部;松
开夹闭 CCA的蛙心夹 ,清理术野 ,关闭切口;大脑中
动脉阻塞 2 h后轻轻拔出线栓 ,实现再灌注。假手
术组除不插线外 ,其余步骤同上 ,再灌注 24h。
1.3.3　实验分组及给药方法　Wistar大鼠♂12只 ,
实验动物随机分为 2组 ,每组 6只 。缺血组 ,缺血 +
TSRP20 mg·kg-1组 ,各给药组均于 MACO前 3天
灌胃给药 ,每天 1次 。于 d3手术前 1 h给药 ,缺血
组灌等量的生理盐水。
1.3.4　取材 　在脑缺血 2 h再灌注 24 h点用
3.5%水合氯醛麻醉大鼠后 ,断头取脑 ,冰盘中取缺
·201·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2009 Feb;25(2):201 ～ 4
血侧脑组织 ,称重 ,液氮冻存。
1.4　蛋白质含量测定 、向电泳分离 、凝胶染色 、图像
分析　采用 Bradford法进行蛋白质定量 。双相电泳
主要参考 BIO-RADPROTEANIEFcel型等电聚焦
仪操作指南进行 。电泳结束后 ,在固定液中固定 2
～ 4h,考马斯亮蓝 R-250染色染色 3 ～ 4 h,然后脱
色 5 ～ 6 h直至凝胶背景变为白色 。AmershamIm-
ageMasterVDS-CL型凝胶成像系统对考马斯亮蓝 R-
250染色的 2-DE胶进行扫描 , ImageMaster2D
V2002.1图像分析软件产生光密度图像 (makeOD
image),随后进行蛋白斑点检测 ,凝胶匹配 , 根据
NormalisedVolume值的变化来判断蛋白斑点表达量
的变化 ,选取部分差异表达候选蛋白作 MALDI-TOF
质谱分析。
1.5　蛋白质鉴定方法　采用肽指纹图谱法(pepti-
dentmasfingerprinting, PMF),蛋白质从二维电泳凝
胶上切下 ,经胰蛋白酶胶内酶解 ,质谱分析得到肽指
纹图谱 ,然后在互联网上进行肽指纹图谱的比对鉴
定 。
1.5.1　蛋白质的胶内酶解　从 2-DE凝胶上切下
蛋白斑点 ,装入 200 μlEP管 , 水洗 3次。用 50%
ACN25 mmol· L-1碳酸氢铵 400 μl脱色 15 min。
反复 3次 ,直至颜色脱尽 。胶块浸入 100% ACN中
5 min,脱水 ,胶块变白 , 室温抽干。加 10 ～ 15 μl
Trypsin酶液覆盖胶块 , 4℃放置 60 min, 37℃过夜
12 ～ 15 h。吸出反应液 ,加入 50%ACN5% TFA混
合液 30 ～ 50μl,轻微振荡萃取 30 ～ 60 min,共 2次 。
萃取液抽干约 1h,加入 3μl50% ACN/5% TFA混
合液溶解。进行质谱分析 。
1.5.2　MALDI-TOF-MS　制备好的样品用美国 ABI
公司的 VoyagerDE-PROMALDI-TOF质谱仪分析 。
外标采用混合的 Mixture2标准液进行相邻校正 ,内
标采用胰蛋白酶的自切峰 (MH+:2211.10 Da或
2283.18或 2299.18和 842.51 Da)进行两点或单点
校正。
1.5.3　数据库搜索　选择 ProteinProspector检索软
件 ,在 MS-Fit界面进行检索 , 检索参数为:database
(SWISS-PROT); species: (RATTUSNORVEGI-
CUST);enzyme(Trypsin);peptidevalues(MH+ ,
monoisotopic);PeptideMasstolerance(<2);Pep-
tideChargeState(1+);MaxMissedCleavages(0 ～
1);Possiblemodificationsmode(Carbamidomethyl,
C)。数据库查询后 ,每个查询得到 1个分值。
2　结果
　　电泳图谱经过图像分析 ,脑缺血 /再灌注(cere-
bralischemicreperfusion, CIR)模型组分辨出约 755
个蛋白质斑点;TSRP20 mg· kg-1组分辨出约 762
个蛋白质斑点;CIR模型组与 TSRP20 mg· kg-1组
的匹配率为 72%。
　　根据差异结果分析 ,仅在一种样品出现的蛋白
质斑点为特异表达蛋白质 ,两种样品以 CIR模型组
为对照 ,根据 NormalisedVolume值的变化来判断蛋
白斑点表达量的变化 ,从 TSRP20mg· kg-1组筛选
到 29个差异表达蛋白斑点 ,其中 11个表达下调 , 18
个表达上调(Fig1);鉴定其中 7个蛋白质 ,其中 5
个表达上调 ,它们是潜在的转移生长因子 β结合蛋
白 2前体 (latenttransforminggrowthfactorbeta-bind-
ingprotein2 precursor, LTBβ-2);小泡 SNAP受体蛋
白(vesicletransportthroughinteractionwitht-SNARZS
homolog1A);同源异型蛋白 1R5片段 (homeobox
proteinHox-1.1R5 fragment);蛋白磷酸化抑制剂 1
(ProteinphosphateinhibitorIPP-1);低密度脂蛋白受
体相关蛋白 4前体蛋白 (low-densitylipoproteinre-
ceptor-retatedprotein4 precuysor)。 2个表达下调 ,
它们白介素 15前体蛋白(interleukin-15 precursor,
IL-15);肿瘤坏死因子 α(tumornecrosisfactorpre-
cursor, TNF-α)。
Fig1　Coomassieblue-stained2-DEimageofischemic2h
reperfusion24hischemiccerebraltissueproteinsinrats.
