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樱桃叶黄酮的微波提取及抗氧化性质的研究
李晨，姜子涛* ，李荣
(天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134)
摘 要:考察了影响微波辅助提取樱桃叶黄酮的主要因素，测定了樱桃叶黄酮的总抗氧化能力、清除超
氧阴离子自由基能力、清除羟自由基 (·OH)能力、清除 DPPH自由基能力和对卵黄脂蛋白过氧化的抑制能
力。通过与常见的抗氧化剂维生素 C进行比较，对樱桃叶黄酮抗氧化和清除游离基活性进行了评价。结果表
明，微波辅助提取樱桃叶总黄酮的最佳工艺为:微波时间 5min、功率 300W、75%乙醇、料液比 1 ∶ 25 (g /
mL)和提取温度 80℃。樱桃叶黄酮具有良好的抗氧化效果，在一定浓度范围内，樱桃叶黄酮在清除·OH 和
对卵黄脂蛋白脂质抗氧化的能力优于维生素 C，但清除超氧阴离子自由基、清除 DPPH 自由基和总体抗氧化
能力略逊于维生素 C。
关键词:樱桃叶黄酮;微波;提取;抗氧化活性
中图分类号:TS202. 1 文献标识码:A 文章编号:1006 － 2513(2012)04 － 0103 － 06
Study on microwave － assisted extraction of flavones from
prunus pseudocerasus leaves and its antioxidant activities
LI Chen，JIANG Zi-tao* ，LI Rong
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，College of Biotechnology
and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134)
Abstract:The microwave extracting processing of total flavones in leaves of Prunus pseudocerasus and the antioxidant
activities of the flavones including total antioxidant activities，superoxide anion，hydroxyl radical scavenging activities，
DPPH radical scavenging，and inhibition of yolk lipoprotein peroxide were studidy． The results were compared with
synthetic antioxidants such as ascorbic acid (VC)． The optimal process of extraction of flavones was as follows:ex-
tracting duration 5min，microwave power 300W，75% ethanol，1 ∶ 25 (g /mL) ratio of the leaves powders to liquid，
and extraction temperature 80℃ ． The results clearly demonstrated that the order of the hydroxyl radical scavenging ac-
tivity and antioxidant activities on lipoprotein and lipid of yolk was higher than those of VC，and the activities of total
antioxidant，superoxide anion，scavenging DPPH radical were lower than VC．
Key words:prunus pseudocerasus leaves;flavones;microwave extraction;antioxidant activity
黄酮类化合物是一类多酚类物质，由于黄酮
的这一结构特点，使之成为备受关注的一类天然
抗氧化剂［1］。天然抗氧化剂具有作用时间长、热
稳定性好、抗氧化效率高、对人体毒副作用小
等特点，随着人们生活水平的提升以及保健意
识的加深，对天然抗氧化剂的研究逐渐成为了
收稿日期:2012 － 04 － 07 * 通讯作者
基金项目:天津市高校科技发展基金项目 (项目编号:20110608)。
作者简介:李晨 (1982 －) ，女 (汉) ，硕士研究生，研究方向为食品添加剂。
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热点［2］。樱桃叶为蔷薇科李属植物樱桃 (Prunus
