全 文 ：[ 基金项目] 重庆市重大专项资助课题[ 渝科发计字(2004)27号] 　[ 作者简介] 王继生 ,男 ,博士 ,主管药师 ,电话:13730702209 , E-mail:w js327
@sina.com　[ 通讯作者] 邱宗荫 ,男 , 教授 ,电话:023-68485272 , E-m ail:zongyin@sohu.com
茅莓总皂苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠兴奋性氨基酸含量的影响
王继生1 ,邱宗荫2 ,李惠芝2 , 周成林2 　(1.绵阳市第三人民医院 , 四川 绵阳 621000;2.重庆医科大学药学院 , 重庆
621000)
[ 摘要] 　目的:研究茅莓总皂苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠兴奋性氨基酸(EAA)含量的影响。 方法:将大鼠随机分为茅莓总
皂苷 5 , 10 , 20 mg·kg-1组及尼莫地平 10 mg·kg-1组 、模型组和假手术组。灌胃给药 3 d ,采用线栓法制备大鼠大脑中动脉缺
血再灌注模型 ,相应时间断头取脑。采用高效液相法测定大鼠脑组织中天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)的含量。结果:缺血对
照组天冬氨酸 、谷氨酸含量明显高于治疗组。结论:茅莓总皂苷对脑缺血再灌注损伤有保护作用。其可能的机制为:干扰脑
缺血再灌注损伤中 EAA 代谢而发挥脑保护作用。
[ 关键词] 　茅莓总皂苷;兴奋性氨基酸;脑缺血再灌注
[中图分类号] R285.5　　[ 文献标识码] A　　[文章编号] 1001-5213(2007)08-1029-03
Effect of total saponins of Rubus parvif lolius (TSRP)on the contents EAA of brain tissue in
rats during cerebral ischemia-reperfusion
WANG Ji-sheng1 , Q IU Zong-yin2 , LI Hui-zhi2 , ZHOU Cheng-lin2(1.The Third H ospital of M ianyang , Shich-
uang M ianyang 621000 , China;2.Depma rtment of pharmacy , Chongqing Unive rsity of Medical Science , Chongqing 400016 ,
China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To study the effects of total saponins o f Rubus Parvi f lolius (TSRP)on the contents o f a spar tic
acid(Asp), g lutamic acid(Glu)in brain tissue of male rats during the process of cerebral ischemia and reperfusion.METHODS
　Male adult Wistar rats w ere used to establish ischemic repe rfusion rat model acco rding to the MCAO me thod.Bo th sham and
model g roup were giv en no rmal saline , other were administe red with TSRP and Nim respective ly.The animals were killed to
the deadline of the schedule.the contents o f A sp , Glu of brain tissue was detected by HPLC respectiv ely.RESULTS　The level
of G lu and Asp were significantly highe r in the ischemic g roup compared to TSRP trea ted gr oup.CONCLUSION　TS RP exer ts
neuroprotectiv e effects w hen administe red after cerebral ischemic reperfusion in male rats.The possible pro tective mechanism is
