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菌物学报
jwxt@im.ac.cn 15 November 2015, 34(6): 1153‐1164
Http://journals.im.ac.cn Mycosystema ISSN1672‐6472 CN11‐5180/Q © 2015 IMCAS, all rights reserved.
研究论文 Research paper DOI: 10.13346/j.mycosystema.140188
基金项目：国家科技支撑计划课题（2013BAD16B02，2012BAD14B15‐04）；国家食用菌产业技术体系（CARS24）双孢蘑菇
遗传育种课题；福建省农科院科技创新团队项目（STIT‐1‐0309）
Supported by National Key Technologies R & D Program of China (2013BAD16B02, 2012BAD14B15‐04); China Agricultural
Research System (CARS24); S & T Innovation Team of Fujian Academy of Agricultural Sciences (STIT‐1‐0309).
*Corresponding author. E‐mail: ief.faas@189.cn
Received: 2014‐08‐14, accepted: 2014‐09‐29
双孢蘑菇子实体发育不同阶段蛋白质组分析
陈美元 廖剑华 李洪荣 蔡志欣 郭仲杰 王泽生*
福建省农业科学院食用菌研究所 福建 福州 350014
摘 要：为探讨双孢蘑菇子实体发育不同阶段的蛋白质表达变化，对双孢蘑菇 As2796菌株子实体原基期、幼菇期、采收
期、开伞期的蛋白质组进行了二维液相色谱串联质谱（iTRAQ‐MS/MS）分析，共获得不同肽段 5 869个，鉴定到 1 059个
蛋白质，其中 1 007个具有相对定量信息。与双孢蘑菇原基期相比，幼菇期、采收期和开伞期分别有差异蛋白质 242、200、
240个，分别占鉴定蛋白质总数的 24.0%，19.9%和 23.8%。对这些蛋白质及不同阶段之间的差异蛋白质进行了系列生物信
息学分析，对 8 个上、下调表达具有连续性的差异蛋白质相关基因进行了荧光定量 PCR 验证，其中 3 个蛋白质（错配碱
基识别蛋白、细胞色素 C1及某推定的未知蛋白质）基因的转录与蛋白质的表达具有较为一致的趋势。这些结果为后续双
孢蘑菇子实体发育相关基因的功能研究奠定了良好的基础。
关键词：食用菌，蛋白质组学，蛋白质鉴定，qPCR
Developmental proteomics analysis of the button mushroom Agaricus
bisporus
CHEN Mei‐Yuan LIAO Jian‐Hua LI Hong‐Rong CAI Zhi‐Xin GUO Zhong‐Jie WANG Ze‐Sheng*
The Institute of Edible Fungi, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou, Fujian 350014, China
Abstract: In order to reveal the protein expression changes that occur at the different developmental stages of the button
mushroom Agaricus bisporus fruiting body, the technique of iTRAQ‐MS/MS (i.e. isobaric tags for relative and absolute
quantification coupled two‐dimensional liquid chromatography tandem mass spectrometry) was used to analyze the fruiting
body proteomes of the primordium, button, harvest and opening stages of A. bisporus As2796 strain. As a result, 1 059 proteins,
included a total of 5 869 unique peptides, were identified. Among them, 1 007 proteins were detected with quantitative
information. As compared with the proteins of primordium stage, the samples of button, harvest and opening stages produced
242, 200, and 240 different proteins, respectively, accounting for 24.0%, 19.9% and 23.8% of the proteins identified, respectively.
Meanwhile, the differentially expressed proteins between different stages, as well as all of the identified proteins, were analyzed
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via bioinformatics. The genes of 8 proteins either up‐ or down‐expressed continuously at different developmental stages were
analyzed by real‐time PCR (qPCR), and 3 of them, i.e., mismatched base pair and cruciform DNA recognition protein, Cytochrome C1
and a hypothetical protein, were confirmed to have similar expression trends with the corresponding proteins. The data of this
study provided a basis for future functional research of the genes involved in fruiting body development in A. bisporus.
