全 文 ：基金项目 湖南省教育厅科学研究项目(06C883);湖南省科技厅重点
项目(05nk2009)。
作者简介 李水芳(1968-),女,湖南宁乡人,高级实验师,从事天然有
机化合物的研究。
收稿日期 2007!03!18
箬叶为禾本科(Graminales)竹亚科(Bambusoideae)箬竹
属(Indocalamus)植物叶的总称。该属植物约为20种以上,均
产我国,主要分布于长江以南各省区[1]。据我国医书记载,其
味甘、性寒,有清热止血、解毒消肿之功效。现代药理分析发
现,在箬叶中除含有维生素C、氨基酸、叶绿素和矿物质外,
还含箬叶多糖和黄酮类物质,具有杀菌、防腐、抗癌等多种
功效[2-5]。笔者通过单因素水平试验和正交因素水平试验分
别考察了水浴和超声 2种方法提取箬叶总黄酮的条件,探
讨了各因素对总黄酮得率的影响,并且对冬季和夏季采摘
的箬叶总黄酮含量进行了测定,旨在为箬叶资源的合理开
发利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料 植物样品粉碎机,电子分析天平,超声波清洗
器,752型紫外-可见分光光度计,电热恒温水浴锅,索氏抽
提器,真空泵。除芦丁为生化试剂外,其余均为分析纯,试验
用水为蒸馏水。
箬叶为阔叶箬竹(Indocalamuslatifolius)叶,分别于2004年
12月和 2005年 7月采集于湖南株洲。叶样采集后用自来
水洗净,自然晾干,粉碎,过 18目筛,用石油醚抽提脱脂脱
色素,自然晾干后贮于磨口瓶中备用。
1.2 试验方法 精确称量一定量箬叶样品于圆底烧瓶中,
加入浸提剂,分别用水浴和超声方法提取总黄酮。总黄酮含
量由总黄酮标准曲线求得。单因素水平试验和正交因素水
平试验均选用12月份采摘的箬叶,提取次数为1次。
1.3 总黄酮含量的测定 以芦丁为标准品,用 NaNO2!Al
(NO3)3比色法测定总黄酮含量,测定波长为510nm。
2 结果与分析
2.1 总黄酮标准曲线 以芦丁为标准品作总黄酮标准曲
线,得线性回归方程:C=95.43A-0.7359(A代表吸光度;C
代表浓度,单位为mg/L),相关系数r=0.9998。
2.2 单因素水平试验
2.2.1 浸提剂的确定。分别用体积分数为 70%的甲醇、乙
醇、丙酮作浸提剂。水浴提取条件:乙醇溶液体积(ml)与箬
叶质量(g)比(简称液-固比)20∶1、回流时间 2h、水浴温度
50℃,总黄酮得率依次为 0.65%、0.95%、1.25%;超声提取
条件:液-固比20∶1、超声时间 20min、室温 28℃,总黄酮得
率依次为0.83%、1.44%、1.46%。由此可知,2种提取方法
均为以70%丙酮作浸提剂,总黄酮得率最大,70%乙醇次之,
但因丙酮气味大、有毒、成本较高、不利于溶剂回收,且70%
乙醇和 70%丙酮超声提取后的总黄酮得率几乎相等。因
此,后续试验用乙醇作浸提剂。
2.2.2 乙醇浓度的确定。分别用体积分数为30%、50%、70%、
85%、95%乙醇作浸提剂提取总黄酮。水浴提取条件:液-固
比20∶1、回流时间2h和温度50℃;超声提取条件:液-固比
20∶1、超声时间20min和28℃室温。结果见图1。
从图 1可知,乙醇浓度低于 85%,水浴提取和超声提
取的总黄酮得率都随乙醇浓度增大而增大;但水浴提取后,
85%乙醇和95%乙醇总黄酮得率几乎相等,超声提取后,
85%乙醇的总黄酮得率反而高于95%乙醇。因此,水浴提
取和超声提取都以85%乙醇为佳。
箬叶总黄酮提取方法的研究
李水芳 1,喻勋林 2,李姣娟 1,文瑞芝 1
(1.中南林业科技大学理学院,湖南株洲 412006;2.中南林业科技大学资源与环境学院,湖南长沙 410004)
摘要 分别用水浴和超声2种方法提取箬叶中的总黄酮。通过单因素水平试验和正交试验,确定最佳浸提剂为乙醇;水浴最佳提取
条件:乙醇体积分数85%,回流时间3h,液-固比20∶1,水浴温度85℃;超声最佳提取条件:乙醇体积分数85%,超声时间30min,液-
