全 文 ：Mycosystema
菌 物 学 报 15 March 2008, 27(2): 289-296

jwxt@im.ac.cn
ISSN1672-6472 CN11-5180Q
©2008 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.






红托竹荪菌托多糖的提取及抗肿瘤活性的初步研究
赵凯 王飞娟 潘薛波 朱诚*
浙江大学生命科学学院 植物生理学与生物化学国家重点实验室 杭州 310058


摘 要：红托竹荪菌托经热水提取、酒精沉淀、脱蛋白后的粗多糖，其得率远大于其菌丝体和子实体的
其他部位及香菇子实体。菌托粗多糖进一步用 DEAE 纤维素柱和 Sephadex G-75 分离纯化，得到两个组分
DRVP1 与 DRVP2，对分离得到的主要多糖通过高效液相色谱（HPLC）、红外光谱（IR）等进行结构分析。
DRVP1 的相对分子质量（Mr）为 1.47×104，红外光谱数据显示为 β-型甘露糖苷。体外试验表明，红托竹
荪菌托多糖的组分 DRVP1 对小鼠 S180 肉瘤有一定的抑制作用。
关键词：食用菌，分离纯化，分子量，结构分析，红外光谱


Extraction and primary investigation of antitumor activity
of polysaccharides from the volva of Dictyophora
rubrovolvata
ZHAO Kai WANG Fei-Juan PAN Xue-Bo ZHU Cheng*
State Key Laboratory of Plant Physiology & Biochemistry, College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058,
China
Abstract: The polysaccharides from the volva of Dictyophora rubrovolvata were extracted by hot water,
precipitated by alcohol in different concentrations and deproteinized by the method of Sevag. The yield of crude
polysaccharides of the volva were much higher than that of mycelium and other parts of fruit body. Two kinds of
polysaccharides, DRVP1 and DRVP2, were purified by use of column chromatography on DEAE-cellulose and
Sephadex G-75, and the structural features of the polysaccharides were elucidated by HPLC and IR respectively.

基金项目：浙江省科技计划项目（No. 2006C23015）
*Corresponding author. Tel: 0571-88206482; E-mail: pzhch@zju.edu.cn
收稿日期：2007-05-14，接受日期：2007-07-25
DOI:10.13346/j.mycosystema.2008.02.019
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The inhibitory effect of DRVP1 on the tumor cells of S180 (Sorcoma-180) was investigated by
sulforhodamine-B (SRB) methods. The result showed that the molecular weight of DRVP1 was 1.47×104, and it
had an inhibitory effect on the tumor cells of S180 to some extent.
Key words: mushroom, isolation, molecular weight, structure analysis, infra-red spectrum