Key words: edible fungus, proteomics, protein identification, qPCR
和大多数食用菌一样，双孢蘑菇 Agaricus
bisporus (J.E.Lange) Imbach产量构成主要取决于其
子实体发生的数量、适宜采收时达到的个体重量、
生长周期等因素。除了栽培条件等外界因素的影
响，双孢蘑菇菌株自身的遗传特性对其产量的构成
至关重要。因此，研究双孢蘑菇子实体发育不同阶
段的差异蛋白质组学，了解相关基因及其表达变化，
探讨双孢蘑菇子实体发生、发育、成熟的机理，以
期通过调控相关位点或蛋白质的表达，来提高双孢
蘑菇的产量或质量、延长双孢蘑菇货架寿命，具有
理论与应用价值。此外，双孢蘑菇基因组计划
（AGP）已于 2010 年完成，已注释的双孢蘑菇基
因数目超过 10 000个（Morin et al. 2012；Kerrigan
et al. 2013），但大多数的基因功能仍未明确。因
此，重要农艺性状及生命活动过程相关的基因与蛋
白质功能的研究将成为双孢蘑菇今后研究的重点
和热点之一（王泽生等 2012）。
同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）标记技
术是新开发的一种蛋白质组学定量技术，具有很好
的精确性和重复性，是目前在比较蛋白质组学上应
用效果较好的标记技术之一（Wu et al. 2006）。与
双向电泳相比，通过 iTRAQ标记结合二维液相色谱
串联质谱技术（iTRAQ‐MS/MS）鉴定到的蛋白质具
有更广的分子量、等电点和疏水性范围，也有较高
的灵敏度，只是设备和试剂费用较高。目前
iTRAQ‐MS/MS 技术已成功地应用于多种原核和真
核生物样品特别是医学样品的蛋白质组鉴定和定
量研究（Hardt et al. 2005；Desouza et al. 2005；Ge
et al. 2011；Jin et al. 2011），在食用菌研究中，刘
靖宇等（2012a，2012b，2014）首先应用该技术
对草菇同核与异核菌丝及不同生长发育阶段的差
异蛋白质组进行了研究。
我们在前期双孢蘑菇子实体发育不同阶段
2‐DE分析的基础上，拟应用 iTRAQ‐MS/MS技术，
研究双孢蘑菇子实体发育不同阶段的差异蛋白质
组学，进行相关的生物信息学分析及重要差异蛋白
质的荧光定量 PCR（qPCR）验证。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株：双孢蘑菇杂交菌株 As2796 由福
建省农业科学院食用菌研究所种质资源与遗传育
种研究室保藏并提供。
1.1.2 试剂：iTRAQ试剂盒为 Applied Biosystem公
司产品，真菌总 RNA提取试剂盒 Fungal Total RNA
Extraction Kit为 OMEGA公司产品，逆转录试剂盒
GoScript™ Reverse Transcription System、qPCR试剂
盒 GoTaq® qPCR Master Mix购自上海 Promega公
司，Bradford蛋白质定量试剂盒及其他试剂均购自
上海生工生物工程服务有限公司。
1.2 方法
1.2.1 子实体的取样：As2796菌株进行常规栽培管
理。双孢蘑菇子实体发育可人为分为原基期、菇蕾
期、幼菇期、小菇期、采收期、成熟期、开伞期等
7个阶段（图 1）。为增加差异的显著性，本研究中
子实体发育的采样时期选取图 1 中画圈的 4 个阶
段，即原基期（米粒大）、幼菇期（菌盖直径 1cm）、
采收期（菌盖直径 3–5cm，菌膜未破裂）、开伞期
（菌盖直径 8–10cm，菌盖展开）。将刚采下的子实