固比20∶1;且超声方法优于水浴方法。在最佳提取条件下,测定箬叶总黄酮含量,冬季采摘的叶为1.92%,夏季采摘的叶为1.38%。
关键词 箬叶;总黄酮;水浴;超声;提取
中图分类号 Q949.99 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2007)20-06032-02
StudyofExtractionMethodsofTotalFlavonoidsfromIndocalamusLeaves
LIShui!fangetal(ColegeofScience,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Zhuzhou,Hunan412006)
Abstract TotalflavonoidsofIndocalamusleaveswereextractedbywaterbathandsupersonic.Byusingsinglefactorandorthogonaldesigns,it
wasconfirmedthattheoptimumsolventwasethanol.Theoptimumextractionconditionforwaterbathwas85%volumefractionofethanol,3h
bathtime,20∶1liquid!solidratioand85℃.Theoptimumextractionconditionforsupersonicwas85%volumefractionofethanol,30min
supersonictimeand20∶1liquid!solidratio.Themethodofwaterbathwasbeterthansupersonic.TotalflavonoidsofIndocalamuslatifoliusleaves
weredeterminedundertheoptimumcondition,whichwas1.92%inwinterand1.38%insummer.
Keywords Indocalamusleaves;Totalflavonoids;Waterbath;Supersonic;Extraction
安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2007,35(20):6032-6033,6035 责任编辑 金琼琼 责任校对 王 淼
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2007.20.052
反而降低,原因是加热时间太短,黄酮类物质来不及浸提出
来,而时间太长,部分黄酮分解。因此,水浴时间以3h左右
为佳。超声提取时,超声时间延长,有利于黄酮的浸出,但超
声30和40min的总黄酮得率相差不大。因此,超声提取30
min即可。
2.2.4 液-固比的确定。分别以液-固比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、
30∶1提取总黄酮。水浴提取条件:70%乙醇、回流时间2h
和温度75℃;超声提取条件:70%乙醇、超声时间20min和
28℃室温。结果见图3。
液-固比能影响液-固两相的混合程度和液-固两相之
间的传质推动力,从而影响总黄酮得率。液-固比大,液相浓
度增大慢,两相浓度差大,传质推动力大,有利于总黄酮的
浸出。从图3可知,水浴提取、超声提取的总黄酮得率都随
液-固比增大而增大,尤其从15∶1增加到20∶1时,变化明显;
20∶1后,总黄酮得率增加较缓慢。从节约溶剂和降低成本考
虑,水浴和超声都以液-固比20∶1为宜。
2.2.5 浸提温度的确定。分别在温度40、50、65、75、85、95℃
下提取总黄酮。水浴提取条件:70%乙醇、液-固比 20∶1和
