全 文 ：黑龙江农业科学２０１５（２）：９８～１０１
Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
ＡｌＣｌ３比色法测定箬叶总黄酮含量
乐　薇，吴士筠
（武汉工商学院 环境与生物工程学院，湖北 武汉４３００６５）
摘要：为研究一种测定箬叶黄酮含量简便且标准的方法，以箬叶为试材，建立了ＡｌＣｌ３比色法测定箬叶提取液
中总黄酮的测定方法，考察了乙醇的浓度、ＡｌＣｌ３的加入量、ｐＨ以及显色时间等对显色物吸光度的影响。结果
表明：ＡｌＣｌ３法测定箬叶总黄酮的溶剂为５０％乙醇，适宜酸度为ｐＨ　５～６，显色剂ＡｌＣｌ３用量为０．０２５ｍｏｌ·Ｌ－１，
显色时间２０ｍｉｎ，测定波长４１５ｎｍ，以芦丁为标样，回归方程Ａ＝０．０２４　６ｃ＋０．０１８　１，相关系数Ｒ２＝０．９９９　２，
方法的回收率为９７．９４％～１０３．８％，相对标准偏差为２．４％。
关键词：箬叶；总黄酮；ＡｌＣｌ３；比色法
中图分类号：Ｒ２８４　文献标识码：Ａ　文章编号：１００２－２７６７（２０１５）０２－００９８－０４　ＤＯＩ：１０．１１９４２／ｊ．ｉｓｓｎ１００２－２７６７．２０１５．０２．００９８
　　生物类黄酮是植物次级代谢产物，具有调节血
脂、消除氧自由基、抗氧化、抗肿瘤和抗病毒等生理
活性［１－３］，因此受到国内外学者的广泛关注，成为研
究的热点问题［４－６］。箬叶为禾本科竹亚科箬竹属植
物叶的总称，主要分布于我国长江以南各省区，自
古以来就是端午节标志食品－粽子的包装物［７］。现
代药理分析发现，箬叶杀菌、防腐、抗癌等多种作用
显著，可广泛应用于医药、食品及日化用品等［８－９］。
黄酮为箬叶的重要活性成分［１０］，但研究报道较少，
为加快箬叶黄酮的开发利用，有必要对箬叶黄酮的
收稿日期：２０１４－１０－１０
基金项目：湖北省自然科学基金资助项目（２０１３Ｃ１１１）
第一作者简介：乐薇（１９７９－），女，湖北省沙市人，硕士，副教
授，从事生物分析方面研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｅｗｅｉ１１＠１２６．ｃｏｍ。
含量进行快速有效的监测。测定黄酮类化合物的
方法主要有薄层色谱法［１１］、分光光度法［１２］、荧光
法［１３］和ＨＰＬＣ［１４］法等。由于分光光度法具有设备
投资小、操作简便和易于工业推广等优点，因此考
虑选用分光光度法作为箬叶类黄酮含量的检测方
法。分光 光 度 法 测 定 类 黄 酮 的 方 法 主 要 有
ＮａＮＯ２－Ａｌ（ＮＯ）３－ＮａＯＨ 显色法和 ＡｌＣｌ３显色法，
经研究发现凡是具有邻苯二羟基的物质均能用
ＮａＮＯ２－Ａｌ（ＮＯ）３－ＮａＯＨ显色法进行显色定量，准
确度不高，后者对测定总黄酮的专属性较强［１５］，故
拟采用ＡｌＣｌ３显色－分光光度法测定箬叶类黄酮，并
对方法的精密度、准确度和稳定性等性能进行考
察，为箬叶黄酮含量测定提供一种简便准确的
方法。
Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ａｌｉｏｎ
ｆｒｏｍＡｌｏｅ　ｂｙ　Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ
ＪＩ　Ｈｕｉ－ｊｉｅ，ＹＡＮＧ　Ｙａｎ－ｊｕｎ，ＸＵＥ　Ｊｕｎ－ｌｉ，ＺＨＡＯ　Ｗｅｎ－ｚｈｕｏ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ－
ｇｙ，Ｊｉｌｉｎ，Ｊｉｌｉｎ　１３２０２２）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｔｏ　ｅｘｔｒａｃｔ　ａｌｏｉｎ　ｆｒｏｍ　Ａｌｏｅ，ｔａｋｉｎｇ　ａｌｏｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ａｓ　ａｎ
ｉｎｄｉｃａｔｏｒ，ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ－ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｎ　ａｌｏｉｎ　ｉｎ　Ａｌｏｅ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ：ｅｔｈａｎｏｌ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　８０％，ｓｏｌｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ　ｒａｔｉｏ　ｗａｓ　１∶５５，ｕｈｒａｓｏｎｉｃ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｗａｓ　３５℃ａｎｄ　ｕｈｒａｓｏｎｉｃ　ｔｉｍｅ　ｗａｓ　４０