体样品去除根部及污物，原基期和幼菇期取整粒，
采收期和开伞期用无菌刀片取其纵切片，使样品包
含菌盖、菌褶和菌柄组织。
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1.2.2 蛋白质的提取：将样品用多层无菌滤纸挤去
水分，迅速加液氮研磨成粉末，再按菌丝体蛋白质
的提取方法进行（陈美元等 2011）。
1.2.3 蛋白质的定量：使用改良的 Bradford 法，
按生工公司改良的 Bradford 蛋白质定量试剂盒说
明书进行。
1.2.4 iTRAQ‐MS/MS分析：基本按刘靖宇等（2012a，
2012b）的方法进行。采用 iTRAQ标记中 4个同重
同位素标记分别对双孢蘑菇 4 个不同生长发育阶
段的酶解肽段样品进行标记，并结合二维液相色谱
串联质谱技术对不同生长发育时期的蛋白质组进
行分级、分离。Q Exactive 质谱数据原始文件用
Proteomics Tools分析软件抽提肽段报告离子峰定
量信息，并以原基期样品（113）为内参对信号强
度进行归一化分析处理，采用软件计算的各肽段比
值的加权平均值作为蛋白质定量结果。同样采用
MASCOT 软件搜索 uniprot_Agaricales.fasta 数据
库并结合反转序列库鉴定多肽分子。将定量及鉴定
结果进行合并处理，以原基期为内参，通过控制 2
倍上下调筛选差异蛋白质。
1.2.5 蛋白质组生物信息学分析：鉴定的蛋白质采
用 MATLAB软件的 Princomp 函数进行主成分分析
（principal component analysis，PCA），采用 Cluster 3.0
进行分层聚类（hierarchy clustering，HC）分析，并通
过 Java Treeview实现可视化，从不同的角度对所有
鉴定蛋白质数据进行评价，对它们的理化性质进行统
计分析。来自 UNIPROT（http://www.uniprot.org）网
站的鉴定蛋白质的 GO 信息利用 Caytoscape
（http://www.cytoscape.org/）软件中的 BINGO插件
完成 Gene Ontology（GO）功能富集度计算，对筛
选的不同阶段差异蛋白质进行 BINGO 注释，以获
得双孢蘑菇 4 个不同生长发育时期蛋白质表达及
其差异的相关信息。所使用软件的相关参数设置参
照刘靖宇等（2012a，2012b）的设置。
1.2.6 差异蛋白质的荧光定量 PCR（qPCR）验证：
使用与上述 iTRAQ分析同一批次采集的双孢蘑菇
不同阶段子实体，采用 OMEGA公司的真菌总 RNA
提取试剂盒，按照试剂盒说明书，提取 qPCR验证
用的总 RNA样品，保存于‐70℃备用。根据不同阶
段蛋白质的相对定量信息，选择在各阶段上下调表
达具有较明显连续性变化的差异蛋白质，根据其相
应基因在双孢蘑菇基因组数据库中的 DNA及
mRNA序列设计合成荧光定量 PCR引物。使用
BioRad CFX96型 qPCR系统，按照 Promega的 qPCR
实验操作手册进行。
2 结果与分析
2.1 蛋白质样品 SDS‐PAGE 检测及 iTRAQ‐MS/MS
分析
SDS‐PAGE 电泳结果显示提取的双孢蘑菇发育
不同阶段蛋白质样品质量较好，蛋白质条带清晰，
大分子量蛋白质无明显降解（图 2），适于进行
iTRAQ‐MS/MS 分析。对双孢蘑菇 As2796 子实体 4
个 不 同 发 育 阶 段 蛋 白 质 酶 解 样 品 进 行
iTRAQ‐MS/MS分析，获得数字化的差异蛋白质组。
共计获得不同肽段 5 869个，鉴定到 1 059个蛋白
质，其中 1 007个具有相对定量信息，其中 2段以上