回流时间2h;超声提取条件:70%乙醇、液-固比 20∶1和超
声时间20min。结果见图4。
提取温度的高低会影响分子扩散速度和黄酮类物质的
化学稳定性,一般温度升高,分子运动速度加快,有利于乙
醇分子向细胞组织内部扩散,有利于黄酮的浸出,但温度的
升高,也可能导致部分黄酮分解。由图 4可知,温度低于
85℃时,总黄酮得率随温度升高而增大;超过85℃,总黄酮
得率反而降低。从曲线变化趋势可以看出,温度对水浴提取
影响大,而对超声提取影响较小,这是因为水浴提取时间
长,而超声提取时间短。因此,水浴提取时应严格控制温度,
以85℃左右最佳;而超声提取,一般在室温下进行即可。
2.3 正交因素水平试验 从单因素水平试验中选取总黄
酮得率较大的各因素3个水平按正交表 L9(34)(水浴)和 L9
(33)(超声)安排正交试验,综合考察各因素之间的相互影
响。正交试验安排见表1。通过方差分析和显著性检验得
出:水浴提取 4因素对总黄酮得率影响大小依次为:时间>
液-固比>温度>乙醇浓度,水浴提取正交试验结果与单因素
试验结果相同,最佳提取条件为:95%乙醇、回流时间 3h、
水浴温度85℃、液-固比增大有利于总黄酮的浸出,实际操
作时,以 85%乙醇、液-固比 20∶1为佳;超声提取 3因素对
总黄酮得率的影响大小依次为:乙醇浓度>超声时间>液-固
比,超声提取最佳条件为:85%乙醇、超声时间 30min、液-
固比20∶1。
2.4 提取次数的确定 分别按水浴和超声最佳提取条件
进行1、2、3、4次提取,考察提取次数对总黄酮得率的影响,
结果见表2。
由表 2可知,水浴提取 2次,总黄酮得率最大,提取次
数继续增加,总黄酮得率反而稍有下降,可能是 2次提取
(下转第6035页)
表1 水浴和超声正交试验因素与水平
水平 乙醇体积
分数∥%
温度
℃
时间
h
液-固
比
乙醇体积
分数∥%
时间
min
液-固
比
1 70 75 1 15∶1 70 10 15∶1
2 85 85 2 20∶1 85 20 20∶1
3 95 95 3 25∶1 95 30 25∶1
水浴 超声
2.2.3 浸提时间的确定。分别取水浴时间为0.5、1、2、3、4h
提取总黄酮,提取条件:70%乙醇、液-固比20∶1和温度75℃;
分别以超声时间为5、10、20、30、40min提取总黄酮,提取条
件:70%乙醇、液-固比20∶1和28℃室温。结果见图2。
由图2可知,水浴提取时,总黄酮得率随水浴时间延长
而增大,在3h左右达最大值,此后,时间延长,总黄酮得率
李水芳等 箬叶总黄酮提取方法的研究35卷20期 6033
后,箬叶中的总黄酮已基本提取完全,但每次提取后,残渣
未经洗涤和滤干即进行下次提取,残渣中仍留有一定量的提
取液,其中的黄酮类物质由于加热时间太长而分解,因此水
浴提取以2次为佳;超声提取次数增加,总黄酮得率增大,但2
和4次提取后的总黄酮得率相差不大。因此,水浴和超声方法
都只需提取2次就基本能将箬叶中的总黄酮提取完全。
3 结论
(1)以乙醇-水溶液为浸提剂提取箬叶总黄酮,水浴最
佳提取条件为:85%乙醇、回流时间 3h、液-固比 20∶1和水
浴温度85℃;超声最佳提取条件为:85%乙醇、超声时间30
min、液-固比 20∶1和常温。水浴和超声都只需提取 2次就
基本能将箬叶中的总黄酮提取完全 。综合单因素试验和正
交试验结果,无论从总黄酮得率、时间效率和操作的简便性
等方面考虑,超声方法都优于水浴方法。
(2)夏季(7月)采摘的箬叶,水浴提取后测得的总黄酮
含量为1.34%,超声提取后测得的总黄酮含量为1.42%,平
均为 1.38%;冬季(12月)采摘的箬叶,水浴提取后测得的
总黄酮含量为1.95%,超声提取后测得的总黄酮含量为1.89%,
平均为1.92%。箬叶总黄酮含量冬季明显高于夏季,这符合
植物次生代谢产物积累的一般规律。
参考文献
