全 文 ： 生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2010, March 25; 26(3): 378−385
journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061
cjb@im.ac.cn ©2010 CJB, All rights reserved.


Received: October 10, 2009; Accepted: January 4, 2010
Corresponding author: Heping Shi. Tel: +86-20-85214793; E-mail: shihp@scnu.edu.cn

组织工程与细胞培养
南美蟛蜞菊毛状根诱导及其离体培养
欧少云 1,2，施和平 1，曾宝强 3
1 华南师范大学生命科学学院广东省植物发育生物工程重点实验室，广州 510631
2 清远职业技术学院，清远 511510
3 香港教育学院科学与环境学系，香港新界
摘 要: 为了探讨利用南美蟛蜞菊毛状根来改良其观赏性状和生产次生物质，研究了南美蟛蜞菊 Wedelia trilobata (L.)
A.S.Hitche 毛状根的诱导及其离体培养过程中培养基 N 源、碳源、磷和钙的消耗变化。结果表明，发根农杆菌
Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 感染南美蟛蜞菊幼嫩叶片外植体 7 d 后从其叶片切口中脉处产生毛状根。毛状根
能在无外源激素的培养基上自主生长。PCR 扩增结果显示发根农杆菌 Ri 质粒的 rol B 和 rol C 基因已在南美蟛蜞菊毛
状根基因组中插入、整合并得到表达。毛状根液体培养 0~7 d 内处于生长迟滞期、7~21 d 为快速生长期、21 d 后进入
生长平台期。在毛状根液体培养过程中培养基的蔗糖、硝态氮、PO43−、Ca2+被逐渐吸收和消耗，培养至 7 d 时，蔗糖
被消耗近 50％；硝态氮含量只剩下起始硝态氮含量的 5.8％；至 35 d 时，蔗糖和硝态氮含量分别约为其起始浓度
的 3.39％和 1.82％。与 Ca2+浓度变化不同的是，培养基的无机磷被快速消耗，培养至 7 d 时其浓度约为其起始浓度的
1.76％；但培养至 35 d 时培养基中仍残存有占起始浓度约 61.3％的 Ca2+。该结果为今后利用南美蟛蜞菊毛状根来改良
其观赏性状和设计合适的培养基来规模培养生产其次生物质提供了可能性。
关键词 : 发根农杆菌，南美蟛蜞菊，毛状根，氮源，钙
Induction and in vitro culture of Wedelia trilobata hairy roots
Shaoyun Ou1,2, Heping Shi1, and Eric Pokeung Tsang3
1 Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, College of Life Science, South China Normal University,
Guangzhou 510631, China
2 Qingyuan Polytechnic College, Qingyuan 511510, China
3 Department of Science and Environmental Studies, the Hong Kong Institute of Education, New Territories, Hong Kong
Abstract: To study the possibilities for improvement of the ornamental character and production of secondary metabolites by
using Wedelia trilobata hairy roots, we investigated the induction of W. trilobata L. hairy roots and its consumption changes of
carbon resource, nitrogen resource, phosphate and calcium in the medium during liquid culture. The results showed that hairy roots
could be incited from the cut edges of leaf explants 7 days after inoculation with Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 and could
have an autonomous growth on the medium without phytohormones. The PCR amplification showed that rol genes of Ri plasmid of
A. rhizogenes was integrated and expressed into the genome of transformed hairy roots. The hairy root line grew very slowly in
0–7 days, very fast from 7 to 21 days. During the liquid culture of hairy roots, sucrose, NO3−-N, PO43−and Ca2+ in the medium could
be gradually absorbed and utilized with time. The content of NO3−-N in the medium was 5.8% of the initial amount at day 7, while
sucrose content was about 50% of the initial amount. At day 35, the NO3−-N and sucrose content in the medium was 1.82% and
3.39% of the initial amount, respectively. In combination with Ca2+ consumption, PO43− of the medium was rapidly absorbed and
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utilized. At day 7, the content of PO43− in the spent medium was only 1.76% of the initial amount; but even at day 35, the content of
Ca2+ in the spent medium was still 61.3% of the initial amount. The results presented here had provided the possibilities on
improvement the ornamental character and how to prepare optimum medium for large scale cultivation and production of secondary
metabolites from W. trilobata L. hairy roots.