竹荪是一种珍贵的食、药两用真菌，红托竹荪 Dictyophora rubrovolvata 是竹荪中的珍品，
具有开发优势。近年来的研究发现，红托竹荪含有多种氨基酸、维生素、多糖和多种无机
盐等。除其营养价值外，同时还具有一定的防病保健作用，长期服用竹荪具有治疗慢性气
管炎、降低血压和减少血液中的胆固醇含量等药用功能（陈璋辉等 2005）。
红托竹荪成品加工过程中，生产者常用其子层托柄，而将菌盖和菌托除去（子层托柄
与菌盖、菌托的重量比 1:1.3），造成了极大浪费，研究也表明菌托干品中，富含多糖、氨
基酸、蛋白质、维生素及有益金属元素。而目前为止，对红托竹荪菌托多糖的研究尚缺。
关于竹荪生物活性成分的研究最早见于日本人对长裙竹荪多糖抗肿瘤的研究，表明其具有
抗肿瘤的作用，能提高免疫力。本实验以红托竹荪的菌托为原料，来探讨其生物活性物质
和药理活性之间的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料来源：红托竹荪废弃物-菌托来源于浙江新昌华滋竹荪有限公司，于 60℃烘箱中
烘干，用粉碎机粉碎后备用。Sephadex G-75（Pharmacia 公司）；DEAE-纤维素（Bio-Rad
Laboratories）；浓度为 98%的食用酒精；其余试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器：分离系统包括 HL-2B 数显恒流泵，BSZ-100 自动部分收集器；Waters-2690 高
效液相色谱仪、Waters-2410 示差折光检测仪（Water 公司）；Nexus 670 傅立叶变换红外光
谱仪（美国 Nicolet 公司）；RE-52AAA 型旋蒸发器；SP-2500 紫外分光光度计（上海光谱
公司）。
1.2 多糖提取的正交试验
取 5g 红托竹荪菌托粉末，设计正交试验，各加入不同量的蒸馏水，分别在特定温度
下按不同的时间提取两次，每次提取完后过滤，滤液合并后，离心，上清液浓缩后，加入
95%的乙醇达到不同的至饱和度使之沉淀，将沉淀以水充分溶解，以一倍体积的 Sevage 剂
（氯仿:异戊醇=3:1）脱蛋白 3-4h，浓缩，再用 95%的乙醇沉淀，最后 65℃烘干得红托竹
荪菌托多糖粗品 DRVP（Polysaccharide of the volva of Dictyophora rubrovolvata）（陈小燕和
高泽立 2006）。用硫酸-苯酚法测定提取的多糖含量，每一试验进行 3 次，从中找出最佳提
取条件。
1.3 蛋白含量分析测定
取一定量的 DRVP1，制成质量浓度为 1mg/mL 的水溶液，用硫酸-苯酚法显色后于
490nm 处进行测定，以牛血清蛋白为对照进行分析。
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1.4 多糖含量分析
硫酸-苯酚比色法测定含量。葡萄糖（G）标准曲线的制作：分别吸取 G 标准液
（0.2mg/mL）0mL，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL，并分别置于 25mL 比色管中，
准确补水至 2mL，加苯酚 2mL，浓 H2SO4 10mL，分别混匀，沸水浴 15min，冷却后用分
光光度计在 490nm 波长处以试剂空白溶液为参比，测定吸光度值。以 G 质量为横坐标，
吸光度值为纵坐标，绘制曲线；DRVP1 的含量测定也采用相同的方法。
1.5 紫外光谱分析
取一定量的 DRVP1 溶于蒸馏水中，制成质量浓度为 1mg/mL 的溶液，在紫外可见光
下进行扫描分析，波长为 200-400nm；经苯酚-硫酸法显色后，于波长为 200-600nm 处进行
扫描。
1.6 多糖的柱分离
按上述方法确定的较佳提取条件提取足够量的 DRVP，用水溶解后，上 DEAE-纤维素
柱（1.7cm × 20.3cm）分离，依次用 0.1mol/L NaCl 的 Tris 缓冲溶液与 0.5mol/L NaCl 的 Tris
缓冲溶液进行梯度洗脱（林玉满 2003），洗脱时间均为 2h，V 为 3mL/min，5mL/管。以硫
酸-苯酚法检测 490nm 处的吸光值，收集各峰洗脱液，浓缩后用 95%的乙醇沉淀得到两种
多糖 DRVP1 与 DRVP2。
再用 Sephadex G-75（2.6cm × 45cm）进行分离纯化，以 0.1mol/L 和 0.5mol/L 的 NaCl
溶液为流动相，分离得到红托竹荪菌托均一多糖 DRVP1a。
1.7 多糖纯度及分子量测定
样品 DRVP1 及系列标准多糖分别经高效液相凝胶渗透色谱分析（连宾和郁建平
2004）：分析柱为 Waters Uktrahydrogel 1000，Uktrahydrogel 500，Uktrahydrogel 120 三柱串
联，以 0.1mol/L 的 NaNO3为流动相，流速为 0.8mL/min，检测器为 Waters 2410 示差折光，
泵为 Waters 515，柱温是 40℃。
1.8 红外光谱分析
取 1mg 多糖 DRVP1 样品，和 KBr 粉末按 1:20（W:W）的比例研磨均匀，然后压片（注
意：压出的薄片以较透明为佳）。经 Nexus670 型傅立叶变换红外光谱仪扫描分析，扫描范
围：4000cm-1-400cm-1。
1.9 体外细胞毒性试验（SRB 法）
取对数生长期的 S180（小鼠腹水型肝癌）肿瘤细胞，96 孔板每孔 5×103-1×104 个细胞
接种，100μL。于 37℃、5% CO2 培养箱中培养过夜后，加药液至终浓度 50μg/mL、100μg/mL、
200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL，阴性对照每孔加入相同体积的 DMEM 培养基，各组
均设 3 个复孔，24h 后取出培养板，每孔加入 4℃预冷的 80%（质量/体积）三氯乙酸（TCA）
30μL 固定细胞。TCA 的终浓度为 16%，轻柔地加在每孔液面上，然后在 4℃冰箱中放置
1h。自然风干后加入 0.4％SRB 溶液（SRB 固体溶于 1％的冰乙酸）染色 15min，用 1％冰
乙酸溶液洗涤 3-5 次，以去除未结合的染料（Marsh et al. 1992）。空气中干燥后用 pH 为 10.5，
100μL 10mmol/L Tris base（三羟甲基胺基甲烷）溶解，在平板振荡器上振荡 5min，酶标仪
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490nm 下读取 OD 值。以不同浓度药液处理后的 OD 值/对照 OD 值×100％作为细胞生长影
响的指标，即细胞生长抑制率 IR（%）=（1-A 实验组/A 对照组）×100%。
2 结果与分析
2.1 红托竹荪菌托多糖提取条件的筛选
影响多糖提取率的因素很多，浸提时间、加水量、脱除杂质方法及醇析的至饱和浓度
等都会影响食用菌多糖的得率。根据其它食用菌多糖提取的经验，本实验主要针对物料比
（竹荪菌托的粉末重量与水体积比）、浸提时间、醇析的酒精浓度对红托竹荪菌托多糖提
取的影响进行分析。
2.1.1 浸提时间及物料比对用水提醇沉法提取多糖的影响：由表 1 可知，当物料比为 1:15，
浸提时间为 4h 时，其得率最高，为 12.03% ± 0.23%。若加入水过少，在多糖没有完全浸
提出来之前，浸出液已经变得很少，甚至糊锅，从而影响多糖得率；若加入水过多，则浸
出液过稀过多。实验中浸出液体积浓缩为原来的 1/2，以除去过多水分，这样不仅可以减
少乙醇的用量，而且可以增加浸出液的浓度，从而提高醇沉法的得率。由此可知合适的物
料比与浸提时间对多糖得率的影响较大。
表1 不同浸提时间及物料比对多糖提取的影响 (n=3)
Table 1 The effects of different extracting duration and ratio of volva dust to water volume on polysaccharide extraction (n=3)
Ratio of volva dust (g) to water volume (mL)
Extracting duration
1:15 1:20 1:25
3h 8.17% ± 0.27% 9.14% ± 0.56% 9.99% ± 0.49%
4h 12.03% ± 0.23% 8.19% ± 0.09% 8.11% ± 0.20%
5h 10.86% ± 0.37% 10.14% ± 0.40% 10.56% ± 0.05%

