全 文 ：第 30卷　第 3期
2009年 9月
内 蒙 古 农 业 大 学 学 报
JournalofInnerMongoliaAgriculturalUniversity
Vol.30　No.3
Sep.2009
蒙古口蘑高密度发酵及其多糖性质的研究＊
邢仁昌 1, 2 , 　闫　伟 1＊
(1.　内蒙古农业大学林学院 ,呼和浩特　010019;2.　北京生物医药研究所 ,北京　100091)
摘要:　通过对蒙古口蘑菌株 Q
97
在 5 L发酵罐发酵工艺的优化 , 以及 250 L发酵罐发酵放大试验 ,确定发酵罐最佳
发酵培养基配方为豆饼粉 30g/L,蔗糖 80g/L, K2HPO4 1g/L, CaCO3 1g/L。接种量 5%,发酵周期为 6d～ 8d,生物量
可以达到 45g/L,胞外多糖可以到 300 mg/L。利用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)对蒙古口蘑水溶性多糖的分子量
进行测定 , 证明蒙古口蘑水溶性多糖至少含有 5种多糖组分 , 其主要组分重均分子量 Mw=3919。
关键词:　蒙古口蘑;　高密度发酵;　水溶性多糖;　分子量
中图分类号:　Q949.3　　　文献标识码:　A　　　文章编号:1009-3575(2009)03-0015-05
HIGH-DENSITYFERMENTATIONANDPOLYSACCHARIDECHARACTERISTICOFTricholomaMongolicum
XINGRen-chang1, 2 , 　YANWei1
(1.　CollegeofForestry, InnerMongoliaAgricultureUniversity, Hohhot　010018, China;
2.　BeijingInstituteofBiomedicine, Beijing　100091, China)
Abstract:　ThefermentationprocessofTricholomamongolicumQ97 wasoptimizedusinga5Loffermentor, andthemagnificationex-perimentbya250Loffermentorwascarriedout.Theexperimentresultsshowthattheoptimumfermentationmediumformulaisasfol-
lows:30g/Lofbeancakepowder, 80g/Lofsucrose, 1g/LofK
2
HPO
4
, and1g/LofCaCO
3
.Themyceliumbiomasscouldreachto
45g/Lwith300 mg/Lofexopolysaccharideproducedwhenfermentationperiodrangedfrom6to8dayswith5% ofinoculationvolume.
Themolecularweightofwater-solubilitypolysaccharideproducedbyTricholomamongolicumQ97 wasmeasuredwithhigh-perform-ancegel-permeationchromatography(HPGPC).TheresultsrevealedbyrefractiveindexdetectorshowthatpolysaccharideofTri-
cholomamongolicumincludesatleastfivevarietiesofcomponents, andweightaveragemolarmassofitsmaincomponentis3919.