ｍｉｎ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｏｉｎ　ｂｙ　ＵＶ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ，ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｃｏｕｌｄ　ｒｅａｃｈ　８．５２０ｍｇ·ｇ－１　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅｓｅ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ａｌｏｉｎ　ｗｅｒｅ　ｒｅｌｉａｂｌｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｌｏｅ；ａｌｏｉｎ；ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ－ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ
８９
２期 　　乐　薇等：ＡｌＣｌ３比色法测定箬叶总黄酮含量
１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　仪器　７５６型紫外可见分光光度计（上海
光谱仪器有限公司），ｐＨＳ－３ＤｐＨ计（上海精密科
学仪器有限公司），ＡＵＹ１２０型电子天平（上海精
密科学仪器有限公司）。
１．１．２　试剂　芦丁标准品（中国药品生物制品鉴
定所）、三氯化铝、醋酸钠、冰醋酸、乙醇、硝酸铝、
亚硝酸钠均为分析纯，水为超纯水。
１．１．３　材料　所用箬叶为２０１４年３月采自湖北
武陵山区鹤峰县。采后洗净，叶片在５０℃的烘箱
中烘６ｈ后粉碎，用石油醚脱脂脱色后晾干，贮于
干燥器中置暗处保存备用。
１．２　方法
试验于２０１４年３－４月在武汉工商学院环境
与生物工程实验中心进行。
１．２．１　箬叶总黄酮提取液的制备　称取３．０ｇ
箬叶，加入 ７５ ｍＬ　７５％ 乙醇在 ７５℃ 下浸提
４０ｍｉｎ，趁热过滤，用少许７５％乙醇洗涤滤渣，滤
渣在相同条件下再浸提１次，合并滤液和洗液，并
用７５％乙醇定容至２５０ｍＬ，此即为箬叶总黄酮
提取液。
１．２．２　芦丁标准溶液的制备　准确称取经
１０５℃干燥至恒重的芦丁标准试剂０．０７６　８ｇ，用
３０％乙醇６０℃水浴溶解，并定量转入２５０ｍＬ容
量瓶中，用３０％乙醇定容，摇匀得０．３０７　２ｇ·Ｌ－１
标准溶液。
１．２．３　ＡｌＣｌ３法测定总黄酮含量　准确移取一定
量的芦丁标准溶液或箬叶总黄酮提取液于１０ｍＬ
容量瓶中，加入乙醇５．０ｍＬ，０．５ｍｏｌ·Ｌ－１　ＡｌＣｌ３
溶液０．５０ｍＬ，ｐＨ为５．４的 ＨＡｃ－ＮａＡｃ缓冲液
２ｍＬ，用水定容至１０．００ｍＬ。显色２０ｍｉｎ后，
在４１５ｎｍ下以不加ＡｌＣｌ３的试液为空白，测定吸
光度。
２　结果与分析
２．１　ＡｌＣｌ３法测定条件的选择
２．１．１　测定溶剂的选择　按文献［１６］操作时发
现箬叶总黄酮的测定试液呈现浑浊，说明箬叶总
黄酮含量测定时溶剂不适合用水，考虑到黄酮类
化合物易溶于有机溶剂，且提取箬叶总黄酮时采
用的是乙醇，因此在测定中加入乙醇。经试验证
明，测定液中乙醇的体积百分比在５０％比较合
适，原因有两点：（１）该乙醇浓度下溶液能较长时
间保持澄清，在试验时间内吸光度稳定。试验中
发现乙醇的体积百分比在４０％时初始阶段溶液
澄清，但测定时吸光度无法稳定，经过几个小时的
放置后发现测定液有白色沉淀析出。（２）避免了
乙醇浓度越大挥发性越大带来的测定影响。
２．１．２　测定波长及缓冲溶液ｐＨ 的选择　准确
吸取０．４ｍＬ芦丁标准溶液按１．２．３在不同ｐＨ
下显色，ｐＨ分别为３．６、４．０、４．４、５．０和５．４，所
得吸收曲线见图１。可见随着酸度的提高，最大
吸收峰位置逐渐红移，最大吸收波长处的吸光度
也逐渐增大，ｐＨ≥５．０时，最大吸收峰位置不变，
为４１５ｎｍ，且该波长下的吸光度趋于稳定。故在
ｐＨ５．４的情况下，进一步考察箬叶总黄酮的显色
情况（见图２）。结果表明芦丁和箬叶总黄酮显色
后都在４１５ｎｍ处有最大吸收。因此本试验选用
缓冲溶液ｐＨ　５．４，测定波长为４１５ｎｍ。
图１　不同ｐＨ下的芦丁显色液的吸收曲线
Ｆｉｇ．１　Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　ｒｕｔｉｎ　ｃｏｌｏｒ
