全 文 ：Mycosystema
菌 物 学 报 15 September 2010, 29(5): 707-712

jwxt@im.ac.cn
ISSN1672-6472 CN11-5180Q
©2010 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.






基金项目：国家自然科学基金（No. 30871769）
*Corresponding author. E-mail: mrcfafu@163.com
收稿日期: 2010-04-19, 接受日期: 2010-05-17

双孢蘑菇分解基质能力退化的 DDRT-PCR 分析
陈美元 1,2 王泽生 1 李洪荣 1 廖剑华 1 谢宝贵 2*
1福建省农业科学院食用菌研究所 福州 350014
2福建农林大学菌物研究中心 福州 350002



摘 要：对 4 种不同液体培养基培养的双孢蘑菇 Agaricus bisporus CGMCC No. 0214 及其分解基质能力退化菌株 0214-3、
0214-5 进行了 24 对引物组合的 mRNA 差异显示（DDRT-PCR）分析，结果发现 8 对引物组合扩增出可重复的差异，并克隆
了 9 条差异片段。序列分析结果显示 9 条差异片段代表了 5 个基因的差异，它们与不同生物的 ATP 结合盒式运输亚家族 A
某蛋白、碳水化合物酯酶家族 4 蛋白、几丁质脱乙酰基酶、乙酰木聚糖酯酶 II 及其他一些未知蛋白具有较高的同源性。本
研究结果为进一步进行双孢蘑菇分解基质能力退化的分子机理研究奠定了良好的基础。
关键词：食用菌，mRNA，差异 DNA 片段，克隆，多糖类基质

DDRT-PCR analysis of the substrate-decomposing capability of
degenerate strains of Agaricus bisporus
CHEN Mei-Yuan1, 2 WANG Ze-Sheng1 LI Hong-Rong1 LIAO Jian-Hua1 XIE Bao-Gui2*
1Institute of Edible Fungi, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350014, China
2Mycological Research Center of Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
Abstract: mRNA differential display reverse transcription-PCR (DDRT-PCR) analysis with 24 pairs of primers was used to analyze
mRNA differences between the wild type of Agaricus bisporus strain CGMCC No. 0214 and its substrate-decomposing ability
degeneration strains 0214-3 and 0214-5 cultured in 4 kinds of different liquid media. As a result, 8 pairs of primers showed
repeatable differences, and 9 special fragments were cloned. Sequencing analysis showed that 9 special fragments represented 5
different genes. These genes have high homologies with an ATP-binding cassette transporter subfamily A protein, carbohydrate
esterase family 4 protein, chitin deacetylase, acetyl xylan esterase II and some other hypothetical proteins of several kinds of
organisms. The results of this study provided a basis for further study of the molecular mechanism of substrate degradation ability
degeneration of A. bisporus.
Key words: edible fungus, mRNA, differential DNA fragment, cloning, polysaccharide substrate