　　IPGgelpH 3-10L17cm.A:Modelgroup;B:TSRP20 mg· kg-1
group.△expression-alteredspots
3　讨论
　　被鉴定的 7个蛋白质 , 与缺血模型组相比 ,
TNF-α、IL-15 2个蛋白质表达下调 , V-SNARE、LT-
GF-2等 5个蛋白质表达上调。
　　在表达下调的蛋白质中 , TNF-α是相对分子质
量为 17×103的多肽 ,人与小鼠的 TNF-α有 80%的
同源性 , TNF-α与受体结合才能发挥生物学效应。
TNF-α是具有多效性作用的促炎性细胞因子 ,被认
为是炎症反应主要的致炎因子 ,在众多细胞因子的
释放顺序中处于源头位置 ,参与了脑缺血后炎症与
·202· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBulletin　2009 Feb;25(2)
细胞死亡的过程 ,其过度表达恶化和扩大了脑梗死
体积 ,加剧了脑损伤 [ 5] 。TNF-α在炎症反应过程中
激活细胞因子级联反应 ,诱导白介素和次级炎症介
质的合成 (花生四烯酸 、氧自由基 、脂质过氧化物
等),引起过度的组织炎症反应和损伤。经过 TSRP
干预后 , TNF-α表达下调 ,从而减轻缺血脑组织的损
伤 。
　　白细胞介素 -15 (interleukin15, IL-15)可由多
种细胞产生 。IL-15是属于第一型细胞素的淋巴细
胞生长因子 。IL-15受体由 α、β 、γ3个蛋白链组成 。
其中 γ链由 IL-2、IL-4、IL-7及 IL-9的受体共同使
用 , β链与 IL-2R共用 ,而 α链为 IL-15R所特有 。
由于 IL-15及 IL-2受体共用 βγ链 ,导致它们某些功
能相同;但缺乏 IL-15Rα或 IL-15的小鼠却与缺乏
IL-2Rα或 IL-2的小鼠有完全不同的表现型(pheno-
type)。因此 IL-15白介素系统有其独特的功能 [ 6] 。
有研究报告指出 ,在急性胰腺炎患者血清中 , IL-15
与可溶性肿瘤坏死因子受体 -1(sTNF-1R)的水平呈
正相关 [ 7] 。IL-15在脑缺血方面作用未见相关文献
报道 ,它在 TSRP干预后的下调机制有待于进一步
研究。
　　在表达上调的蛋白质中 , V-SNARE是与翻译后
蛋白质运输有关的因子 ,称为小泡 SNAP受体 。它
在小泡萌发时就掺入小泡 , 通过在靶上与特异的
SNAP受体(t-SNAREVs)的相互作用 , 促进 N-乙酰
马来酰亚胺敏感因子(NSF)与可溶性 NSF连接蛋
白(SNAP)的结合 ,实现与靶膜的融合 [ 8] 。这些相
互作用被认为用于调节囊泡转运的特异性和促进脂
质双分子的融合 。在神经末梢突触囊泡的重回收过
程中 ,可能需要其参与促进融合[ 9] 。 V-SNARE表达
上调 ,可能是改善了受损神经细胞的蛋白质转运情
况 ,有助于脑损伤的恢复。
　　潜在的转移生长因子 β结合蛋白 2前体蛋白
(LTGF-2)主要表达于星形胶质细胞和胶质瘤细胞 ,
它在 TGF-β活化中扮演关键角色。 TGF-β1通过增
加 bcl-2产物 、降低 Ca2+浓度而保护神经细胞免遭
谷氨酸能细胞毒性作用及氧化反应 ,可以上调衍生
的神经营养因子以及诱导神经元 TGF-β 1的自身合
成 ,使缺血半影区的神经元得以较长存活 ,以促进组
织修复 [ 10, 11] 。本研究中 ,经过 TSRP干预后 , LTGF-2
表达上调 ,有可能导致 TGF-β活化 ,从而减轻缺血
脑组织的损伤。
　　低密度脂蛋白受体相关蛋白 4前体是细胞表面
的潜在的胞吞作用的受体 ,与嵌在胞外的配体结合
有利于溶酶体降解作用 。而低密度脂蛋白 LDL是
oX-LDL的底物 ,脑组织缺血时 ,黄嘌呤和黄嘌呤氧
化酶等生化反应系统可以产生大量氧自由基 ,氧自
由基攻击低密度脂蛋白中含有的不饱和脂肪酸 ,形
成不饱和脂肪酸自由基进而引发脂质过氧化的连锁
反应 ,导致 oX-LDL的形成增加 ,增高的 oX-LDL又
可进一步损伤血管内膜 , 加剧缺血性损害 [ 12] 。因
此 ,有效地阻止脂质过氧化 ,减少 oX-LDL的形成将
是防治缺血性脑血管病的重要环节。本研究中 ,经
过 TSRP干预后 ,低密度脂蛋白受体相关蛋白 4前
体表达上调 ,有可能导致低密度脂蛋白受体表达上
调 ,导致 LDL降低 ,减少形成 oX-LDL的底物 ,从而
减轻 LDL导致的缺血脑组织损伤。
　　Hox-1.1为序列特殊的转录因子 ,是一种发育
协调系统的一部分 ,这种系统在前后轴上给细胞提
供独特的位置定位 。它的上调可能有助于脑损伤的
恢复 [ 13] 。
　　IPP-1是磷酸蛋白阻断体 1,这个蛋白也许在糖
原的激素调控方面有重要作用 , 上调细胞内 CAMP
而激活 IPP-1活性的激素在很多组织内表达。可能
促进 cAMP对不能直接被 PKA磷酸化蛋白的调控;
当细胞内钙升高后 , IPP-1不会受 PP2b升高的影
响。不会阻滞 2型磷酸化酶 [ 14] 。它的上调可能有