Keywords:　Tricholomamongolicum;　high-densityfermentation;　water-solubilitypolysaccharide;　molecularweight
　　蒙古口蘑(TricholomamongolicumImai.),又称
口蘑 、白蘑 、草原白蘑 、蒙古白蘑等 ,子实体大中型 ,
菌肉肥厚 ,质地细致 ,郁香醇正 ,味道鲜美 [ 1] ,是我国
北方草原天然蘑菇之最上品 ,畅销国内外市场 ,深受
消费者欢迎 。近年来 ,对蒙古口蘑在蘑菇圈特殊生
态现象 [ 2 ～ 7]与促植物生长效应[ 8 ～ 10]的研究报道较
多 ,也有研究报道 ,蒙古口蘑凝集素具有特异性抑制
肿瘤细胞 、刺激血管扩张 、降低血压的作用 [ 11 ～ 16] ,由
菌丝分离得到的多糖肽复合物具有增强免疫力和抗
肿瘤活性的作用 [ 17] 。
本研究通过 5L发酵罐发酵工艺优化 ,获得发酵
罐最佳培养基配方及发酵工艺 ,缩短了蒙古口蘑菌
丝体的发酵周期 ,提高单位体积培养液中菌体生物
量(Biomass, BIO)与胞外多糖 (exopolysaccharide,
EPS)产率 。通过 250 L发酵罐放大试验 ,使蒙古口
蘑菌丝体在 250 L发酵罐内达到高密度发酵水平 ,
为进一步工业化大生产提供了科学依据。
加热提取蒙古口蘑发酵液及菌丝体内水溶性多
糖 ,超滤陶瓷膜过滤 、浓缩提取液中的多糖 ,醇沉法
获得口蘑粗多糖 , Sevag法[ 18]除去多糖中的蛋白质 ,
＊ 收稿日期:　2009-06-15基金项目:　内蒙自然科学基金重大项目(200607010501);教育部高等学校科技创新工程重大项目培育资金项目(707014);国家自然科学基金资助项目(30660150)作者简介:　邢仁昌(1970-),男 ,副研究员 ,博士研究生 ,主要从事微生物发酵与微生物鉴定研究.＊通讯作者:　E-mail:weiyan@imau.edu.cn
应用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定蒙古口蘑多
糖的分子量及其分布 ,为进一步对蒙古口蘑多糖单
组份分离以及药理活性的相关性研究了打下了基
础 。
1　材料与方法
1.1　菌种
蒙古口蘑菌株 Q97:由内蒙古农业大学菌根实验
室分离自锡林郭勒白音锡勒草原采集的蒙古口蘑子
实体。
1.2　培养基
1.2.1　发酵罐种子培养基　蔗糖 20g,豆饼粉 20g,
泡敌 0.3 mL,自来水 1 000 ml, pH自然 , 121 ℃,
30min灭菌 。
1.2.2　发酵罐基础培养基　豆饼粉 30g,蔗糖 50g,
K2HPO4 1g, CaCO3 1g, 泡敌 0.5 mL, 自来水 1 000
ml, pH自然 , 121℃, 30min灭菌。
1.3　分析方法
1.3.1　生物量(BIO)的测定　取 10mL发酵液双层
纱布过滤 ,蒸馏水冲洗 ,菌丝体 60 ℃烘干至恒重 ,电
子分析天平称重 。
1.3.2　胞外多糖(EPS)的测定 　取发酵滤液 10
mL, 5 000 r/min, 20 min离心 ,取上清 3 ml,加 95%
乙醇 10 ml,混匀后封口 4 ℃冰箱过夜 ,离心 ,去掉上
清液 ,加入 3ml蒸馏水摇匀后硫酸 -蒽酮法测定多
糖含量 [ 19] 。
1.3.3　发酵液总糖测定方法　发酵液总糖的测定
用硫酸 -蒽酮法 [ 20] 。
1.3.4　高效凝胶渗透色谱法制备多糖标准曲线　
取 DextranT-10、T-20、T-40、T-70、T-500系列
标准分子量多糖样品 ,用 0.1 MNa2SO4分别配制成
3 mg/mL的溶液 ,作为标准多糖溶液 。
流动相:0.1 MNa2SO4溶液 ,流速:0.5mL/min,