Keywords: Agrobacterium rhizogenes, Wedelia trilobata, hairy roots, nitrogen resource, calcium
利用发根农杆菌 Agrobacterium rhizogenes Ri质
粒的 T-DNA片段在植物基因组中的插入、整合和表
达所产生的生长迅速的毛状根培养物来产生植物尤其
是药用植物的次生物质，已在人参 Panax ginseng L.、
褐脉少花龙葵 Solanum nigrum L. var. pauciflorum、三
裂叶野葛Pueraria phaseoloides L.和Ruta graveolens L.
等药用植物中获得成功 [1-4]；同时由于 Ri 质粒 T-
DNA 的 rol 基因诱导产生的毛状根再生成植株具有
诸如矮化、茎节数减少、花序缩短、开花延迟等特
征[5]；因而国内外已有不少学者在开展利用毛状根
技术来改良植物观赏性状，尝试培育诸如矮化、花
叶形态改变的新品种 [6-7]。南美蟛蜞菊 Wedelia
trilobata (L.) A.S.Hitche，别名三裂叶蟛蜞菊、属菊
科多年生草本，花黄色且全年见花。有研究表明，
南美蟛蜞菊含有具有化感作用的倍半萜内酯成
分 [8]；同时它也是良好的耐阴地被植物和护坡好材
料；但在用作园林绿化的地被植物使用时，由于其
生长较快，节间长，必须定期进行人工修剪。因而，
园艺生产上也迫切需要开发出矮化、节间显著缩短
的南美蟛蜞菊品种来用作“地被”植物进行广场和
坡地绿化种植。而有关南美蟛蜞菊的组织培养研究
虽有少量报道[9]，但到目前为止，未见利用发根农
杆菌对南美蟛蜞菊遗传转化及其毛状根次生物质产
生和植株再生的研究报道。为此，本研究拟通过发
根农杆菌对南美蟛蜞菊叶片的遗传转化，产生出可
自主生长的毛状根，并研究该毛状根液体培养周期
中蔗糖、无机元素 N、P和 Ca的消耗变化，为今后
利用该毛状根的离体培养来生产具有化感作用的次
生物质，以及通过毛状根的组织培养来快速繁殖出
矮化的、无需修剪的南美蟛蜞菊新品种等奠定实验
和技术基础。
1 材料与方法
1.1 细菌菌株及培养
农杆碱型发根农杆菌 ATCC15834 由德国马丁.
路德大学的 Peter Lindemann博士提供。挑取该农杆
菌单菌落，接种于添加了 20 µmol/L 乙酰丁香酮的
YEB液体培养基中，28℃振荡 (160 r/min) 培养 30 h
后，供感染用。
1.2 外植体的制备
取南美蟛蜞菊植株的幼嫩叶片，在超净工作台
上经 70％酒精和 0.1％ HgCl2溶液常规消毒后，切
成 1 cm2左右具叶脉的叶片外植体，接种于无外源激
素的 MS培养基预培养 24 h后，用于转化。
1.3 毛状根的诱导和培养
将上述预培养的叶片外植体浸入用 MS 培养
基稀释 5 倍的发根农杆菌 ATCC15834 菌悬液中
15 min，取出、吸干多余菌液并放回原培养基上共
培养 2 d后，转入 MS+500 mg/L头胞噻肟钠的无外
源激素的 MS 培养基上，在 25℃每天 14 h 散射光
下诱导毛状根。切取从外植体产生的毛状根置于含
500 mg/L头胞噻肟钠的无外源激素的 MS培养基上
进行单根除菌培养，直到获得无菌的毛状根。
1.4 毛状根的 PCR 检测
取能在无外源激素的培养基上快速自主生长的
无菌毛状根 500 mg，按 Ewards 等[10]的方法提取毛
状根基因组 DNA，纯化后用作 PCR 扩增的模板。
以南美蟛蜞菊非转化植株根的基因组总 DNA 作对
照。根据 Furner等[11]发表的序列，设计并合成扩增
rol B、rol C的 PCR引物。根据 Choi等[12]发表的序
列设计并合成扩增 vir C的 PCR引物。Rol B引物：
P1: 5-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3，P2:5-GAA
GGTGCAAGCTA CCTCTC -3；rol C引物：P1:5-CTC
CTG ACA TCA AAC TCG TC-3，P2:5- TGC TTC
GAG TTA TGG GTA CA-3；vir C引物：P1:5-GGC