不同肽段覆盖的蛋白质 725 个，占所有鉴定蛋白质
的 72.0%，5段以上不同肽段覆盖的蛋白质 336个，
占 所 有 鉴 定 蛋 白 质 的 33.4% ， 表 明 应 用
iTRAQ‐MS/MS 技术可以有效分离和鉴定双孢蘑菇
子实体不同发育阶段的蛋白质。
2.2 鉴定蛋白质理化性质分析
鉴定获得的 1 007个蛋白质的分子量、等电点
和疏水性 3 个理化性质统计结果显示其分子量范
围为 5.8–432.9kDa，等电点范围为 3.8–12.4，疏水
性范围为 1.1–3.1，其中碱性蛋白的数量为 386个，
占鉴定蛋白质总数的 38.3%。从图 3可以看出鉴定
的蛋白质主要分布于分子量范围为 10–100kDa、等
电点范围为 4.5–7.5、疏水性范围为 1.6–2.1的区域。
这与我们在双向电泳中得出的双孢蘑菇蛋白质主
要集中于分子量 20–120KDa、等电点 pI5.2–7.8 范
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围的结论相近（陈美元等 2011）。
2.3 鉴定蛋白质的主成分分析
1 007个鉴定蛋白质定量数据的主成分计算分
析获得 4个不同阶段蛋白质组的主成分三维图（图
4），显示了 4 个不同阶段样本的蛋白质组整体差
图 1 双孢蘑菇子实体不同发育阶段 从左至右 7 个阶段
分别为：原基期、菇蕾期、幼菇期、小菇期、采收期、成
熟期、开伞期.
Fig. 1 Different stages of Agaricus bisporus fruiting body.
From left to right: seven developing stages of primordium,
plumelet, button, young, harvest, maturation, opening,
respectively.
图 2 双孢蘑菇子实体不同发育阶段蛋白质样品的 SDS‐PAGE
分析 M：蛋白质分子量标记；A：原基期；B：幼菇期；
C：采收期；D：开伞期.
Fig. 2 SDS‐PAGE analysis of proteins extracted from fruiting
bodies at different development stages of Agaricus bisporus
As2796. M: Protein markers; A: Primordium stage; B:
Button stage; C: Harvest stage; D: Opening stage.
图 3 双孢蘑菇 As2796 子实体不同发育阶段蛋白组的理化
性质分析
Fig. 3 Physical and chemical character analysis of the
proteome of fruiting bodies at different developmental
stages of Agaricus bisporus As2796.
图 4 双孢蘑菇 As2796 子实体不同发育阶段蛋白质组的主
成分分析 113：原基期；114：幼菇期；115：采收期；
116：开伞期.
Fig. 4 Principal component analysis of the proteome of
fruiting bodies at different development stages of Agaricus
bisporus As2796. 113: Primordium stage; 114: Button stage;
115: Harvest stage; 116: Opening stage.