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水浴 超声
12月采箬叶 7月采箬叶 12月采箬叶 7月采箬叶
1 1.52 1.04 1.62 1.03
2 1.95 1.34 1.83 1.32
3 1.88 1.27 1.89 1.41
4 1.87 1.23 1.89 1.42
提取次数
表2 不同提取次数对总黄酮得率的影响 %
果,镉对它们的胚根伸长抑制效应十分明显。
2.2 镉溶液对4种作物POD同工酶的影响 由表3可见,
经 80mg/kg镉溶液处理后的玉米和西葫根系中 POD同工
酶谱带数量均比对照减少。玉米对照样品显示有9条谱带
(POD1~POD3,POD5~POD10),而经80mg/kg镉溶液处理后
的样品缺少了5条(POD3,POD8~POD10),另外还新产生了
1条(POD4)。西葫对照样品有 4条谱带(POD1~POD4),经
80mg/kg镉溶液处理后的样品有 3条谱带(POD1、POD2、
POD4),缺少 POD3。旱萝卜 POD同工酶没有产生明显变
化。沙窝青萝卜则未能检测出POD谱带。
2.3 镉溶液对 4种作物 COD同工酶的影响 由表3还可
见,沙窝青萝卜和西葫COD同工酶谱带变化明显。沙窝青萝
卜对照样品有5条谱带(COD1~COD5),经 80mg/kg镉溶液
处理后的样品只有3条(COD3~COD5),比对照减少了 2条
(COD1、COD2)。西葫对照样品有4条谱带(COD1~COD4),
经 80mg/kg镉溶液处理后的样品有 3条(COD1、COD2、
COD4),比对照缺少1条(COD3)。玉米和旱萝卜COD同工
酶的谱带无明显变化。
表3 4种作物的POD、COD同工酶对镉害(80mg/kg氯化镉溶液)的反应
样品
沙窝青萝卜谱带 西葫谱带 玉米谱带 旱萝卜谱带
POD COD POD COD POD COD POD COD
对照 无 COD1~COD5 POD1~POD4 COD1~COD4 POD1~POD3、POD5~
POD10
COD1~COD5 POD1~POD3、
POD5~POD10
COD1~COD5
处理 无 COD3~COD5 POD1、POD2、
POD4
COD1、COD2、
COD4
POD1、POD2、POD4、
POD6、POD7
COD1~COD5 POD1~POD3、
POD5~POD10
COD1~COD5
3 小结与讨论
该试验结果表明,不同作物的发芽率、幼苗高度和根系
生长对镉害的反应不同。
POD同工酶被认为是一种对环境条件变化反应灵敏的
酶,当植物受病菌、高浓度盐、射线等不良环境因子伤害时,
会诱导产生新的同工酶谱带或使同工酶谱带减少。同工酶的
这种变化被认为是植物对外界不良环境伤害的“保护性反
应”。该试验中所看到的玉米和西葫 POD同工酶谱带减少
现象也是作物对镉害的一种适应现象,以便能使其在镉害
条件下生存。玉米主胚根和幼苗高度及西葫主胚根生长受
抑制与POD的变化存在一定的相关性,这一结果可作为生
产上筛选作物抗镉品种的一种生化指标。旱萝卜主胚根和
幼苗生长虽然对镉害反应敏感,但其主胚根内 POD基本无
变化,这是否为不同作物品种间的差异,有待进一步研究。
另外,经80mg/kg镉溶液处理后的玉米样品POD同工酶在
某些谱带消失的同时,还产生出1条新的谱带,这可能是由
于某些谱带减少而产生的暂时性补偿。
COD同工酶是呼吸作用末端氧化的重要酶类。到目前
为止,还未见到作物根系内COD同工酶的变化与作物镉害
之间关系的报道。但4种作物种子经不同浓度镉处理后在
一些作物幼苗(沙窝青萝卜、西葫)主胚根内COD的变化是
明显可见的。因此,COD的变化与作物镉害之间似乎也存
在某些关系,尚需深入研究。
参考文献
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杨学锋等 箬镉对农作物种子萌发·幼苗生长及2种氧化酶同工酶的影响35卷20期 6035