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TTC GCC AAC CAA TTT GGA GAT-3；P2:5-TTT
TGC TCC TTC AAG GGA GGT GCC-3 (引物由中国
科学院上海细胞生物研究所合成)。
在 0.2 mL的硅化离心管中加入 50 ng模板 DNA，
Taq DNA 聚合酶 2 个单位，PCR 反应总体积为
50 µL。PCR扩增参数如下：rol B、rol C基因扩增
条件相同，其 PCR扩增的反应参数为：94℃热变性
3 min；94℃变性 1 min，53.5℃退火 1 min和 72℃延
伸反应 1 min，进行 35个循环；最后 72℃延伸 10 min。
vir C基因的扩增条件为，94℃热变性 5 min；94℃
变性 45 s，55℃退火 45 s 和 72℃延伸反应 2 min，
进行 30个循环；最后 72℃延伸 7 min。扩增产物采
用 0.8％琼脂糖凝胶电泳和 EtBr 染色进行分析。
1.5 培养过程中培养基蔗糖、硝态氮、无机磷、
Ca2+含量的变化
将来自同一克隆系的生长旺盛的南美蟛蜞菊毛
状根，切成长 4~5 cm、具根尖的毛状根根段，接入
盛有灭菌的 MS 液体培养基中进行培养。起始接种
量约为 0.1 g FW/瓶，在为期 42 d的培养过程中，每
隔 7 d 随机抽取毛状根培养物 3 瓶；收取毛状根，
用无菌水冲洗后、用滤纸吸干毛状根培养物表面的
水分后测定其生物量。将毛状根取样后的 MS 培养
液过滤、去离子水定容后，供测定培养基残余的蔗
糖、硝态氮、无机磷和 Ca2+的含量变化用。其中，
培养基中蔗糖含量的测定、硝态氮含量的测定、无
机磷含量的测定按照文献[13]的方法；培养液中 Ca2+
浓度的 EDTA 络合滴定按照文献[14]的方法。实验
重复测定 3次，取平均值。
2 结果与分析
2.1 南美蟛蜞菊毛状根的诱导和培养
未感染的南美蟛蜞菊幼嫩叶片外植体在无外源
激素的MS+500 mg/L头胞噻肟钠的培养基上连续培
养 25 d后无一生根，仅可见大部分的叶片外植体边
缘变黄或变褐；仅个别叶片外植体的形态学下端切
口中脉处产生少量浅黄绿色致密的愈伤组织。而感
染发根农杆菌的叶片外植体培养 7 d 后，从其叶片
切口中脉处或附近表面产生毛状根 (图 1A)，或从
叶脉处产生的浅黄绿色愈伤组织上产生毛状根；当
从叶片外植体产生的毛状根置于光下培养 10 d后，
毛状根不仅快速生长，而且根呈紫红色 (图 1B)。将
所产生的毛状根切下并置于 MS+500 mg/L 头胞噻
肟钠中单根除菌培养，每隔 7 d 左右转接 1 次，约
5~6 次后即可完全除菌。无菌毛状根可在无外源激
素的 MS 固体或液体培养基上快速自主生长，且具
较多分枝 (图 1C)。所获得的可自主快速生长的毛状
根置于无外源激素的 MS 培养基中继代保存，供进
行遗传转化鉴定用。
2.2 毛状根中 rol 基因的 PCR 扩增
rol B 和 rol C 是发根农杆菌 Ri 质粒
TL-DNA(T-DNA 左臂) 上的两个生根基因，而 vir C
是 Ri质粒中仅参与 T-DNA转化过程但其本身并不整
合进植物基因组中的毒性基因之一。本实验中，采用
对毛状根基因组 DNA进行 vir C基因的 PCR扩增，
以确保毛状根的除菌效果。以 vir C、rol B和 rol C
的引物分别从南美蟛蜞菊非转化根 (自然根)、毛状

图 1 发根农杆菌 ATCC15834 诱导南美蟛蜞菊叶片外植
体产生的毛状根及其培养
Fig. 1 Hairy roots induced from leaf explants of W. trilobata
after infection with A. rhizogenes ATCC15834 and its in vitro
culture. (A) Hairy roots induced from leaf explants 10 days after
infection. (B) Hairy roots from leaf explants cultured under
light. (C) Hairy roots by liquid culture.