异。图中显示，4个阶段子实体样本在第一主成分
（Component 1）、第二主成分（Component 2）、
第三主成分（Component 3）上有不同的数值，在
不同主成分上数值差的绝对值代表了各阶段样品
相互之间的主成分相似程度。其中第一主成分最为
重要，它包含的信息最多。因此，原基期与其余 3
个样本存在较大差别，它们在第一主成分上相差值
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分别达 92、79、102，显著大于其余 3个阶段样本之
间的差别。幼菇期、采收期与开伞期样本在 3 个主
成分上也存在一定差异，它们的第一主成分较为接
近，其中采收期与开伞期在第二主成分上数值相
同，在第三主成分上也非常接近。
2.4 鉴定蛋白质层次聚类分析
1 007个鉴定蛋白质定量数据的样本维和基因
维的分层聚类计算获得了反映不同阶段样品相对
差异的树状结构图。结果显示，幼菇期、采收期和
开伞期子实体蛋白质表达量的上调与下调情况相
对接近，而与原基期样本差异较大。采收期与开伞
期样本相似度较高，先被聚成同一个亚簇，再与幼
菇期样本聚类，形成与原基期样本明显不同的一簇
（图 5）。这一聚类结果与双孢蘑菇子实体不同生
长发育阶段的器官分化及形态差异相吻合，与主成
分分析结果完全一致。
2.5 差异蛋白质筛选
对鉴定到的 1 007 个蛋白质相对定量数据进行
分析，以原基期样本为参照，通过控制两倍上下调
来筛选差异蛋白质。结果共筛选到 432 个差异蛋白
质，包括上调表达蛋白质 170 个和下调表达蛋白质
262个。与双孢蘑菇原基期相比，幼菇期、采收期和
开伞期分别有差异蛋白质 242、200、240 个，分别
占鉴定蛋白质总数的 24.0%，19.9%和 23.8%。其中
二者共有的差异蛋白质幼菇期和采收期为 102 个，
幼菇期和开伞期为 92个，采收期和开伞期为 105个，
3个阶段共有的差异蛋白质为 49个（表 1，图 6）。
2.6 差异蛋白质 BINGO注释
差异蛋白质的 BINGO 注释结果显示在生物学
过程（biological process）中，与原基期相比，采
收期差异蛋白质具有较为广泛的生物学功能覆盖
范围（图 7），其次是开伞期，而幼菇期仅注释到 3
个生物学过程，它们分别是翻译（translation）、基
因表达（gene expression）和细胞大分子生物合成
过程（cellular macromolecule biosynthetic process）。
这 3 个过程相关的蛋白质在 3 个发育阶段中都出
现富集，尤以开伞期富集度最高，其 ‐ L o g10
（P‐value）值分别达到 3.73、3.07 和 2.62。除了
这 3 个过程以外，细胞蛋白质代谢过程（cellular
protein metabolic process）相关蛋白质仅在开伞期
表 1 双孢蘑菇 As2796子实体不同发育阶段与原基期相比的差异蛋白质数目
Table 1 Differentially expressed protein numbers of fruiting bodies at different developmental stages comparing with
primordium stage of Agaricus bisporus As2796
样品
Proteome samples
差异蛋白质数目
Differentially expressed proteins
上调蛋白质数目
Up‐regulated proteins
下调蛋白质数目
Down‐regulated proteins
幼菇期 Button stage 242 91 151
采收期 Harvest stage 200 106 94
开伞期 Opening stage 240 108 132
幼菇期和采收期共有
Overlap in button and harvest stage
102 52 50
幼菇期和开伞期共有
Overlap in button and opening stage
92 47 45
采收期和开伞期共有
Overlap in harvest and opening stage
105 66 39
3个阶段共有
Overlap in three stages
49 29 19
合计 Total 432 170 262
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图 5 双孢蘑菇 As2796子实体不同发育阶段蛋白质组的层次聚类分析 113：原基期；114：幼菇期；115：采收期；116：
开伞期. 鉴定蛋白质不同表达变化倍数用不同颜色表示，红色代表上调，绿色代表下调，黑色代表无显著差异.
Fig. 5 Hierarchy clustering analysis for the proteome of fruiting bodies at different developmental stages of Agaricus bisporus
As2796. 113: Primordium stage; 114: Button stage; 115: Harvest stage; 116: Opening stage. The expression values for each
protein were indicated by different color bars. Up‐regulated, down‐regulated and invariant proteins were marked in red, green
and black respectively.
A B
C
图 6 双孢蘑菇 As2796子实体不同发育阶段与原基期相比的差异蛋白质数目韦恩图 A：总差异蛋白质；B：上调表达的
差异蛋白质；C：下调表达的差异蛋白质. 数字表示差异蛋白质数目.
Fig. 6 Venn diagram of differentially expressed protein numbers of fruiting bodies at different developmental stages comparing
with primordium stage of Agaricus bisporus As2796. A: Total differentially expressed proteins; B: Up‐regulated expressed proteins; C:
Down‐regulated expressed proteins. The number in parentheses indicates the number of differentially expressed proteins.