tha t TSRP can mediate the level o f excitatory amino acid(EAA).
KEY WORDS:TSRP;cerebral ischemia/ reperfusion;excita tory amino acid
　　茅莓为蔷薇科植物茅莓(Rubus parvi f lolius
L.)的茎叶 ,以往用于治疗吐血 、跌打刀伤 、产后淤
滞腹痛 、痢疾 、痔疮 、疥疮等[ 1] ,民间还用其根治疗女
性月经过多症[ 2] 。已有研究表明 ,茅莓提取物对脑
缺血有很好的保护作用[ 3] 。本实验对茅莓水提物抗
脑缺血的有效部位进行筛选 ,发现茅莓水提物抗脑
缺血的有效部位为茅莓总皂苷(TSRP)。其抗脑缺
血的机制可能与抗氧化和抗凋亡有关[ 4] 。谷氨酸等
氨基酸的兴奋毒作用已公认在脑缺血急性期的细胞
死亡以及在灌注后神经元损害和迟发性神经元死亡
中起主要作用。目前认为它们可能经凋亡途径启动
细胞死亡过程 ,兴奋性氨基酸的浓度可能决定了神
经元死亡的类型 、程度和进程[ 5] 。因此 ,研究 TSRP
对氨基酸递质的影响具有重要意义 。本实验采用高
效液相色谱(HPLC)法研究局灶脑缺血再灌注损伤
过程中 TSRP 对 Glu和 Asp含量变化的影响 ,进一
步阐明 TSRP 对缺血神经元作用的分子机制。
1　材料
Agilent 1100系列高效液相色谱仪(美国 Agi-
lent公司);色谱柱:依利特 hypersil BDS C18柱(4.6
mm ×200 mm ,5 μm);天冬氨酸对照品(Asp ,纯度
为99.9%,上海化学试剂采购供应分装厂进口 ,批号
20031205);谷氨酸对照品(Glu , 纯度为99.9%,上
海康达氨基酸厂 ,批号 20030801);2 , 4-二硝基氟苯
为分析纯 ,甲醇 、乙腈为色谱纯 ,水为纯化水 。
成年健康♂Wistar 大鼠(体质量 250 ～ 300 g ,
第三军医大学大坪医院实验动物中心 ,合格证号:
SCXK(渝)2001003 ,清洁级)。
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2　方法
2.1　大鼠局灶脑缺血/再灌注模型制备
2.1.1　分组及给药方法　Wista r大鼠♂108只 ,动
物随机分为 6 组:缺血组 、假手术组 、缺血 +
TSRP5 ,10 ,20 mg·kg -1组及尼莫地平(Nim )10 mg
·kg-1组 ,各给药组均于 MACO前 3 d灌胃给药 ,每
天 1次。于第 3天手术前 1 h给药 ,缺血组灌等量
的生理盐水 ,假手术组不插入尼龙线 ,其余操作相
同。
2.1.2　模型制备　成年健康 ♂Wistar 大鼠 ,体质
量 250 ～ 300 g ,适应性喂养 1 周后用于模型制备 。
根据 Longa 等[ 5]报道的方法 ,规范化制备线栓法右
侧大脑中动脉局灶脑缺血/再灌注模型 。
2.1.3　取材　在脑缺血 2 h再灌注 1 ,6 , 24 h 时间
点用3.5%水合氯醛麻醉大鼠后 ,断头取脑 ,冰盘中
取缺血区脑组织 ,称定 ,液氮冻存。
2.2　测定方法
2.2.1　色谱条件　柱温:30 ℃;检测波长:360 nm;
流速:1 mL·min-1 ;进样量 ,20 μL;流动相梯度:A:
0.05 mo l·L-1醋酸钠缓冲液 , B:乙腈-水(1∶1);0
min , 16%B;10 min ,45%B;25 min ,85%B。
2.2.2　流动相的配制　醋酸钠缓冲液的配制:称取
4.101 5 g 醋酸钠 ,溶解于1 000 mL 的水溶液中 ,使
制成质量浓度为0.05 mo l·L-1醋酸钠溶液 ,用冰醋
酸调 pH 5.6。
2.2.3　标准品储备液的配制　精密称取 Glu , Asp
对照品各 10 mg ,分别置于 10 mL量瓶中 ,用甲醇溶
解并稀释至刻度 ,使配成 1 g·L-1的储备液 ,每次使
用后置 4 ℃冰箱保存 。
2.2.4　供试品溶液的制备　将液氮冻存的标本 ,加
入甲醇(每 200 mg 脑组织加 1 mL 甲醇)匀浆 , 4 ℃
离心(10 000×g ,15 min),收集上清液。
2.2.5　氨基酸测定方法　采用柱前衍生化高效液
相色谱紫外检测法测定 ,衍生剂 2 , 4-二硝基氟苯 。
取脑组织匀浆液 200 μL ,加入 200 μL 乙腈混匀 ,离
心除蛋白(5 min , 10 000×g),取上清液 +200 μL
0.5 mo l·L-1碳酸钠+20 μL 0.5% 2 , 4-二硝基氟
苯 ,混匀 ,暗中衍生 1 h(水浴 60 ℃),进样 20 μL 。
2.2.6　HPLC 定性定量测定　取各样品溶液 ,进样