DOI:10.13346/j.mycosystema.2010.05.022
708 Mycosystema
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双 孢 蘑 菇 Agaricus bisporus (J.E. Lange)
Imbach 杂交菌株 CGMCC No. 0214（中国普通微
生物菌种保藏中心保藏号，简称 0214，下同）是
本单位采用蘑菇同核不育单孢杂交技术和分子遗
传标记的手段选育成功的优良商业蘑菇菌株，表现
出高产、优质、耐热、适应性广的特点，已在国内
推广应用多年，产生了显著的经济效益与社会效益
（Wang 2005）。在该菌株供应生产的抽样检测中
我们偶然发现有 PDA 斜面母种在棉籽壳培养基中
走菌很弱，导致无法制作二级种和三级种，因此也
无法进行正常栽培。进一步检测发现它在 PDA 培
养基上生长良好，无异常现象，但在粪草培养基、
棉籽壳培养基和麦粒培养基上均无法正常生长，在
分解基质能力上发生了变异和退化现象。多年来变
异菌株已经无性繁殖（转管）数十代，但仍保持着
不能分解纤维素、淀粉等多糖类基质的退化性状，
说明该退化性状是稳定的。在前期研究中，我们对
正常与退化菌株进行了共同接种试验，排除了病毒
等微生物感染的因素，证明了该退化性状应是基因
变异引起的。我们又对正常与退化菌株的总 DNA
进行了 153 对引物组合的 SRAP 分析，结果未能发
现两类菌株 DNA 水平的差异，据此推测该退化变
异的范围较窄，有可能是少数甚至个别基因的突
变，因而在 DNA 水平上难以发现（陈美元等
2008），需要从基因表达产物 mRNA 或蛋白质上去
寻找差异。
mRNA 差异显示（mRNA differentially display）
技术由 Liang & Pardee（1992）创立，也称差异展
示反转录 PCR（DDRT-PCR）技术。它是将 mRNA
反转录技术与 PCR 技术相互结合发展起来的一种
RNA 指纹图谱技术，为 mRNA 的表达差异研究及
寻找和分离新基因开辟了捷径，已广泛应用于生物
技术各个领域，涉及基因诱导表达、杂种优势机理、
植物抗逆性、发育分子机理、基因克隆等方面的研
究（刘凯等 2009）。在食用菌研究中该技术也用
于香菇发育相关基因（蔡为明等 2009）及香菇在
低温胁迫下基因差异表达（冯志勇等 2006；米朔
甫等 2003）的研究。本研究应用该技术对双孢蘑
菇正常与退化菌株进行分析，以期发现二者在
mRNA 表达水平上的差异。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株：双孢蘑菇杂交菌株 CGMCC No. 0214
及其退化突变体菌株 0214-3（液氮保藏种变异）、
0214-5（草基保藏种变异）由福建省农业科学院食用
菌研究所种质资源与遗传育种研究室保藏并提供。
1.1.2 试剂：AMV mRNA 逆转录试剂盒、DNA 胶
纯化试剂盒、pGEM-T Easy PCR 产物克隆试剂盒及
质粒提取试剂盒购自 Promega 公司，PCR 扩增试剂
盒、TRIzol 及其他试剂均购自上海生工生物工程服
务有限公司。
1.1.3 引物：本研究所用的 DDRT-PCR 3 条锚定引
物及 8 条随机引物根据 GenHunter 公司设计的序列
（王吉村等 2001），由上海生工生物工程服务有
限公司合成，其序列见表 1。
表 1 DDRT-PCR 引物
Table 1 DDRT-PCR primers
锚定引物
Anchor primer
随机引物
Random primer
H-T11G: 5′-AAGCTTTTTTTTTTTG-3′
H-T11A: 5′-AAGCTTTTTTTTTTTA-3′
H-T11C: 5′-AAGCTTTTTTTTTTTC-3′

H-AP1: 5′-AAGCTTGATTGCC-3′
H-AP2: 5′-AAGCTTCGACTGT-3′
H-AP3 5′-AAGCTTTGCTCAG-3′
H-AP4: 5′-AAGCTTCTCAACG-3′
H-AP5: 5′-AAGCTTAGTAGGC-3′
H-AP6: 5′-AAGCTTGCACCAT-3′
H-AP7: 5′-AAGCTTAACGAGG-3′
H-AP8: 5′-AAGCTTTTACCGC-3′

1.2 方法
1.2.1 菌丝的培养：菌种接入设计配方不同的 4 种液
体培养基中，24℃培养 3 周。4 种培养基配方如下：
培养基 1 号：20%马铃薯浸汁，2%葡萄糖，pH
自然。
培养基 2 号：20%马铃薯浸汁，2%可溶性淀粉，
pH 自然。
培养基 3 号：20%发酵粪草浸汁，2%可溶性淀
粉，pH 自然。
培养基 4 号：20%发酵粪草浸汁，2%葡萄糖，
pH 自然。
1.2.2 总 RNA 的提取：用 TRIzol 一步法，按试剂
操作说明书进行。
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菌物学报
1.2.3 mRNA 逆转录：按照 Promega 公司 AMV
mRNA 逆转录试剂盒操作说明书进行，分别用 3 种
锚定引物代替试剂盒中的 Oligo(dT)引物。
1.2.4 DDRT-PCR 分析：根据王吉村等（2001）和蔡
为明等（2009）的方法并加以摸索改进。
PCR 反应体系：20μL 反应体系含：2μL 20×稀
释的逆转录产物，30ng 锚定引物，30ng 随机引物，
0.1mmol/L dNTPs，1.5mmol/L MgCl2，1U Taq DNA
聚合酶，1×PCR 缓冲液。PCR 扩增条件：94℃预变
性 2min；94℃变性 30s，40℃退火 30s，72℃延伸
1min，扩增 42 个循环，72℃延伸 5min。扩增产物
5μL 进行 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳。GeneFinder 荧
光染料染色并拍照。
1.2.5 差异片段的重新扩增：割取聚丙烯酰胺凝胶
中的差异条带，用 1mL 无菌水漂洗 2 遍，加 50μL TE
缓冲液，65℃保温 15min。取 2μL 作 PCR 模板，参
照上述 DDRT-PCR 反应体系及扩增条件，使用相应
的锚定引物和随机引物，并将退火温度提高到
50℃，进行差异片段的重新扩增。扩增后进行 1.5%
琼脂糖凝胶电泳和 GeneFinder 荧光染色拍照。
1.2.6 差异片段的纯化、克隆与鉴定：按陈美元
（2006）的方法进行。
1.2.7 克隆子测序与分析：克隆子质粒 DNA 送上海
生工生物工程技术服务有限公司进行测序。获得的
差异片段序列用 Blastx 进行序列比对分析。
2 结果与分析
2.1 双孢蘑菇 0214 及其退化菌株的总 RNA 提取及
检测
分别收集正常菌株 0214 及其退化菌株 0214-3、
0214-5 在 4 种培养基中的菌丝体，共 12 个样品。
用无菌纱布挤干水分，液氮研磨后，用 TRIzol 试剂
提取它们的总 RNA。经 OD230、OD260 和 OD280 初
步测定它们的浓度和纯度后，用 1%甲醛变性琼脂
糖凝胶进行电泳检测，结果发现它们均有清晰的
28S 和 18S 条带，基本无降解拖尾现象（图 1），质
量良好，可以用于 DDRT-PCR 分析。