助于脑损伤的恢复 。
　　茅莓总皂苷对脑缺血 /再灌注的保护作用是多
个蛋白质共同参与的结果 ,这些蛋白质之间的相互
关系有待进一步研究。
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Studyoncomparedproteomicsoffocalcerebralischemia-reperfusion
inratswiththetotalsaponinsofRubusParvifloliusL
WANGJi-sheng1 , QIUZong-yin2 , XIAYong-peng2 , LIHui-zhi2
(1.TheThirdHospitalofMianyang, MianyangSichuan　621000;
2.DeptofPharmacy, ChongqingUniversityofMedicalScience, Chongqing　400016)
Abstract:Aim　Toscreenalterationinproteinlevelin
braintissuebetweenmiddlecererbralarteryocclusion
(MCAO)andthetotalsaponinsofRubusParviflolius
L(TSRP)treatedratsandtolearnthemechanismof
nerve-protectingefectsofTSRPafterfocalcerebralis-
chemia-reperfusion.Methods　TheMCAO2 hreper-
fusionof24hmodelwasestablishedinrats, 2-DEwas
appliedtoprepareinstep1 fortheseparationofpro-
tein, andimaginganalysisofgelswasdonewithIm-
age-Master2D software.Diferentproteinspotsex-
pressingbetweencerebralischemicreperfusion(CIR)
modelandTSRPgroupwerecutfromthegelsforthe
MSanalysis, Diferentproteinspotsexpressingbetween
cerebralischemictissueadministeredwithorwithout
TSRPwerealsocutfromthegelsfortheMSanalysis.
MALDI-TOF-MSanddatabasesearch:proteinspots
fromstep2weresubjecttoin-geldigestionandMAL-
DI-TOF-MSanalysis, whichresultedinthepeptide
massfingerprintspectra(PMF).PMFweresearcha-
gainstswiss-protdatabaseusingsearchprogramofMs-
Fit.Results　Bycomparativeproteomeanalysis, 29
expression-alteredspotswereexcisedforMSandinfor-
maticsanalysis, comparingtotheCIRmodel, 18 pro-
teinsup-regulatedintheTSRPgroup, 11 proteins
down-regulated, 7 spotsofthem wereidentifiedand
characterized.Conclusion　Theprotectiveefectof
TSRPoncerebralischemia-reperfusionistheresultof
theparticipationofanumberofproteins.
Keywords:thetotalsaponinsofrubusparvifloliusL;
cerebralischemia-reperfusion;comparativeproteome
◎消　　息◎
《中国药理学通报》入选美国《化学文摘 2007年引文频次最高的 1 000种期刊表 》
　　本刊讯:美国 《化学文摘》ChemicalAbstractsServiceSourceIndexQuarterlySupplmentIntroductionNo.4,
2007, Listof1 000JournalsmostfrequentlyreferencedinChemicalAbstracts。 2007年共收录中国(含港台)期刊
197(2006年为 147)种 ,增加 50种。 《中国药理学通报》连续 11年入选 ,位列第 546位。
·204· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBulletin　2009 Feb;25(2)