pseudocerasus)的叶片，该植物在我国的分布极
为广泛。有研究表明，樱桃叶中含有大量的黄酮
类化合物［3］。本文探讨了微波提取樱桃叶中黄酮
类化合物的条件，并对微波提取的樱桃叶黄酮与
常见的抗氧化剂维生素 C 的抗氧化性能相比较，
为樱桃叶黄酮在食品、保健品等领域的应用奠定
了理论基础。
1 材料与仪器
1. 1 材料与试剂
樱桃叶:2011 年采自山东省威海市，洗净后
于真空干燥箱烘干粉碎后备用。芦丁标准溶液
(用 30%的乙醇溶液超声溶解为浓度为 0. 1mg /mL
的标准溶液) ;无水乙醇，石油醚等试剂为分析
纯;D101 大孔吸附树脂: (南开大学化工厂) ;
DPPH:美国 Sigma公司;抗坏血酸 (维生素 C)、
结晶紫、磷酸钠、钼酸铵等均为分析纯。
1. 2 仪器
MAS －Ⅰ型微波快速制样系统，上海新仪微
波化学科技有限公司;Scientz － 50N 型冷冻干燥
机，宁波新芝生物科技股份有限公司;U － 3900
型紫外可见分光光度计，日本日立公司;ZK －
82A 型 真 空 干 燥 箱，上 海 市 实 验 仪 器 厂;
KQ2200B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限
公司;FA1104N型电子天平，上海精密仪器有限
公司;RE52 － 86A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化
仪器厂;HZS － H 型水浴振荡器，哈尔滨市东联
电子技术开发有限公司;80 － 1 离心机，上海手
术器械厂。
2 实验方法
2. 1 樱桃叶黄酮的提取及其含量的测定
称取 2. 0g 干燥樱桃叶粉末，以 75%乙醇溶
液为溶剂，放入特制的微波玻璃反应器中，在功
率 300W条件下，按 1 ∶ 25 的料液比在 80℃下用
微波萃取仪萃取 5min。将提取液过滤，滤液经石
油醚萃取以去除其中的叶绿素及脂溶性成分，去
掉石油醚层，将萃取后的滤液置于真空旋转蒸发
仪中旋转蒸发，至樱桃叶粗黄酮提取液中无乙
醇，冷冻干燥，得到樱桃叶粗黄酮的干燥粉末。
准确称取 0. 25g 樱桃叶粗黄酮粉末，用蒸馏水溶
解后定容于 250mL 的容量瓶中，得到浓度为
1. 0mg /mL的樱桃叶粗黄酮溶液。
按文献 ［4］ 的方法测定芦丁的标准曲线，
得到芦丁浓度 c与吸光度 A 关系曲线的回归方程
式:A = 13. 18286c + 0. 00143，相关系数 R2 =
0. 9996。取 1. 0mL樱桃叶黄酮提取液，按上述方
法进行显色后，以试剂空白作参比，测定吸光
度，根据芦丁回归方程计算提取液中黄酮的
含量。
2. 2 樱桃叶黄酮溶液的配制
选用 D101 大孔吸附树脂对樱桃叶粗黄酮溶
液进行纯化。选择浓度为 1. 0mg /mL、pH = 4. 0
的樱桃叶粗黄酮溶液，以 2BV /h 的吸附流速进行
充分吸附，用 3 倍柱体积，70%浓度的乙醇进行
解吸，解吸流速为 2BV /h。将解吸液置于真空旋
转蒸发仪中旋转蒸发至无醇味，加蒸馏水稀释至
浓度为 1. 0mg /mL樱桃叶黄酮溶液的样品储备液。
再配制 1. 0mg /mL的维生素 C溶液的样品储备液。
2. 3 总抗氧化活性的测定—磷钼络合物法
将样品储备液用蒸馏水稀释得到浓度分别为
0. 1mg /mL、 0. 15mg /mL、 0. 2mg /mL、 0. 25mg /
mL和 0. 3mg /mL 的樱桃叶黄酮溶液、Vc 溶液，
作为样品液。磷钼试剂的终浓度为 0. 6mol /L浓硫
酸，28mmol /L磷酸钠和 4mmol /L 钼酸铵的溶液。
在一系列 10mL 的比色管中加入 0. 4mL 上述样品
液和 4. 0mL磷钼试剂，迅速摇匀后置于 95℃水浴
中，恒温 90min。在 695nm 波长下测吸光度 A。
平行测定 3 次，取其平均值。
2. 4 结晶紫法测定樱桃叶黄酮对羟自由基
(·OH)的清除率
将样品储备液用蒸馏水稀释得到浓度为 5 ×
10 －2mg /mL的樱桃叶黄酮溶液和维生素 C 溶液，
作为样品液。在一系列 10mL 比色管中分别加入
0. 3mL结晶紫溶液 (0. 4mmol /L)、0. 6mL硫酸亚
铁溶液 (10mmol /L)和 0. 4mL 双氧水溶液
(5mmol /L) ，然后用 pH4. 0 缓冲液 (磷酸氢二钠
柠檬酸)定容到 10mL 并摇匀，放置 30min，测
580nm处吸光度 Ab (不加双氧水时 580nm处吸光
度为 A0) ，则·OH的产生量可以用 ΔA = A0 － Ab
表示。表观抗·OH 氧化率的测定:在上述反应
体系中加双氧水之前分别加入 0. 1mL、0. 2mL、
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0. 3mL、0. 4mL 和 0. 5mL 5 × 10 －2 mg /mL 同种样