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图 7 双孢蘑菇 As2796子实体不同发育阶段差异蛋白质的 BINGO注释 113：原基期；114：幼菇期；115：采收期；116：开伞期.
Fig. 7 BINGO analysis for differential expressed proteins of fruiting bodies at different developmental stages of Agaricus bisporus
As2796. 113: Primordium stage; 114: Button stage; 115: Harvest stage; 116: Opening stage.
富集，蛋白复合体组装（protein complex assembly）、
大分子生物合成（macromolecule biosynthetic
process）、细胞蛋白复合体组装（cellular protein
complex assembly ）、 蛋 白 质 聚 合 （ protein
polymerization）和蛋白复合体生物发生（protein
complex biogenesis）过程的相关蛋白质在采收期和
开伞期富集，还有其余 9个生物学过程相关蛋白质
仅在采收期富集。
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从分子功能（molecular function）中可以看出，
与原基期相比，幼菇期、采收期和开伞期分别注释
到 4、9、16 个分子功能，其中核糖体结构组分
（structural constituent of ribosome）、结构分子
（ structural molecule activity）和水解酶活性
（hydrolase activity）相关的差异蛋白质在 3 个阶
段均有不同程度的上调表达，尤其是前二者在开伞
期的表达远高于其他阶段，其‐Log10（P‐value）值
分别高达 6.11和 6.99。此外，具有氧化还原酶活性
的蛋白质（oxidoreductase activity）在采收期和开伞
期呈现明显上调，超氧化物歧化酶（superoxide
dismutase activity）、锌离子结合（zinc ion binding）、
作 用 于 超 氧 自 由 基 受 体 的 氧 化 还 原 酶
（ oxidoreductase activity， acting on superoxide
radicals as acceptor ） 和 琥 珀 酰 转 移 酶
（succinyltransferase activity）的蛋白质在采收期特异
表达，还有其余11类差异蛋白质在开伞期特异表达。
2.7 部分差异蛋白质的 qPCR验证
根据子实体发育 4 个不同阶段蛋白质的相对
定量信息，选择与原基期相比在其他 3个阶段上下
调表达具有较明显连续性变化的差异蛋白质共 8
个（表 2），基于其基因及 mRNA 序列设计合成荧
光定量 PCR 引物（表 3），以双孢蘑菇 GAPDH（3‐
磷酸甘油醛脱氢酶）基因为内参基因进行荧光定量
PCR 验证。结果表明，连续上调表达的蛋白质
Mismatched base pair and cruciform DNA
recognition protein（错配碱基识别蛋白）、连续下
调表达的蛋白质 Cytochrome C1（细胞色素 C1）以
及某推定的未知蛋白质（登录号 D8Q944_SCHCM）
在不同阶段的 mRNA 定量中具有较为一致的表达
趋势（图 8），其他蛋白质则只在部分阶段中具有
一致的表达趋势。其中错配碱基识别蛋白在开伞期
的蛋白质与 mRNA表达量分别达到原基期的 23倍
和 44倍。
表 2 双孢蘑菇发育不同阶段表达变化具有连续性的蛋白质及其相对定量
Table 2 Proteins up‐ or down‐expressed continuously at different stages of Agaricus bisporus fruiting body development and
their relative quantification
登录号
Accession No.