2.1.2 不同乙醇浓度对多糖得率的影响：将98%的食用酒精加入竹荪菌托的浸出液中，使其
达到一定的至饱和浓度。从表 2中可知，在70%的至饱和浓度下，其多糖得率最高，为
12.09% ± 0.16%。

表2 不同乙醇浓度对提取多糖的影响(n=3)
Table 2 The effect of different alcohol concentration on distilling polysaccharides (n=3)
Series Alcohol concentration (%) Polysaccharide obtainment rate (%)
1 50 9.29 ± 0.92
2 60 10.95 ± 0.42
3 70 12.09 ± 0.16
4 80 11.12 ± 0.25
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2.1.3 红托竹荪菌托与其它食用菌多糖含量的比较：根据上述得到的最佳提取方法对竹荪
子层托柄、香菇及竹荪菌托中多糖的提取含量进行比较（n=3），含量=多糖重/原料重。均
取 5g 食用菌的干粉，最终得到三者不同的多糖得率：竹荪菌托 (11.91% ± 0.23%) >竹荪子
层托柄（2.97% ± 0.30%）>香菇子实体（2.12% ± 0.15%）。
由此可见，竹荪菌托样品多糖含量均远远高于竹荪子层托柄及香菇子实体，这说明竹
荪菌托有一定的开发利用前景。
2.2 蛋白含量分析
用牛血清蛋白作标准曲线，求得标准曲线方程：y（浓度）= 0.7025x（ABS）+0.0639，
相关系数 R2 = 0.9775。将多糖 DRVP1 配成一定浓度的糖溶液（1mg/mL）后，测得其 ABS
为 0.010 ± 0.0015，说明其蛋白含量极低。由实验结果可知，用一倍体积的 Sevage 剂（氯
仿:异戊醇= 3:1）进行去蛋白的效果明显，不仅去除率高，而且工艺简单，无需大的动力和
设备，大大降低了运转成本。
2.3 多糖含量分析
将 DRVP1 配成浓度为 1mg/mL 的预测液，吸取样品预测液 2mL 按制标准曲线的方法
进行。从标准曲线上查出 G 质量，计算含糖量。由实验得知粗多糖中糖含量为 81.20%。
2.4 紫外光谱分析
将 DRVP1 配制成水溶液 (1mg/mL)，经过 UV-Vis 分光光度计扫描从图中可以看出，
DRVP1 多糖组分在 260nm 处没有吸收峰，说明不含核酸；在 280nm 处，曲线基本上平滑，
表明不含蛋白质。其水溶液样品再经过苯酚-硫酸法显色后经 UV-Vis 分光光度计扫描，从
图中可以看出，DRVP1 显色反应后在 490nm 处有显著吸收峰，且无其他杂峰出现，表明
基本不含杂质。


