全 文 ：— 28 — 现代中药研究与实践2013年第27卷第2期Chin Med J Res Prac,2013 Mar.Vol.27 No.2
·药理药化·
灯台叶醇提物体外抗肿瘤作用研究
韩　芳
（南京市白下区建中中医院，江苏 南京 210004）
摘　要：目的 研究灯台叶醇提物对体外肿瘤细胞增殖和凋亡的影响，以及对鸡胚尿囊膜血管生成的
抑制作用。方法 采用MTT法检测灯台叶醇提物对体外培养肿瘤细胞（人卵巢癌细胞C200、人乳腺癌细
胞MNK-7、人肝癌细胞 SNU-398）的抗肿瘤作用；以 PI/Annexin-V 染色检测灯台叶醇提物对人乳腺癌
细胞MNK-7 凋亡的影响；以鸡胚尿囊膜血管生成（CAM）实验，研究灯台叶醇提物对新生血管生成的抑
制作用。结果 灯台叶醇提物在 0.1 ～ 2.0 mg/mL 对各肿瘤细胞的增殖有显著抑制作用，2.0 mg/mL 灯台叶
醇提物对人乳腺癌细胞增殖抑制率达到 83.6% ；2.0 mg/mL 灯台叶醇提物作用后人乳腺癌细胞凋亡率达到
62.5% ；灯台叶醇提物在 1～ 1000 μg/mL 对鸡胚尿囊膜血管生成有显著抑制作用，给药鸡胚的新生血管数
减少，其中 10 μg/mL 抑制率最高，一级血管抑制率为 52.1%，二级血管抑制率为 48.3%。结论 在实验给
药浓度下，灯台叶醇提物对受试肿瘤细胞的增殖具有较强抑制作用，对鸡胚尿囊膜血管生成有显著抑制作用。
关键词：灯台叶醇提物；抗肿瘤；抑制血管生成；鸡胚尿囊膜；MTT法；凋亡
中图分类号：R285 文献标识码：A 文章编号：1673-6427(2013)02-0028-03
Study on Antitumor Effect of the Ethanol Extract of Alstonia Scholaris in Vitro
HANG Fang
(BaiXia District Jianzhong Hospital of Nanjing, Nanjing 210004, China)
Abstract: Objective To study the effect of Alstonia scholaris (AS) on tumor proliferation and apoptosis in
vitro and chorioallantoic membrane (CAM) angiogenesis. Methods The effect of AS on the proliferation of cancer
cells (C200, MNK-7, and SNU-398) were evaluated by MTT assay. The CAM angiogenesis model was established
to determine the inhibitive effect of AS against angiogenesis. Results AS showed a signifi cant inhibitive effect
on tumor cells proliferation at doses of 0.1~2.0 mg/mL. With the dose of 2.0 mg/mL, the inhibition ratio of AS
was 83.6% on hepatoma carcinoma cell MNK-7; AS signifi cantly affected chick embryonic angiogenesis in doses
range of 1~1000 μg/mL and induced a reduction in the capillary plexus of the CAM. The central and secondary
capillaries were reduced by 52.1% and 48.3% respectively, at the dose of 10 μg/mL. Conclusion AS showed
signifi cant inhibition effect on tumor proliferation and chorioallantoic membrane angiogenesis in the doses of this
study.