蛋白质名称
Protein name
相对定量 Relative quantification
原基期
Primordium
幼菇期
Button
采收期
Harvest
开伞期
Opening
Q9P8B0_AGABI 错 配 碱 基 识 别 蛋白 Mismatched base
pairand cruciform DNA recognition protein
1 2.38 6.43 23.33
B0D8X9_LACBS 预测蛋白 Predicted protein 1 3.05 3.91 6.31
Q9HGX2_AGABI 推定的 β‐葡萄糖苷酶
Putative beta glucosidase
1 1.34 4.53 6.25
A8N1X8_COPC7 D‐半乳糖醛酸还原酶
D‐galacturonic acid reductase
1 1.51 2.70 3.87
B0D4B4_LACBS 细胞色素 C1 Cytochrome C1 1 0.56 0.45 0.29
A8NXG9_COPC7 乙醇脱氢酶 Alcohol dehydrogenase 1 0.56 0.39 0.21
D8Q944_SCHCM 推定蛋白 Putative uncharacterized protein 1 0.86 0.66 0.13
B0DXX4_LACBS 扩展蛋白 Expansion family protein 1 0.94 0.67 0.08
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表 3 荧光定量 PCR引物设计
Table 3 Primers designed for the real‐time PCR
登录号
Accession No.
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence (5’‐3’)
Tm (°C) GC (%) 预期扩增长度
Amplification length (bp)
Q9P8B0_AGABI 1F CCGCTCAAACCAAAGGTCACGC 68.6 59.1 116
1R CGCATATTGCCCGAAGTTTGTT 64.1 45.5
B0D8X9_LACBS 22F AGATTGGCGCTACACCAGAGGAGAT 66.7 52.0 200
22R GGTGGCCTCATCCAGAAGTAGAAT 62.9 50.0
Q9HGX2_AGABI 23F CTTCGCGTTTGGCCATGGTT 65.4 55.0 192
23R GGGTGAGTGAGTTCCGAGGTCTTT 64.9 54.2
A8N1X8_COPC7 2F TGGCAGAAAAGGGCGACATT 62.8 50.0 150
2R AACCGTATCCGCGTTGACCG 65.3 60.0
B0D4B4_LACBS 27F AGACCCGCTGTTCTCAATGCCA 66.5 54.5 150
27R CGTCCCAGGTGATACCCTTGTT 62.7 54.5
A8NXG9_COPC7 6F CGGGACCAGCAGTCTTCCAGTTCA 69.4 58.3 220
6R CCGACATCACTCTTCGTGTAACCA 63.9 50.0
D8Q944_SCHCM 26F GCCAGAAATGTTAGGCCCCACT 64.3 54.5 115
26R ATGCCCAATAATGAACCCACGA 63.9 45.5
B0DXX4_LACBS 25F TTGAGATCAAGAAACCCGAACC 60.8 45.5 188
25R GGCAGAAGAAGACGTGGAGACG 63.6 59.1
gi|417017
GAPDH2
21F TCAACGGCAAGCTCACTGGTCTC 66.3 56.5 166
21R TCGTCGGTGTATGCGATGATTCC 66.6 52.2
图 8 双孢蘑菇 As2796子实体不同发育阶段差异蛋白基因的荧光定量 PCR验证 A：错配碱基识别蛋白；B：细胞色素 C1；
C：某推定蛋白质（登录号 D8Q944_SCHCM）. 横坐标 a、b、c、d分别为原基期、幼菇期、采收期、开伞期，纵坐标为相
对表达量倍数.
Fig. 8 qPCR validation for the genes of differentially expressed proteins of Agaricus bisporus As2796 fruiting bodies at different
developmental stages. A: Mismatched base pair and cruciform DNA recognition protein; B: Cytochrome C1; C: Putative
uncharacterized protein (accession No. D8Q944_SCHCM). a: Primordium stage; b: Button stage; c: Harvest stage; d: Opening
stage. The ordinate represents relative quantification.