图 1 DRVP 的 DEAE-纤维素柱分离图谱
Fig. 1 Separation chromatogram of DRVP by DEAE-celluose column.
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2.5 多糖的柱分离
将粗多糖 DRVP 配成 12mg/mL 的水溶液，分离后得到两个组分，DRVP1 与 DRVP2
（图 1），体外实验中发现 DRVP1 具有一定的抗肿瘤免疫活性。将 DRVP1 的浓缩液再进
一步分离纯化，得到红托竹荪菌托均一多糖 DRVP1a（图 2）。


图 2 DRVP1 的上 Sephadex G-75 的分离图谱
Fig. 2 Elution curve of DRVP1 on Sephadex G-75 column.

2.6 多糖纯度及分子量测定
样品 DRVP1a 在高效液相凝胶渗透色谱分析中显示为单一对称峰，其保留时间为
22.429min，根据标准曲线和数据处理软件计算，其数均相对分子质量 Mr 为 1.47 × 104。
2.7 红外光谱分析
DRVP1a 的红外图谱在 2923cm-1，1296cm-1 处有两组特征峰，它们分别代表了糖类 C-H
伸缩振动与变角振动，再加上 3422cm-1 处的 O-H 的伸缩振动，因而进一步确证被分析物
DRVP1a 为糖类化合物（Mitry et al. 2000）。此外，DRVP1a 具有-OH、COOR、C-O-C 醚键、
-CHO/C=O、COOH、C-O-H、-CH2-、-CH3 的特征吸收峰，为 β-型甘露糖（图 3）。
2.8 体外细胞毒性试验（SRB 法）
将 DRVP1 与 DRVP2 分别在 50µg/mL，100µg/mL，200µg/mL，500µg/mL，1000µg/mL
的浓度下在体外分别作用于 S180（小鼠腹水型肝癌）肿瘤细胞，观察它们对该肿瘤细胞的
生长抑制作用。实验中发现 DRVP1 对 S180（小鼠腹水型肝癌）肿瘤细胞具有一定的抑制
作用，而 DRVP2 并未显示抑制作用，结果见图 4。

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图 3 DR1 红外光谱
Fig. 3 FT-IR spectrum of DRVP1a.


图 4 竹荪多糖 DRVP1 不同浓度对 S180 细胞生长的相对抑制作用
Fig. 4 Effect of DRVP1 on the growth of S180 cells in vitro.

3 讨论
多糖作为一种重要的生命物质，具有丰富的生物活性，值得进一步开发，不断扩展其
在保健品、功能性食品中的应用（欧阳天贽等 2006）。真菌多糖是目前公认的有较高效
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应的免疫增强剂，许多真菌多糖制剂已广泛应用于临床，在自身免疫性疾病、免疫功能低
下症、肿瘤的治疗等方面取得了令人鼓舞的临床效果。目前已开发利用的多糖有猪苓多糖、
香菇多糖、云芝多糖、茯苓多糖等（张惟杰 1999），主要用于抗肿瘤、治疗艾滋病、延
缓衰老及抗病毒等。
红托竹荪是一种珍贵的食药两用真菌，有“十分好的蛋白质来源”、“人类植物性食
品的顶峰”、“现代保健食品”等美称。我国是竹荪的产地，也是世界上最先实现竹荪人
工栽培的国家。红托竹荪是竹荪中的珍品，其子实体主要用于食用，市场价格较高。本实
验对其废弃物菌托的开发，不仅能增加红托竹荪的利用度，而且能够降低生产药物成本，
提高产品的附价值和农民收入，产生明显的经济效应与社会效应。

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