ｌｉｑｕｉｄ　ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐＨ
图２　ｐＨ　５．４下芦丁与箬叶总黄酮显色液的吸收曲线
Ｆｉｇ．２　Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　ｒｕｔｉｎ　ａｎｄ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ
ｏｆ　ｉｎｄｏｃａｌａｍｕｓ　ｌｅａｖｅｓ　ｕｎｄｅｒ　ｐＨ　５．４
９９
　　　　　黑　龙　江　农　业　科　学 ２期
２．１．３　显色剂ＡｌＣｌ３用量的选择　取０．４ｍＬ芦
丁标准溶液，按１．２．１操作，考察ＡｌＣｌ３用量对吸
光度的影响（见图３），发现显色剂用量在０．４０～
０．６０ ｍＬ 时，吸光度稳定，因此本试验选用
０．５ｍｏｌ·Ｌ－１　ＡｌＣｌ３０．５０ｍＬ，即显色液中ＡｌＣｌ３的
浓度为０．０２５ｍｏｌ·Ｌ－１。
图３　显色剂用量对芦丁显色液吸光度的影响
Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ　ａｇｅｎｔ　ｏｎ　ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ
２．１．４　显色稳定性考察　分别取０．４０ｍＬ芦丁
标准溶液和箬叶总黄酮提取液，按１．２．１操作，显
色不同时间后测定Ａ值（见图４）。表明芦丁显色
１０ｍｉｎ后吸光度稳定，且在２ｈ内吸光度变化很
小 。而箬叶总黄酮显色１５～６０ｍｉｎ内吸光度变
化小于３％。因此本试验选用显色时间２０ｍｉｎ。
２．２　ＡｌＣｌ３法标准曲线
分别取芦丁标准溶液０、０．２、０．４、０．６、０．８和
１．０ｍＬ于１０ｍＬ容量瓶中，按１．２．３操作，以芦
丁浓度为０的试液为参比，以吸光度Ａ对芦丁浓
度做 图，得 到 标 准 曲 线，曲 线 方 程 为 Ａ ＝
０．０２４　６ｃ＋０．０１８　１，相关系数Ｒ２＝０．９９９　２，线性
范围为芦丁质量浓度６．１４～３０．７２ｍｇ·Ｌ－１
图４　时间对显色液吸光度的影响
Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｉｍｅ　ｏｎ　ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ
２．３　ＡｌＣｌ３法的样品测定及回收验证
按选定的试验方法，测定了箬叶总黄酮的含
量，并对样品溶液进行了平行测定。为验证试验
方法的准确性，也进行了加标回收试验。结果见
表１和表２。由此可见，该法测定箬叶总黄酮提
取液的相对标准偏差（ＲＳＤ）为２．４％，精密度较
好。在试验中，加标回收率在９７．９４％～１０３．８０％，
准确度较高。因此，可以采用此法测定箬叶总黄
酮含量。
表１　精密度试验结果
Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＲＳＤ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
样品取用量／ｍＬ
Ｓａｍｐｌｅ　ｖｏｌｕｍｅ
吸光度
Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ
箬叶总黄酮含量／（ｍｇ·ｇ－１）
Ｓａｍｐｌｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ
平均值／（ｍｇ·ｇ－１）
Ａｖｅｒａｇｅ　ｖａｌｕｅ
相对偏差／％
Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｄｅｖｉａｔｉｏｎ
ＲＳＤ／％
０．２　 ０．１１９　 １７．０９
０．２　 ０．１１７　 １６．７５
０．２　 ０．１１４　 １６．４１
０．４　 ０．２２３　 １７．３５
０．４　 ０．２２５　 １７．５２
０．４　 ０．２２１　 １７．１８
１７．０５
０．２４
－１．８
－３．７
１．８
２．８
０．７８
２．４
３　结论
箬叶总黄酮在适宜的显色条件下，可与
ＡｌＣｌ３ 形成稳定的黄色络合物，该显色络合物的
吸光度与箬叶总黄酮在一定范围内成正比，可测
定箬叶黄酮含量。该法简便可靠，可用于箬叶总
黄酮提取过程中的含量检测。
００１
２期 　　乐　薇等：ＡｌＣｌ３比色法测定箬叶总黄酮含量
表２　加标回收试验结果
Ｔａｂｌｅ　２　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
提取液
Ｓａｍｐｌｅ
测得量／μｇ
Ｓａｍｐｌｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ
加标量／μｇ
Ｒｕｔｉｎ　ａｄｄｅｄ
吸光度Ａ
Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ
加标后测得量／μｇ
Ｔｏｔａｌ　ｆｏｕｎｄ
回收率／％
Ｒｅｃｏｖｅｒｙ
平均回收率／％
Ａｖｅｒａｇｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ
１　 ４０．９２　 ６１．４４　 ０．２６７　 １０１．２　 １０２．４０
２　 ４０．９２　 ６１．４４　 ０．２７０　 １０２．４　 １０３．２０
３　 ４０．９２　 ６１．４４　 ０．２７４　 １０４．２　 １０１．６０
４　 ８１．８５　 ６１．４４　 ０．３７４　 １４４．７　 １０１．００
５　 ８１．８５　 ６１．４４　 ０．３７１　 １４３．９　 １０２．７０
６　 ８１．８５　 ６１．４４　 ０．３６８　 １４２．２　 １０３．８
７　 １２２．８　 ６１．４４　 ０．４６７　 １８２．５　 ９９．０４
８　 １２２．８　 ６１．４４　 ０．４６５　 １８１．２　 ９８．６０
９　 １２２．８　 ６１．４４　 ０．４６２　 １８０．４　 ９７．９４
１０１．１
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Ｌｅａｖｅｓ　ｂｙ　ＡｌＣｌ３Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄ
ＹＵＥ　Ｗｅｉ，ＷＵ　Ｓｈｉ－ｙｕｎ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｗｕｈａｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｕｎｉｎｅｓｓ　Ｕｎｉ－
ｖｅｒｓｔｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ，Ｈｕｂｅｉ　４３００６５）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　ｉｎｄｏｃａｌａｍｕｓ　ｌｅａｖｅｓ，ｔａｋｉｎｇ　ｉｎｄｏｃａｌａ－
ｍｕｓ　ｌｅａｖｅｓ　ａｓ　ｍａｔｅｒｉａｌ，Ａ　ＡｌＣｌ３ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　ｉｎｄｏｃａｌａｍｕｓ
ｌｅａｖｅｓ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓｏｌｖｅｎｔ，ｔｈｅ　ｄｏｓａｇｅ　ｏｆ　ＡｌＣｌ３，ｐＨ　ａｎｄ　ｓｔａｎｄｉｎｇ　ｔｉｍｅ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅ－
ｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　５０％ｅｔｈａｎｏｌ　ａｓ　ｓｏｌｖｅｎｔ，ａｄｄｅｄ　０．０２５ｍｏｌ·Ｌ－１　ＡｌＣｌ３ｗｉｔｈ　ｐＨ
５～６，ａｆｔｅｒ　２０ｍｉｎ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｒｅａｃｔｓ　ｗｉｔｈ　ＡｌＣｌ３ｔｏ　ｆｏｒｍ　ａ　ｓｔａｂｌｅ　ｙｅｌｏｗ　ｃｏｍｐｌｅｘ，ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ
ｗａｓ　４１５ｎｍ．Ｔｈｅ　ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｅｑｕａｔｉｏｎ　ｗａｓ　Ａ＝０．０２４　６ｃ＋０．０１８　１，ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｒ２　ｗａｓ　０．９９９　２．Ｔｈｅ
ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｗａｓ　９７．９４％～１０３．８％，ａｎｄ　ＲＳＤ　ｗａｓ　２．４％．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｉｎｄｏｃａｌａｍｕｓ　ｌｅａｖｅｓ；ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ＡｌＣｌ３；ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ
１０１