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3 讨论
本研究对双孢蘑菇 As2796子实体 4个不同发
育阶段的蛋白质组进行了 iTRAQ ‐MS/MS分析，鉴
定到1 007个具有相对定量信息的蛋白质并进行了
系列生物信息学分析，为进一步的研究积累了大量
的基础数据。其中按照 2倍上下调筛选出来的不同
阶段差异蛋白质数目达到 200 多个，远大于应用
2‐DE方法获得的差异蛋白质数目，如 Sakamoto et
al.（2002）发现金针菇 Flammulina velutipes 低温
刺激下的子实体诱导差异蛋白质 22个，胡开辉等
（2009）获得斑玉蕈 Hypsizigus marmoreus低温胁
迫差异蛋白质 26个，陆兆明等（2010）找到双孢
蘑菇高温胁迫差异蛋白质 6个，陈美元等（2011，
2013）和陈美元（2012）获得双孢蘑菇退化差异
蛋白质 2个、子实体发育初期差异蛋白质 14个和
后期 16个。根据定量结果对在不同阶段中差异表
达具有连续性的 8 个蛋白质相关基因的转录情况
进行了荧光定量 PCR 验证，结果只有 3 个相关基
因具有较为一致的表达趋势，其余基因仅在部分阶
段中表达一致。我们推测基因转录与蛋白质翻译之
间存在着诸多生物学过程，蛋白质也存在着累积、
反馈抑制、降解等过程，因此蛋白质与 mRNA 在
表达量和表达趋势上可能存在着不一致的情况。
错配碱基识别蛋白是一类在 DNA 修复过程中
起重要作用的蛋白质，而 DNA 修复是生物有机体
对细胞 DNA 损伤的一种自我保护能力（Eastwood
et al. 2001）。该蛋白质及相应的 mRNA在双孢蘑
菇幼菇期、采收期和开伞期连续上调表达，且在开
伞期分别达到了 23倍和 44倍，其原因可能在于，
随着双孢蘑菇的成熟和开伞，子实体细胞分化形成
大量孢子并进入散布孢子时期，在孢子形成过程中
涉及大量减数分裂和有丝分裂，这可能需要大量的
错配碱基识别蛋白以保证 DNA复制的准确性。
连续下调表达的细胞色素 C1为细胞色素 C的
一种，是线粒体内膜上的嵌入蛋白，也称为细胞色
素 E（Gao & O’Brian 2005）。它可被氧化型的细胞
色素 C 氧化，参与从细胞色素 B 向细胞色素 C 传
递电子，从而在双孢蘑菇发育过程的能量代谢中起
作用。另一个连续下调表达得到 qPCR验证的某推
定未知蛋白质根据其注释具有二羟酸脱水酶及 6‐
磷酸葡萄糖酸脱水酶活性（Ohm et al. 2010），而这
两种酶在氨基酸代谢及葡萄糖分解中具有重要作
用。它们的连续下调表达在双孢蘑菇子实体发育中
的作用有待探讨。
此外，多项研究结果（De Groot et al. 1996，
1999；Lugones et al. 1996）表明双孢蘑菇疏水蛋白
（hydrophobin）及其相关基因在子实体发育过程
中起着重要作用。我们的研究数据表明其中一种疏
水蛋白 Hydrophobin‐B在原基期、幼菇期和采收期
呈连续上调且相对表达量较高，在开伞期则显著下
调，相对量仅有原基期的 10%，在采后后熟阶段更
是连续下调至痕量值（数据未显示）。该蛋白质在
双孢蘑菇发育及后熟中的作用值得进一步研究。
由于获得的双孢蘑菇不同发育阶段之间的差
异蛋白质数目众多，本文仅选择了部分上下调表达
具有较明显连续性变化的差异蛋白质进行 qPCR验
证。对其余在各阶段具有特异表达模式的蛋白质，
将结合蛋白质的注释及之前的 2‐DE结果作进一步
的遴选和验证，以探讨双孢蘑菇子实体发生、发
育、成熟的分子机制，并为其进一步深入研究奠
定基础。
致谢：本研究依托特色食用菌繁育与栽培国家地方联合工
程研究中心、国家食用菌工程研究中心福建分中心、福建
省双孢蘑菇技术工程研究中心、福建农林大学菌物研究中
心、上海复旦大学生物医学科学院的科研平台完成。
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