图 2 南美蟛蜞菊毛状根 vir C、rol B 和 rol C 基因的 PCR
扩增产物的凝胶电泳分析
Fig. 2 Gel electrophoresis analysis of PCR fragments of vir C,
rol B and rol C genes amplified from the genomic DNA of W.
trilobata hairy roots. 1: 1 kb DNA marker; 2, 6, 9: fragments
amplified from the cells of A.rhizogenes ATCC15834. 3, 5, 8:
fragments amplified from untransformed roots. 4, 7, 10:
fragments amplified from hairy roots.
根基因组 DNA 及发根农杆菌单菌落扩增产物的电
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泳结果如图 2。从图 2可见，利用 rol B和 rol C的
PCR 引物能从南美蟛蜞菊毛状根的总 DNA 及发根
农杆菌 ATCC15834 单菌落克隆中分别扩增到期望
的 540 bp和 770 bp左右的特异性 DNA片段，而从
南美蟛蜞菊非转化根的总 DNA 中扩增不到任何片
段。而以 vir C引物仅能从发根农杆菌 ATCC15834
单菌落中扩增出约 650 bp的条带，而不能从南美蟛
蜞菊非转化根和毛状根中扩增出任何片段。这说
明，发根农杆菌含 rol基因的 RiT-DNA部分已在南
美蟛蜞菊毛状根基因组中整合并得到表达。
2.3 南美蟛蜞菊毛状根的生长特性
将经遗传转化鉴定为阳性的南美蟛蜞菊无菌毛
状根接种至液体 MS培养基中培养 1~2 d后，可观察
到从毛状根根段开始产生出新的乳白色分枝根；而
且随着培养时间的延长，根段不断伸长；同时发现，
随着培养的进行，毛状根的颜色逐渐由白色变为浅
紫色，较老部分呈绿色；培养 28 d后，还可观察到
小部分毛状根的起始根段处开始出现局部轻微褐
化；35 d后，毛状根变得纤细，老化明显加重，色
泽变暗，呈现墨绿色。图 3 为南美蟛蜞菊毛状根在
液体培养过程中的生长变化曲线。从图 3 可见，南
美蟛蜞菊毛状根的生长曲线基本符合“S”型。0~7 d
内处于生长迟滞期；7~21 d为快速生长期；21 d后
进入生长减慢期；35 d后，毛状根生物量增长呈下
降的趋势，此时还可观察到大部分毛状根表面出现
不同程度地褐化，并发现在毛状根培养过程中可能
不断向培养基中分泌次生代谢产物，并最终使培养
基颜色由开始时的无色逐渐变成黄绿色。

图 3 南美蟛蜞菊毛状根液体培养生长曲线
Fig. 3 Growth curve of W. trilobata hairy roots cultured in
liquid MS medium.
2.4 毛状根液体培养过程中培养基蔗糖浓度的消
耗变化
图 4 为南美蟛蜞菊毛状根液体培养过程中培养
基蔗糖的消耗变化。从图 4 可见，在毛状根液体培
养过程中，培养基中蔗糖被快速吸收和利用，表现
在其浓度急剧下降；培养至 7 d 时，培养基中蔗糖
被消耗近 50％；而随着培养时间的延长培养基的蔗
糖浓度不断降低；培养至 35 d时，培养基的蔗糖浓
度仅约为其起始浓度的 3.39％。这表明对南美蟛蜞
菊毛状根生长而言，其培养基中的蔗糖代谢较快，
其代谢周期约为 35 d左右。
2.5 毛状根液体培养过程中培养基 NO3−-N 的消
耗变化
图 5 为南美蟛蜞菊毛状根液体培养过程中培养
基中 NO3−-N的消耗变化。从图 5可见，在毛状根液
体培养的 0~7 d 内，培养基中硝态氮被迅速消耗；
培养至 7 d，培养基的硝态氮含量约为其起始硝态氮

图 4 南美蟛蜞菊液体培养过程蔗糖的消耗变化
Fig. 4 Changes of sucrose content in the medium during liquid
culture of W. trilobata hairy roots.