Key words: Alstonia scholaris (AS); antitumor; anti-angiogenesis; chicken chorioallantoic membrane; MTT
; Apoptosis
收稿日期：2012-07-11
作者简介：韩芳，主管中药师。E-mail:wpaasj@126.com
灯台树Alstonia scholaris R. Br. 为夹竹桃科鸡骨
常山属植物，分布云南、广东和广西等地。灯台叶
是云南傣族传统药物，味苦，性凉，有消炎、祛痰、
止咳的功能，并有一定的平喘作用。用灯台叶的总提
物所作制剂，临床用于咳喘疾病疗效显著 [1,2]。恶性
肿瘤是危害人类健康最严重的疾病之一，且其发病率
呈逐年上升趋势 [3,4]，近年来对灯台叶的抗肿瘤作用
关注较多 [5]，本实验观察了灯台叶醇提物在体外对人
卵巢癌细胞 C200、人乳腺癌细胞MNK-7、人肝癌细
胞 SNU-398 的抑制作用，旨在观察其体外抗肿瘤活
性以及对新生血管的影响，研究灯台叶醇提物抗肿瘤
作用并探索其作用机制。
1　材料和方法
1.1　试验药物
DOI:10.13728/j.1673-6427.2013.02.016
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灯台叶购自安徽省亳州市联华医药有限公司，原
料粉碎，醇提两次后合并滤液，抽滤除渣，50℃减压
蒸馏回收乙醇，等灯台叶乙醇粗提物浸膏，自然干燥
后低温烘干后研成粉末备用。
1.2　细胞株
人卵巢癌细胞 C200、人乳腺癌细胞MNK-7、人
肝癌细胞 SNU-398 由中国医学科学院药物研究所药
理室提供。
1.3　试剂与仪器
胎牛血清，DMEM 培养基（GIBCO 公司），胰
蛋白酶（Trypsin，南京生兴生物技术有限公司），
MTT，环磷酰胺（美国 Sigma 公司），氟尿嘧啶注射
液（南京凯基生物技术有限公司），细胞培养板（美
国 Corning 公司），倒置显微镜 XSZ-D2（重庆光学
仪器厂）。酶标仪，二氧化碳培养箱均购自（美国
Thermo Electron公司），FACS Calibur 型流式细胞仪（美
国 BD公司）。
2 　方法
2.1　灯台叶醇提物对体外培养肿瘤细胞的抑制作用
MTT 法检测，将传代后处于对数增殖期的肿瘤
细胞，经 0.25% 胰蛋白酶消化，用含 10% 胎牛血清
的 DMEM培养液制成单细胞悬液，细胞以 1×105/ 孔
的密度接种于 96 孔板，每孔加入细胞悬液 100 μL，
在 5% CO2、37℃条件下培养 24 h 后，每孔加入 100
μL 质量浓度分别为 0.1、0.5、1.0、2.0 mg/mL 的灯
台叶醇提物溶液；阳性对照组和空白对照组分别加入
100 μL / 每孔 5-Fu（80 mg/L）和 DMEM培养液。加
药后细胞培养 24 h，然后每孔加入MTT 溶液 5 μL，
继续培养 3 h 后，加入 150 μL DMSO 终止。用酶标
仪在 570 nm 波长处（参比波长 650 nm）测定吸光度
值（A值），计算抑制率。
2.2　PI/Annexin-V 染色检测肿瘤细胞凋亡
取对数生长期的人乳腺癌细胞MNK-7 接种于 6
孔培养板中（1×106/ 孔），分别加入 0.1、0.5、1.0、
2.0 mg/mL 的灯台叶醇提物溶液，重复 3孔。分别作
用24，48 h后，收集各组细胞。用PBS液洗涤2次后，
按 PI/Annexin-V 细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，
采用流式细胞仪 FACS 检测，并利用 CellQuest 软件
进行参数获取和数据分析。
2.3　灯台叶醇提物对鸡胚尿囊膜血管生成的影响 [6,7]
将种蛋置于（38.0±0.5）℃，相对湿度 60% 的
恒温箱中孵育，每天翻蛋 2次。鸡胚发育第 8 d，选
取发育良好的鸡胚，无菌操作下在外壳上开 1 个约
10 mm×10 mm 窗口，暴露尿囊膜。将种蛋消毒，开
窗。开窗成功的鸡胚随机分组，每组 10 只，在鸡胚
尿囊膜表面远离尿囊膜血管的空白处分别加入质量
浓度为 1、10、100、1000 μg/mL 的灯台叶醇提物溶
液，以环磷酰胺（500 μg/mL）为阳性对照。用消毒
的透明胶布密封窗口，放入孵化箱内继续孵化。继
续孵育 48 h 后，选取活胚，暴露加药区尿囊膜，滴
加数滴固定液（甲醛 : 丙酮为 1 ∶ 1），室温固定 20
min 后，剪下鸡胚尿囊膜，于光学显微镜下观察。记
数视野内的尿囊膜血管一级与二级分支数。比较各组
血管分支数，作为评价血管密度的指标。抑制率（%）
=1 －给药血管数 / 空白血管数。
3　统计学处理
应用 SPSS 10.0 软件对结果数据进行统计分析，
结果采用χ±s 表示，组间比较采用 t 检验。P<0.05