20μL , UV 检测器检测 ,记录色谱图 ,根据保留时间
定性 ,根据峰面积采用外标法定量 。
2.2.7　统计学处理　采用 SPSS 10.0 统计分析软
件进行分析 ,单因素方差分析(ANOVA),两两比较
用 SNK检验。
3　结果
3.1　色谱行为及色谱图　按上述色谱条件 ,其分离
度好 , 能达到基线分离 , Asp 的保留时间为 t =
4.200 min ,G lu的保留时间为 t=7.766 min 。分离
情况见图 1 ,图 2。
图 1　对照品色谱图
Fig 1　Ch romatogram of Asp an d Glu
图 2　脑组织样品图
Fig 2　S eparated chromatog ram of Asp and Glu
3.2　标准品峰面积与浓度的线性关系　将 Asp和
Glu标准储备液甲醇稀释制成0.5 ,1 , 5 ,10 ,50 , 100 ,
200 μg·g-1系列标准液 ,分别取 1 mL ,加入 1 mL 正
常大鼠脑组织提取上清液(每 200 mg 脑组织加 1
mL 甲醇),混匀 。分别进样 20 μL 记录色谱图 ,以
总浓度 C减去正常脑组织中 Asp和 Glu 的浓度 C1
(μg·g-1)对峰面积 A进行线性回归 ,得 Asp 、Glu的
回归方程 ,分别为:Y =96.465X +13.7 , r=0.999 5
(n=9),红性范围为 5 ～ 1000 μg·g -1 ;Y =122.53X
-2.65 , r=0.999 6(n=9),红性范围为 5 ～ 1100 μg
·g -1 。
3.3　A sp和 Glu的加样回收率　A sp 的加样回收
率为99.5%, (RSD 为0.8%, n=6), Glu 加样回收
率为101.3%(RSD为1.5%,n=6)。
3.4　TSRP 对脑缺血再灌注大鼠 A sp 含量的影响
　由表 1可以看出 ,缺血 2 h再灌注 1 h后 ,与假手
术组对比 ,模型组脑组织 Glu 、Asp 含量均有显著上
升(P<0.05),再灌注 6 , 24 h 模型组 Asp含量与假
手术组比差异无显著性;缺血 2 h 再灌注 1 h 后模
型组对比 , TSRP 20 mg·kg-1 ,Nim 10 mg·kg-1组
均可降低脑组织 Asp含量(P <0.05), TSRP 5 , 10
mg·kg-1组再灌注 Asp水平虽然较假手术组明显
增加 ,但较缺血对照组明显减少 ,表现出一定的下降
趋势(P>0.05);缺血 2 h 再灌注 6 h 后模型组对
TSRP 20 mg·kg -1 ,Nim 10 mg·kg-1组均可降低脑
组织 Asp含量 , TSRP 5 , 10 mg·kg -1组再灌注 1 h
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Asp水平虽然较假手术组明显增加 ,但较缺血对照
组明显减少 ,表现出一定的下降趋势(P >0.05);缺
血 2 h再灌注 24 h后 , TSRP组 、模型组与假手术组
相比差异无显著性(P>0.05),结果见表 1。
表 1　TSRP对脑缺血再灌注大鼠 Asp 含量的影响( x±s , n
=6)
Tab 1　Effects o f TSRP content o f A sp in pe ri-ischemic re-
g ion I/ R in ra ts( x±s , n=6)
分组 剂量/mg·kg-1
Asp含量/μg·g -1
1 h 6 h 24 h
假手术组 — 399.2±63.9 402.3±58.7 398.3±55.0
模型组 — 754.6±41.8b 468.0±40.7a 405.1±64.3
茅莓总皂苷组 5 585.9±132.3a 436.2±90.6 375.3±75.2
10 574.2±120.5ca 432.6±70.4 386.6±100.3
20 566.2±89.8ca 427.0±57.0 381.6±48.4
尼莫地平组 10 549.0±117.8ca 430.1±98.2 368.8±111.1
注:与假手术组相比较 , aP <0.05;与假手术组相比较 , bP <0.01;与
模型组比较 , c P<0.05
3.5　TSRP 对脑缺血再灌注大鼠 Glu 含量的影响
　结果见表 2。由表 2可以看出 ,缺血 2 h再灌注 1
h后 ,与假手术组对比 ,模型组脑组织 Glu 、含量均
有显著上升(P <0.05),缺血 2 h 再灌注 6 h 、脑组
织G lu水平下降 ,24 h模型组组 Glu 含量与假手术
组比无差异;缺血 2 h 再灌注 1 , 6 h 后与模型组对
比 , TSRP 5 ,10 ,20 mg·kg-1 , Nim 10 mg·kg-1组均