图 5 南美蟛蜞菊毛状根液体培养过程中培养基中硝态
氮含量的变化
Fig. 5 Changes of NO3−-N content in the medium during
liquid culture of W. trilobata hairy roots.
含量的 5.8％；而培养至 35 d 时，培养基的硝态氮
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含量降到最低，约 0.01 mg/mL，约为培养基起始硝
态氮含量的 1.82％，而此时毛状根的生物量 (鲜重)
也达到最大；但培养 35 d以后，培养基的硝态氮含
量又呈略升高的趋势，至结束培养时培养基的硝态
氮含量仅约为起始浓度的 4.28％。该结果表明，在
液体摇瓶培养时，南美蟛蜞菊毛状根对硝态氮的利
用迅速，其培养基硝态氮的代谢周期约为 35 d。
2.6 毛状根液体培养过程中培养基 Ca2+的消耗
变化
图 6 为南美蟛蜞菊毛状根液体培养过程中培养
基 Ca2+的代谢变化。从图 6 可见，培养基中 Ca2+浓
度随着培养时间的延长逐渐降低，但与培养基硝态
氮的消耗变化相比，毛状根对 Ca2+的吸收和利用速
度相对较慢且不完全；培养至 35 d时，培养基中仍
残存有占起始浓度约 61.3％的 Ca2+。这表明，虽然
钙是南美蟛蜞菊毛状根生长所必需的矿质元素，但
它对钙的吸收和利用要比氮源 (硝态氮) 慢得多。
2.7 毛状根液体培养过程中培养基无机磷的消耗
变化
图 7 为南美蟛蜞菊毛状根液体培养过程中培养
基无机磷的代谢变化。从图 7 可见，培养基的无机
磷被快速消耗，其浓度急剧下降；培养 7 d 后，培
养基的无机磷浓度只约为其起始浓度的 1.76％；这
表明在液体培养过程中毛状根对无机磷的吸收和代
谢很快；而在随后的培养时间内，培养基的无机磷
浓度变化不大。这表明与硝态氮一样，无机磷是南
美蟛蜞菊毛状根生长所必需的矿质元素，而且毛状
根对磷的吸收和利用要比 Ca2+快得多。

图 6 南美蟛蜞菊毛状根液体培养过程中培养基钙含量
的变化
Fig. 6 Changes of Ca2+ content in the medium during liquid
culture of W. trilobata hairy roots.

图 7 毛状根液体培养过程培养液中无机磷含量的变化
Fig. 7 Changes of phosphorus content in the medium during
liquid culture of W. trilobata hairy roots.
3 讨论
利用发根农杆菌 Ri 质粒的遗传转化产生生长
迅速的毛状根，已在人参 P. ginseng、褐脉少花龙
葵 S. nigrum L. var. pauciflorum 和三裂叶野葛
P. phaseoloides 等多种植物中获得成功[1-3]。但至今
为止，未见有关利用发根农杆菌对南美蟛蜞菊遗传
转化获得毛状根的正式报道。在本实验中，利用含
野生农杆碱型 Ri 质粒的发根农杆菌 ATCC15834 对
南美蟛蜞菊的遗传转化，获得了能在无激素培养基
上自主生长的毛状根，而且发现所获得的离体培养
毛状根提取物中分离到可抑制多种种子萌发的具有
化感作用的物质 (另文发表)；同时，所获得的毛状
根为接下来通过毛状根组织培养途径繁殖出具矮化
等性状的、无需修剪的南美蟛蜞菊新品种奠定了实
验和技术基础。此外，在本实验中观察到，发根农
杆菌 ATCC15834感染南美蟛蜞菊叶片外植体后，毛
状根可从叶片外植体的叶脉切口处直接产生，或从
切口处形成的浅黄绿色愈伤组织上产生。然而，
Bercetche等报道，被发根农杆菌感染后，发现毛状
根仅从胡萝卜块根外植体的愈伤组织及烟草茎段外
植体形成的愈伤组织上产生[15]；但也有报道表明，
马铃薯 Solanum tuberosum L.的毛状根可从其叶片和