柱温:30 ℃, 进样量:20 μL, 凝胶色谱色谱柱:
TOSOHTSKgelG4000PWxl+G3000PWxl串联 ,检测
器:SPD-M10Avp二极管阵列检测器和 RID-10A
示差折光检测器串联 。
取标准多糖溶液分别进样 ,记录示差检测器检
测洗脱峰的保留时间由 HPGPC专用软件绘制标准
曲线见图 9。以标准分子量的对数值为纵坐标 ,以相
应色谱峰的保留时间为横坐标进行线性回归 ,得标
准曲线方程:logMw=-0.157tR +9.57。分散度:
0.027。式中 Mw为标样的重均分子量 , tR为标样的
保留时间。
1.4　实验方法
1.4.1　发酵罐种子培养　5L发酵罐装入 3L发酵
罐种子培养基 ,灭菌后 ,将二级摇瓶种子接种到种子
罐中 , 10%接种量 , 300r/min, 1:1通气量 , 25℃培养。
从第 3d每 24h取样 1次 ,测定生物量 。
1.4.2　发酵培养　5 L发酵罐装入 3.5 L发酵罐基
础培养基 ,灭菌后 ,通气量 2 L/min,初始转速 200r/
min,罐温 25℃,通过改变接种量(1%、5%、10%)和
改变总糖量(基础蔗糖量提高到 9%、发酵过程中补
加 4%的蔗糖)考察 5种设计对发酵周期 、生物量及
胞外多糖的影响。 24h取样 1次 ,检测发酵液生物
量 、总糖 、胞外多糖 ,溶解氧(DO)、pH值 、罐温 、转速
等参数自动在线监测记录。
250 L发酵罐装液量 150 L,培养基为:豆饼粉
30 g/L,蔗糖 80 g/L, K2HPO4 1 g/L, CaCO3 1 g/L。
25 ℃,罐压 0.05 MPa, 12h取样 1次 ,检测发酵液生
物量 、总糖 、胞外多糖 ,温度 、pH值 、DO、转速 、通气
量等参数自动在线监测记录 。
1.4.3　蒙古口蘑多糖的提取与分离　发酵液 85℃
加热 1h, 0.2 μm陶瓷膜过滤 ,得到水溶性蒙古口蘑
多糖溶液。 300 KD陶瓷膜滤过以除去大分子蛋白
等杂质 ,然后用 1 KD纳滤膜对滤过液进行浓缩 ,除
去大部分小分子糖 、氨基酸 、无机盐等 ,往多糖浓缩
液加入 95%的乙醇至乙醇浓度为 70%,摇匀后封口
4℃冰箱过夜 ,离心收集沉淀物 ,干燥 ,即得到蒙古口
蘑粗多糖。
取适量粗多糖加水溶解后 ,采用 Sevag法[ 18]去
除多糖中蛋白 ,经醇析 、离心 、真空冷冻干燥后得水
溶性多糖粉末。
1.4.4　蒙古口蘑多糖的分子量测定　称取蒙古口
蘑多糖粉末 200.0 mg溶于 10 mL0.1 MNa2SO4溶
液中配制成 20 mg/mL的多糖溶液 ,高效液相色谱仪
20 μL进样 ,示差检测器检测 ,记录检测洗脱峰保留
时间 ,由 HPGPC专用软件对比标准曲线做图 ,根据
HPGPC标准曲线及供试品的保留时间 ,采用 HPGPC
软件计算样品各组分的重均分子量(Mw)、数均分子
量(Mn)。
2　结果与分析
2.1　发酵罐种子种龄的确定
根据生物量做生长曲线如图 1所示。从结果可以
看出 , 3级种子从第 5d进入对数生长期 ,到第 12d生物
量达到最大 , 12d后进入生长稳定期 ,根据经验选取培
养 10d～ 12d的 3级种子作为发酵罐种子。
16 内 蒙 古 农 业 大 学 学 报　　　　 　　　　　　　　2009年
图 1　蒙古口蘑菌株 Q97三级种子生长曲线
Fig.1 Growthcurveofthird-levelseedsforthestrainQ97
2.2　5L发酵罐发酵条件优化
2.2.1　改变 5L发酵罐发酵接种量测定及记录结果 ,
接种量 1%发酵参数曲线见图 2。接种量 5%发酵参数
曲线见图 3。接种量 10%发酵参数曲线见图 4。
图 2　接种量 1%发酵参数曲线