图1 双孢蘑菇0214及其退化菌株总RNA的甲醛变性琼脂糖
凝胶电泳 M1: RNA Markers；1-12: RNA 样品（3 个菌株，4 种培养
基）；M2: LambdaDNA/EcoR I + Hind III Markers.
Fig. 1 Formaldehyde denatured agarose gel electrophoresis patterns of
total RNA of Agaricus bisporus 0214 and its degeneration strains. M1:
RNA Markers; 1-12: RNA samples (3 strains and 4 kinds of media); M2:
LambdaDNA/EcoR I + Hind III Markers.

图 2 双孢蘑菇 0214 及其退化菌株的 DDRT-PCR 图谱 第一道为 100bp DNA Ladders，其余每 3 道对应不同的培养基和引物对，3 道菌株为
0214、0214-3、0214-5.
Fig. 2 DDRT-PCR patterns of Agaricus bisporus 0214 and its degeneration strains. The first lane is 100bp DNA Ladders, the other every 3 lanes
correspond with different media and primer pairs, and the strains in 3 lanes are 0214, 0214-3 and 0214-5 respectively.
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2.2 双孢蘑菇0214及其退化菌株的DDRT-PCR分析
对上述提取的 12 个总 RNA 样品进行了 3 条锚
定引物和 8 条随机引物共 24 对引物组合的 mRNA
差异显示（DDRT-PCR）分析，对有差异的样品重
新提取总 RNA 进行重复 DDRT-PCR 扩增，结果发
现 8 对引物组合体现了可重复的差异（图 2），我们
选择了 9 条上调或下调差异表达明显的片段并编号
（图 2 箭头指示）。
2.3 差异条带的克隆、测序与同源性检索
割取上述差异条带，用相应的锚定引物和随机
引物进行差异片段的重新扩增（图 3），经琼脂糖凝
胶电泳检测后进行纯化，再克隆到 pGEM-T Easy 载
体中。9 条差异片段各取 2 个阳性克隆子质粒 DNA
进行测序，确定差异片段序列，并根据锚定引物、
随机引物、培养基和菌株等信息分别命名（表 2）。
经初步分析发现，差异片段 6 与 7 序列完全相
同，它们是锚定引物 H-T11C 和随机引物 H-AP8 分
别从培养基 3 号和 4 号样品中扩出的同一差异条
带。另外，差异片段 2、5、8、9 序列基本相同，
只是序列的长度有差别，分别为 146bp、125bp、
124bp、149bp，其中较小的片段序列基本包含于较
大的片段序列中。经对照 DDRT-PCR 图谱，发现
它们是锚定引物 H-T11A、H-T11C、H-T11G 分别与
随机引物 H-AP5 从培养基 4 号的样品中扩出的，随
机引物相同而锚定引物不同，从它们的序列上可以
断定为同一差异基因扩增出的不同长度片段。
获得的差异片段序列在 GenBank 上用 Blastx
软件在 nr 数据库中搜索同源性。除了差异片段序列
1、3、4、6(7)外，其余片段未能发现同源性数据。
其中差异片段 1 与小立碗藓 Physcomitrella patens
的 ATP 结合盒式运输亚家族 A 某蛋白具有一定的
同源性，差异片段 3 与双色蜡蘑 Laccaria bicolor 的
碳水化合物酯酶家族 4 蛋白、金针菇 Flammulina
velutipes 的几丁质脱乙酰基酶及草菇 Volvariella
volvacea 的乙酰木聚糖酯酶 II 均有较高的同源性，
而差异片段 4、6(7)则分别与灰拟鬼伞 Coprinopsis
cinerea 、 双 色 蜡 蘑 Laccaria bicolor 或
Moniliophthora perniciosa的某种未知蛋白或假想蛋
白具有较好的同源性。