块茎外植体切口处直接产生，但其茎段外植体被发
根农杆菌感染后，毛状根只从茎段外植体的愈伤组
织上产生[16]，这与本实验的结果不一致。在本实验
中，发根农杆菌 ATCC15834感染南美蟛蜞菊叶片外
植体后，毛状根可从叶片外植体的叶脉切口处直接
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或从形成的浅黄绿色愈伤组织上再产生出毛状根。
而这种差异的产生可能与植物的类型及所取的外植
体的类型等有关。
研究培养基中主要营养元素的代谢变化是建立
和确定南美蟛蜞菊毛状根的最佳离体培养条件及利
用该毛状根进行药用次生代谢物质生产的前提和
基础。蔗糖作为毛状根培养基中最常用的碳源和能
源，以往的研究几乎都集中在研究培养基的蔗糖浓
度对毛状根生长及其次生代谢物积累的影响，而对
毛状根培养过程中蔗糖本身的代谢或消耗速率的
变化与毛状根生长的关系研究较少[17-18]。在何首乌
Polygonium multiflorum Thunb毛状根培养过程中，
培养基中蔗糖的消耗变化与毛状根的生长速率呈正
相关[17]。而胡之璧等在培养丹参 Salvia miltiorrhiza
Bge毛状根时发现，培养基的蔗糖在 16 d内消耗完
毕[18]。此外，在玫瑰茄 Hibiseus sabdariffa L.细胞悬
浮培养时也发现，培养基的蔗糖在培养至 16 d时已
全部被吸收利用[19]。而三裂叶野葛毛状根液体培养
0~4 d 的生长停滞期内，培养基的蔗糖被消耗了极
少部分，但在培养 4~16 d的毛状根生长时期，培养
基的蔗糖被迅速消耗；培养至 16 d时几乎被消耗完
毕 [20]，而这与本实验的结果类似。在本实验中，培
养基的蔗糖被快速吸收和利用，培养至 7 d 时，培
养基中蔗糖被消耗近 50％；而随着培养时间的延长
培养基的蔗糖浓度不断降低；培养至 35 d时，培养
基中的蔗糖浓度仅约为其起始浓度的 3.39％。然而，
在培养火焰菜 Beta vulgaris L.毛状根时发现，在接
种后 3 d 内，毛状根还处于生长停滞期时，培养基
的蔗糖就会被迅速消耗，其蔗糖浓度急剧下降，降
幅达 50％[21]。而郭志刚等在培养栝楼 Trichosanthes
kirilowii Maxim.毛状根时也发现，接种后 3~4 d的生
长停滞期内，毛状根的生物量积累虽很小，但其培
养基中的蔗糖浓度却快速下降[22]。这显然与本实验
的结果不一致。作者认为，这种差异的产生说明培
养基的蔗糖消耗可因植物种类和培养体系的不同而
有所差别。
硝态氮是毛状根培养基中最重要的氮源之一。
迄今为止，关于培养基中氮源 (硝态氮和铵态氮) 的
含量或种类及其配比对毛状根的生长及其次生代谢
产物的影响已有一些研究报道[23-25]。如高浓度氮会
抑制总黄酮合成，而硝态氮在总氮中含量大于 50％
时更有利于水母雪莲 Saussurea medusa Maxim毛状
根的生长和次生物质总黄酮的积累[23]。而且发现，
培养基中硝态氮和铵态氮的比率还能明显影响颠茄
Atropa belladonna L.毛状根的生长及其次生物质东
莨菪碱/天仙子胺的比率；而降低培养基的硝态氮浓
度还可促进毛状根中生物碱的产生[24]。此外，在培
养基中添加 NO3−能使 Datura candida × D. aurea毛
状根的生物量增加及显著提高天仙子胺生物碱的含
量，但同时会使毛状根的东莨菪碱 (Scopolamine)
含量明显降低[25]。可见，培养基的氮含量是影响毛
状根生长及其代谢的一个非常重要的因素。然而，
相比之下，对毛状根培养过程中培养基氮源本身的
消耗速率与毛状根生长的关系的研究较少。在培养
栝楼 T. kirilowii 毛状根时，培养基中铵态氮和硝态
氮随着生长的进行而被逐渐消耗，在培养 24 d时铵
态氮已被完全消耗，而此时仍有 17％的硝态氮未被