Fig.2 Fermentationparameter
curveswithaninoculationvolumeof1%
结果表明 , 1%的接种量(图 2),在培养过程中
发酵液 pH值逐渐升高 ,生物量及胞外多糖在整个培
养过程中没有快速增加 ,当发酵液 pH值升高到超过
8.0时 ,发酵液溶氧开始上升 ,说明菌丝体生长活力
减弱 ,当发酵液 pH值超过 9.0时从发酵液溶氧水平
及生物量检测结果显示发酵周期结束;5%的接种量
(图 3),在培养过程初期 ,发酵液 pH值亦会升高 ,但
当菌丝体快速生长后 , pH值会快速下降到 1个适合
口蘑菌丝体生长范围 ,这时生物量快速增加 ,总糖也
随之大量消耗 ,发酵液 pH值也快速下降 ,在发酵周
期 260h后降到 4.0左右 ,这时发酵液内总糖消耗到
1个较低的水平 ,生物量及胞外多糖不再增加 ,发酵
周期结束 ,在培养的中后期 ,由于菌丝体迅速生长 ,
消耗了大量的氧 ,需要适时调节发酵罐转速和通气
量 ,使溶氧保持在 30以上 ,以保证菌丝体的正常生
长及代谢;10%的接种量(图 4),发酵液 pH值会随
着菌丝体的生长而快速下降 ,当 pH值降到 4.0以下
时菌丝体异常发酵 ,从而导致发酵周期结束 。从以
上结果可以看出 ,接种量是影响蒙古口蘑菌丝体液
体发酵结果的重要因素之一 。
图 3　接种量 5%发酵参数曲线
Fig.3 Fermentationparameter
curveswithaninoculationvolumeof5%
图 4　接种量 10%发酵参数曲线
Fig.4 Fermentationparameter
curveswithaninoculationvolumeof10%
图 5　 9%基础蔗糖发酵参数曲线
Fig.5 Fermentationparametercurveswith
fermentationmediumcontaining9% sucrose
17第 3期　　　　　　　　　　　　　邢仁昌等:　蒙古口蘑高密度发酵及其多糖性质的研究
2.2.2　改变 5 L发酵罐发酵总糖量测定及记录结
果 ,基础蔗糖量提高到 9%见图 5。发酵过程中分两
次补加共 4%的蔗糖见图 6。
结果表明 ,增加总糖量 ,会增加生物量与胞外多
糖的产量 ,尤其是胞外多糖的产量大幅度提高 ,说明
适当增加蔗糖量有利于胞外多糖的积累。而本实验
设计的增加总糖的两种方式 ,对生物量与胞外多糖
产量的影响并不显著 ,而增加基础蔗糖相对于补加
蔗糖 ,发酵周期有提前的趋势。另外 , 9%的基础蔗
糖到发酵结束时 ,测定发酵液中仍含有大于 2%的总
糖 。综上所述 ,为缩短发酵周期 ,减小发酵罐的染菌
几率 ,提高蔗糖利用率 ,将发酵罐配方调整为:豆饼
粉 30g/L,蔗糖 80g/L, K2HPO4 1 g/L, CaCO3 1 g/L,
培养过程中不补加蔗糖。
图 6　补加 4%蔗糖发酵参数曲线
Fig.6 Fermentationparametercurveswith4%
sucroseaddedintothebasefermentationmedium
2.3　250L发酵罐扩大试验
250L发酵罐测定及记录结果见图 7。
图 7　蒙古口蘑菌株 Q97 250L发酵罐发酵参数曲线
Fig.7 Fermentationparametercurvesfor
thestrainQ97 ina250Loffermentor
实验结果表明:250L发酵罐经约 160h的培养 ,
发酵罐生物量最大值可以稳定到 45 g/L,胞外多糖
最大产量可以稳定到 300mg/L。
2.4　蒙古口蘑水溶多糖分子量
蒙古口蘑多糖溶液高效液相示差检测器检测洗
脱峰保留时间结果见图 8,由 HPGPC专用软件对比