图 3 差异片段重新扩增的琼脂糖凝胶电泳图谱 M：100bp
DNA Ladders；1-9：对应差异条带 1-9；10：空白对照.
Fig. 3 The agarose gel electrophoresis patterns of the differential
fragments reamplified. M: 100bp DNA Ladders; 1-9: Differential
fragments 1-9; 10: Blank control.
表 2 双孢蘑菇 0214 及其退化菌株 DDRT-PCR 差异片段信息
Table 2 Information of the DDRT-PCR differential fragments of Agaricus bisporus 0214 and its degeneration strains
差异片段编号
Special fragment No.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
差异片段命名
Special fragment name
A4-43 A5-45 A6-45 C4-41 C5-45 C8-31 C8-41 G5-433 G5-452
片段序列长度
Special fragment length
283bp 146bp 346bp 232bp 125bp 172bp 172bp 124bp 149bp
在退化菌株中的表达方式
Up or down regulation
上调
up
上调
up
上调
up
下调
down
上调
up
下调
down
下调
down
上调
up
上调
up
锚定引物
Anchor primer
T11A T11A T11A T11C T11C T11C T11C T11G T11G
随机引物
Random primer
AP4 AP5 AP6 AP4 AP5 AP8 AP8 AP5 AP5
对应培养基编号
Corresponding medium No.
4 4 4 4 4 3 4 4 4
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菌物学报
3 讨论
Liang & Pardee（1992）开始建立差异显示 PCR
技术时，设计的 3′端引物有 12 条引物，而 5′端有
20 条随机引物，引物组合多，工作量巨大，特异性
较差。经科学家们不断试验改进，引物的数量及扩
增特异性等得到合理的优化。目前 GenHunter 公司
销售的 DDRT-PCR 试剂盒将锚定引物和随机引物
分别减为 3 条和 8 条，碱基数分别为 18 个和 13 个，
同源性分析表明，所得的 24 个组合同样覆盖所有
mRNA，使操作和后续处理更加简便（王吉村等
2001）。
本研究克隆了 9 条 DDRT-PCR 差异片段，其中
6 与 7 序列完全相同，2、5、8、9 序列雷同，只是
长度有差别。从不同培养基样品、不同引物对组合
扩出同一差异基因片段，它们之间的相互验证从侧
面说明了这些差异存在的可靠性。9 条差异片段中，
有 8 条是从培养基 4 号的样品中扩增获得的，说明
该配方的培养基比较适用于此类分解基质能力退
化菌株的差异分析，从我们先前进行的这 3 个菌株
的同工酶差异分析中也验证了这一点，从另一个角
度说，研究此类分解基质能力退化菌株的 mRNA 或
蛋白质表达差异，适宜培养基的设计和摸索是非常
重要的。
9 条差异片段中，4、6、7（6 与 7 相同）在退
化菌株中是下调表达的，我们认为它们与菌株分解
基质能力退化的性状可能有较为密切的关系，但在
同源性搜索中它们只与几种未知蛋白或假想蛋白
具有较好的同源性，未能进一步明确它们所在基因
的身份。另外 6 条差异片段是上调表达的，其中差
异片段 3 分别与几种大型真菌的碳水化合物酯酶家
族 4 蛋白、几丁质脱乙酰基酶及乙酰木聚糖酯酶 II
等有较高的同源性，而这几种蛋白质都与多糖类基
质的代谢相关，我们推测退化菌株在一些分解多糖
类基质关键酶类功能降低或缺失后，有可能启动一
些其他相关蛋白质的表达，从而导致相关基因的上
调表达。其余上调表达的 2、5、8、9 差异片段代
表的是同一个差异基因，因此该差异是相当可靠
的，但可能因片段较短的原因，未能搜索到同源信
息。我们需要用 cDNA 末端快速扩增（RACE）技
术或筛选 cDNA文库等方法获取更多该基因的序列
信息作进一步的分析。
关于食用菌菌种退化现象、退化原因及预防和
复壮措施已有文献报道（刘新宇等 2001；陈美元
等 2003；刘海英等 2003；丁湖广等 2006），其
中也提到遗传变异是食用菌菌种退化的一个重要
原因，但多为可能原因的推测与分析，除陈美元等
（2003）对双孢蘑菇丛生变异退化现象的分子机理
作初步研究外，未见其他食用菌退化的分子机理研
究的文献报道。本研究对双孢蘑菇分解基质能力退
化现象的分子机理进行了初步的探索，获得了正常
与退化菌株 mRNA 表达上的一些差异。在下一步
的研究中，我们将用抑制性差减杂交（SSH）、蛋
白质双向电泳（2D-PAGE）等技术对两类菌株
mRNA 和蛋白质表达的差异作进一步分析，对相
关的差异片段作进一步验证，克隆重要差异基因并
研究其功能，以期阐明双孢蘑菇分解基质能力退化
的分子机理。
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