有统计学意义。
4　结果
4.1　灯台叶醇提物对肿瘤细胞增殖的影响
灯台叶醇提物对人卵巢癌细胞 C200、人乳腺癌
细胞 MNK-7、人肝癌细胞 SNU-398 增殖的影响在
0.1 ～ 2.0 mg/mL 浓度范围内，随药物质量浓度的增
大，各肿瘤细胞的存活率降低，药物的抑制作用增
强，呈浓度依赖性，给药组与对照组比较，差异具
有统计学意义（P＜ 0.01）。灯台叶醇提物对 C200、
MNK-7、SNU-398 肿瘤细胞的 IC50 分别为 632.3、
614.3、660.2 μg/mL，灯台叶醇提物对人乳腺癌细胞
MNK-7 增殖的抑制作用较强。阳性对照组 5-Fu（80
mg/L）对 C200、MNK-7、SNU-398 肿瘤细胞的增殖
抑制率分别为 57.9%、47.8%、48.7%。如图 1所示。
图 1 灯台叶醇提物对各肿瘤细胞增殖的影响
Fig. 1 Inbihitive effects of AS on tumor cells proliferation
注：与对照组比较，** P ＜ 0.01，* P ＜ 0.05（下同）
4.2　灯台叶醇提物对肿瘤细胞凋亡的影响
从MTT 增值实验看出灯台叶醇提物对人乳腺癌
细胞 MNK-7 的抑制作用较强，我们选取该细胞株
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进行 PI/Annexin-V 染色，从而检测对肿瘤细胞凋亡
的影响。在 0.1 ～ 2.0mg/mL 浓度范围内，随药物质
量浓度的增大，MNK-7 细胞凋亡变多，呈浓度依
赖性，给药组与对照组比较，差异具有统计学意义
（P＜ 0.01）。阳性对照组 5-Fu（80 mg/L）作用后，
MNK-7 肿瘤细胞的凋亡率为 34.2%。
图 2 灯台叶醇提物对人乳腺癌细胞MNK-7 凋亡的影响
Fig. 2 The effect of AS on MNK-7 apoptosis
4.3　灯台叶醇提物对新生血管生成的影响
灯台叶醇提物作用 48 h 后记录鸡胚尿囊膜的一
级血管数、二级血管数。结果显示阴性对照组血管生
长良好；灯台叶醇提物给药组及阳性对照组鸡胚尿囊
膜血管数目明显少于对照组，CAM新生血管生成受
到了不同程度的抑制（表 1），且与空白组比较，差
异具有统计学意义（P＜ 0.01）。本实验浓度范围内
的抑制率与药物剂量无显著量效关系，给药浓度低于
10 μg/mL 时，随着药物浓度的升高，其抑制新生血
管生成的作用逐渐增强，10 μg/mL时药物作用最强，
对一级血管的抑制率为 52.1%，对二级血管的抑制率
为 48.3%，在 100 和 1000 μg/mL 给药浓度时，其抑
制作用又呈下降趋势（表 1）。阳性对照环磷酰胺组
对 CAM一级血管生成抑制率为 60.6%，二级血管生
成抑制率为 56.5%。
表 1 灯台叶醇提物对新生血管生成的影响
Tab. 1 Inhibitive effect of AS on CAM angiogenesis
组别 质量浓度(μg.mL-1)
一级血管抑制率
（%）
二级血管抑制率
（%）
正常对照 - - -
环磷酰胺阳性对照 500 60.6 56.5
灯台叶醇提物
1 28.4 28.4
10 52.1** 48.3**
100 44.7* 46.3*
1000 24.7 26.8
5　讨论
灯台叶醇提物是具有悠久历史的传统傣药，其
传统功效主要为消炎、祛痰、止咳，近年来的药理
研究显示灯台叶对肿瘤具有治疗或辅助治疗作用 [6]。
本研究结果显示，1.0 mg/mL 灯台叶醇提物对 C200、
MNK-7、SNU-398 肿瘤细胞增殖的抑制作用和 80
mg/L 5-Fu 的抑制作用相当，2.0 mg/mL 灯台叶醇提
物对各肿瘤细胞增殖抑制作用均强于阳性对照组，表
明灯台叶醇提物具有较好的体外抗肿瘤作用。在实验
给药浓度下，灯台叶醇提物能剂量依赖性地显著抑制
体外培养的 3种肿瘤细胞的增殖，提示灯台叶醇提
物的细胞毒作用可能是其抗肿瘤的途径之一。血管
生成抑制剂通过抑制肿瘤血管生长从而起到抗肿瘤
作用 [7, 8]，对灯台叶醇提物抑制新生血管生成的研究
结果显示，10 μg/mL 给药组对鸡胚血管生成的抑制
作用与 500 μg/mL 环磷酰胺对照组作用相当，表明
灯台叶醇提物对鸡胚尿囊膜新生血管生成有显著的
抑制作用，提示抑制新生血管生成可能是其发挥抗肿
瘤作用的途径之一。但研究中也发现灯台叶醇提物浓
度与抑制新生血管生成作用不呈浓度依赖性，在实验
各剂量组中 10 μg/mL 的灯台叶醇提物抑制新生血管
生成作用最强，对一级血管的抑制率为 52.1%，对二
级血管抑制率达到 48.3%，其原因有待进一步研究。
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