标准曲线做图见图 9,根据 HPGPC标准曲线及供试
品的保留时间 ,采用 HPGPC软件计算样品各组分的
重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)见附表。
图 8　蒙古口蘑多糖的示差检测器色谱图
Fig.8 Chromatographicmappingof
TricholomaMongolicumpolysaccharide
图 9　葡聚糖标准曲线
Fig.9 Standardcurveforglucan
附表　蒙古口蘑多糖样品峰的保留时间及分子量
Tab.1 Molecularweightandretentiontimeof
TricholomaMongolicumpolysaccharide
多糖
样品
tR
(min)
重均
分子量
(Mw)
数均
分子量
(Mn)
分子量
分布系数
(Mw/Mn)
峰 1 27.134 259 320 214 243 1.21
峰 2 30.667 58 438 57 219 1.02
峰 3 32.847 25 061 21 878 1.15
峰 4 38.824 3 919 3 532 1.11
峰 5 40.218 1 553 1 436 1.08
　　结果表明 ,从示差检测器检测蒙古口蘑多糖洗
脱结果 ,共得到 5个洗脱峰 ,证明蒙古口蘑多糖至少
含有 5种多糖组分 ,但每个组分所占比例不同 ,其中
重均分子量为 259 320、58 438、25 061和 1 553的组
分在总多糖中所占比例较小 ,主要组分为峰 4,其重
18 内 蒙 古 农 业 大 学 学 报　　　　 　　　　　　　　2009年
均分子量 Mw=3 919,数均分子量 Mn=3 532。
3　讨论
蒙古口蘑菌丝体在利用豆饼粉作为氮源时 ,如
果降解豆饼粉产生氨基氮的速度大于菌丝体利用的
速度 ,多余的氨基氮会导致发酵液 pH值升高 。当接
种量较少时 ,随着菌丝体的萌发生长 ,豆饼粉分解产
生的氨基氮不能完全被菌体消耗 ,使发酵液 pH值不
断升高 ,由于接种量小菌丝体不能快速增加 ,致使氨
基氮越积越多 ,最后导致发酵液 pH值超出了菌丝体
的耐受范围 ,菌丝体活力下降 ,发酵结束;当接种量
较适合时 ,菌丝体生长初期 ,菌丝体分解豆饼粉产生
氨基氮亦会导致发酵液 pH值升高 ,由于加大接种量
菌丝体萌发后生长便会消耗掉这些氨基氮 , pH值也
随之下降到 1个适合蒙古口蘑菌丝体生长范围;当
接种量提高到 10%时 ,菌丝萌发生长后分解豆饼粉
产生的氨基氮便会被菌体快速利用 ,不会导致发酵
液 pH值升高 ,接种量提高可以使菌丝体在罐中的对
数生长期提前 ,适当的增加接种量可以缩短发酵周
期 ,但是接种量过大会导致发酵液 pH值降低过快 ,
发酵液 pH值降到 4.0以下 ,会影响菌丝体的正常生
长 ,从而导致发酵周期结束 ,也不能达到好的发酵结
果 。
蒙古口蘑菌丝体能够在较高的蔗糖浓度下生长
良好 ,发酵时增加蔗糖浓度胞外多糖的产量较之未
增加蔗糖的罐批增加了 1倍以上 ,说明蔗糖是合成
胞外多糖重要碳源。由于蒙古口蘑能够耐受较高浓
度的蔗糖 ,所以 ,发酵过程中补加蔗糖与在基础发酵
培养基中添加并无明显差别 ,增加基础蔗糖的浓度
有利于发酵工艺的简化 ,降低罐批染菌的几率。通
过 250 L发酵罐放大试验结果可以看出 ,蒙古口蘑
菌丝体的高密度发酵比较易于发酵罐发酵工艺的放
大 。
蒙古口蘑水溶性多糖主要成分为分子量小于 1
万的小分子多糖 ,如果用适当孔径的陶瓷膜过滤膜
过滤 、浓缩或者采用分步沉淀法 ,可以得到大量纯度
较高的小分子多糖组分 ,便于进一步的药理活性研
究 。
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