消耗和利用 [22]；然而，在高山红景天 Rhodiola
Sachalinensis A. Bor. 细胞悬浮培养中却观察到，其
培养基中 NO3−/NH4+浓度比几乎为一恒定值[26]。而
三裂叶野葛毛状根液体培养 20 d后，其培养基的硝
态氮和铵态氮均被消耗殆尽[20] 。而这些与本实验的
结果不完全一致。在本实验中，在南美蟛蜞菊毛状
根液体培养的 0~7 d 内，培养基的硝态氮被迅速消
耗；培养至 7 d 时，培养基的硝态氮含量只剩下起
始硝态氮含量的 5.8％；而培养至 35 d 时，培养基
的硝态氮含量降到最低，约 0.01 mg/mL，约占培养
基起始硝态氮含量的 1.82％；但培养 35 d以后，培
养基中的硝态氮含量又呈略升高的趋势，至结束培
养时培养基的硝态氮含量约占起始浓度的 4.28％。
而这种差异的产生可能与毛状根的类型及植物种类
等有关。而在毛状根生长达到高峰以后，培养基的
硝态氮含量出现回升，这可能与毛状根的老化导致
细胞死亡自溶并向培养液释放硝态氮有关。
与氮一样，磷(P) 也是毛状根生长发育及其次
生代谢调节的必需元素，它的消耗变化或供给状态
可反映或影响毛状根的生长和代谢状况。目前对于
384 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech March 25, 2010 Vol.26 No.3

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可离体自主生长的毛状根而言，有关其培养过程中
培养基磷的消耗变化已有少量研究报道。如三裂叶
野葛毛状根培养 16 d 时培养基中的 PO43−被消耗殆
尽[20]。而在培养长春花 Catharanthus roseus L.毛状
根时发现，培养基的磷酸盐在培养 8 d 后就被全部
消耗完毕[27]。而王玉春等[28]发现，在青蒿 Artemisia
annua L.毛状根的液体培养过程中，培养液的铵态
氮、硝态氮和磷酸盐的消耗变化都与毛状根的生长
成正相关，其中尤以磷酸盐的消耗最快，约在接种
后 15 d被完全吸收。而这与本实验的结果不完全一
致。在本实验中，南美蟛蜞菊毛状根液体培养过程
中培养基的无机磷被快速消耗，其浓度急剧下降，
培养 7 d 后，培养基的无机磷浓度就下降至只约为
其起始浓度的 1.76％，表明南美蟛蜞菊毛状根对磷
的代谢很快。
与磷一样，钙也是植物细胞生长发育必需的矿
质元素之一。有研究表明，培养基中的 Ca2+浓度或
Ca2+拮抗剂等能提高水蓼 Polygonum hydropiper L.
悬浮细胞黄酮醇的产量[29]或促进长春花 C. roseus L.
毛状根中吲哚生物碱的产生和释放[27]。而在三裂叶
野葛毛状根培养过程中发现，培养基的 Ca2+可被毛
状根逐渐吸收和利用，但与培养基的磷酸盐、铵态
氮和硝态氮的消耗变化相比，毛状根对 Ca2+的吸收
速度慢且利用不完全[20]。而这与本实验的结果类似。
在本实验南美蟛蜞菊毛状根液体培养过程中，培养
液的 Ca2+含量也呈现逐渐下降趋势，但毛状根对
Ca2+的吸收和利用速度相对较慢且不完全；甚至
培养至 35 d 时，培养基中仍残存有占起始浓度约
61.3％的 Ca2+。
本实验结果表明，培养基的蔗糖、硝态氮、磷、
钙离子的消耗变化可因植物毛状根的种类和培养体
系的不同而有所差别，而通过对培养基中蔗糖、硝
态氮、磷、钙离子的消耗变化的测定，将能为大规
模培养毛状根时确定培养周期以及整个培养周期中
碳源、氮源、钙盐等的供给量提供理论依据和技术
参数。本实验结果为今后利用南美蟛蜞菊毛状根的
规模培养来生产具化学它感作用的次生物质，以及
通过毛状根组培途径快繁出节间缩短的矮化新品种
奠定了实验和技术基础。
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