可降低脑组织 G lu含量(P <0.05);缺血 2 h 再灌
注 24 h TSRP 组 、模型组与假手术组相比差异不明
显(P>0.05)。
表 2　TSRP对脑缺血再灌注大鼠 Glu 含量的影响( x±s , n
=6)
Tab 2　Effects o f TS RP on content o f G lu in peri-ischemic
region I/ R in rats( x±s , n=6)
分组 剂量/
mg·kg-1
Glu含量/μg·g-1
1 h 6 h 24 h
假手术组 — 654.2±98.7 648.5±97.5 639.4±103.2
模型组 — 1027.3±109.0c 760.5±92.4a 647.8±112.6
茅莓总皂苷组 5 925.2±65.8a 742.0±86.7ab 640.2±87.3
10 906.5±198.6a 680.1±112.1ab 628.9±92.3
20 886.2±107.5ba645.9±126.9ab 637.2±78.2
尼莫地平组 10 849.8±85.7ba 634.2±142.8ab 635.3±135.8
注:与假手术组相比较 , a P <0.05 , c P<0.01;与模型组比较 , bP <
0.05
4　讨论
本实验显示 , TSRP 对大鼠局灶性脑缺血脑组
织 EEA含量具有调节作用:(1)缺血 2 h再灌注 1 h
后 ,与假手术组对比 ,模型组脑组织 Glu 、A sp 含量
均有升高(P<0.05),再灌注 6 h 、脑组织 G lu 、Asp
较 1 h水平下降 ,24 h 模型组 Glu 、A sp含量与假手
术组比无差异 。说明 EAA 参与脑缺血后神经元的
病理变化过程 ,脑缺血后 , EAA 增高已为大量文献
证实 。(2)缺血 2 h 再灌注 1 h 后与模型组相比 ,
TSRP 10 ,20 mg·kg-1 , Nim 10 mg·kg -1组均可降
低脑组织A sp含量(P<0.05),TSRP 5 mg·kg -1组
缺血 2 h 再灌注 1 h Asp水平虽然较假手术组明显
增加 ,但较缺血对照组明显减少 ,表现出一定的下降
趋势(P >0.05)。其他时间点无明显差异。(3)缺
血 2 h再灌注 1 h 后与模型组相比 , TSRP 20 mg·
kg
-1 , Nim 10 mg·kg-1组均可降低脑组织 Glu 含
量 , TSRP 5 ,10 mg·kg-1组缺血 2 h再灌注 1 h Glu
水平虽然较假手术组明显增加 ,但较缺血对照组明
显减少 ,表现出一定的下降趋势(P>0.05)。缺血 2
h再灌注 6 h后模型组对 TSRP 各剂量组均可降低
脑组织 Glu含量(P<0.05)。缺血 2 h 再灌注 24 h
TSRP 各剂量组 、模型组与假手术组相比差异无显
著性(P>0.05)。以上结果提示 TSRP 能下调缺血
后脑组织 EAA 含量的升高 。对已升高的 EAA 含
量的下调作用 , 主要发生在模型早期。结果表明 ,
TSRP 可通过调节 EEA 含量 ,减弱 EAA 诱导的病
理级联反应 ,产生对脑缺血后神经细胞的保护作用。
其作用机制可能是通过增强神经细胞对 EAA 再摄
取或抑制神经细胞的瀑布性释放 ,减弱其对受体的
过度激活作用 ,阻止 EEA 从对脑细胞的毒性损害
而发挥神经元保护作用 。因此 ,我们认为 TSRP 对
大鼠局灶性脑缺血动物模型有神经元保护作用 ,而
其作用机制可能与影响了缺血脑组织中 EEA 含量
变化有关 。
参考文献:
[ 1] 　江苏新医学院.中药大辞典(下)[ M] .上海:上海科学技术出版
社 , 1986:2652.
[ 2] 　朱志华 ,张惠勤 ,袁永军.茅莓的药理研究[ J] .中国中药杂志 ,
1990 , 15(7):43-45.
[ 3] 　郑永玲 ,胡常林.茅莓提取物对局灶性脑缺血的实验研究[ J] .
中医药研究, 2002 , 18(2):37-39.
[ 4] 　王继生 ,邱宗荫 ,夏永鹏 ,等.茅莓总皂苷对大鼠局灶性脑缺血
的保护作用[ J] .中国中药杂志, 2006 , 32(2):141-143.
[ 5] 　Phil lis JW , ORegan MH .The role of phosph olipases , cy-
clooxygenases , and lipoxy genases in cereb ral i sch emic/ t rau-
matic inju ries[ J] .C ri t-Rev-Neu robiol , 2003 , 15(1):61-90.
[收稿日期] 2006-08-17
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