品液，测定吸光度 As，平行测定 3 次，取其平均
值。清除率 S可以按下式计算:
S (%) =
As － Ab
A0 － Ab
× 100% (1)
2. 5 邻苯三酚自氧化法测定对超氧阴离子自由
基 (O －2 ·)的清除
［5，6］
将样品储备液用蒸馏水稀释得到浓度分别为
0. 1mg /mL、0. 2mg /mL 和 0. 3mg /mL 的樱桃叶黄
酮溶液和维生素 C溶液，作为样品液。
2. 5. 1 最大吸收波长的确定
取 4. 5mL 50mmol /L Tris － HCl 缓 冲 溶 液
(pH8. 2)和 4. 0mL 蒸馏水加入比色管中，均匀混
合后放入 37℃水浴中保温 20min，取出后立即加入
已在 37℃水浴条件下预热的，浓度为 3mmol /L 邻
苯三酚 0. 5mL，迅速摇匀后倒入比色皿，2min
16min内每隔 2min 在 250nm 500nm 的波长下用
紫外可见分光光度计扫描，确定其最大吸收波长。
2. 5. 2 邻苯三酚自氧化速率的测定
按照上述步骤，在加入邻苯三酚之前于比色
管中加入 1. 5mL的样品液以及 2. 5mL蒸馏水，在
319nm波长下每隔 1min测定吸光度，对照管同样
以 10mmol /L HCl 溶液配制，记录结果。以时间
为横坐标、相对吸光强度为纵坐标进行线性回
归，其斜率为 Vs。以 1. 5mL水代替样品液可得到
不加 O －2 ·抑制剂前邻苯三酚的自氧化速率 V0。
平行测定 3 次，取其平均值。按下式计算样品对
O －2 ·的抑制率:
抑制率(%)=
V0 － Vs
V0
× 100 (2)
2. 6 清除 DPPH自由基的测定［7］
将样品储备液用蒸馏水稀释得到浓度为
0. 1mg /mL、0. 2mg /mL、0. 3mg /mL 的樱桃叶黄
酮溶液、维生素 C 溶液，作为样品液。取 3. 5mL
浓度为 1 × 10 －4 mol /L 的 DPPH 溶液和 0. 5mL 样
品液加入比色管中，放置 30min 测定 517nm 波长
下的吸光度 A;取 3. 5mL无水乙醇和 0. 5mL样品
液加入比色管中，放置 30min 测定 517nm 波长下
的吸光度 A1;取 3. 5mL 浓度为 1 × 10
－4 mol /L 的
DPPH溶液和 0. 5mL 无水乙醇，放置 30min 测定
517nm波长下的吸光度 A0;参比为 3. 5mL无水乙
醇和 0. 5mL水的混合液。根据下式计算 DPPH 自
由基的清除率:
清除率(%)=
1 －(A － A1)
A0
× 100 (3)
2. 7 Fe2 +诱发卵黄脂蛋白不饱和脂肪酸 (PUFA)
过氧化体系中抗氧化活性 (AOA)的测定［8］
将样品储备液用蒸馏水稀释得到浓度为
0. 1mg /mL、0. 2mg /mL、0. 3mg /mL 的樱桃叶黄
酮溶液、维生素 C 溶液，作为样品液。卵黄悬液
用等体积的 pH = 7. 45，浓度为 0. 1mol /L 的磷酸
盐缓冲液 (PB)配制成 1 ∶ 1 悬液，磁力搅拌
10min，再用 PB稀释成 1 ∶ 25 的悬液。吸取配好
的卵黄悬液 0. 2mL、样品液 0. 6mL、25mmol /L的
FeSO40. 2mL 于离心管中，用 PB 补充至 2. 0mL，
37℃培养 12h，取出后加入 0. 5mL20%三氯乙酸
(TCA) ，摇匀，静置 10min，放入离心机中，以
3500r /min的速度离心 10min。离心后取 2mL上清
液，在 其 中 加 入 1mL 0. 8% 硫 代 巴 比 妥 酸
(TBA) ，置于沸水浴中 15min。冷却后，于
532nm出测吸光度。空白管为 PB 溶液。对照管
操作步骤同上，只是不加样品液。按照下式计算
样品液对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率:
AOA (%) =
A0 － A样
A0
× 100 (4)
式中:A0为对照管吸光度;A样为样品液吸
光度。
3 结果与分析
3. 1 樱桃叶粗黄酮的提取
参照实验方法 2. 1，分别测定乙醇浓度、提
取温度、料液比对樱桃叶粗黄酮得率的影响，结
果见图 1。
由图 1 可以看出，当乙醇浓度为 75%，提取
温度为 80℃，料液比为 1 ∶ 25 时，樱桃叶粗黄酮
的得率为 5. 97%。
参照实验方法 2. 1，分别测定提取时间和微
波功率对樱桃叶粗黄酮得率的影响，结果见图 2。
由图 2 可以看出，功率 200W，提取时间
5min，樱桃叶黄酮的得率为 4. 46%;功率为
400W，提取时间 5min，樱桃叶黄酮的得率为
5. 20%，当功率为 300W，提取时间为 5min 时，
樱桃叶黄酮得率达到 5. 97%，因此微波提取选用
的功率为 300W，时间 5min。
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图 1 乙醇浓度、提取温度、料液比对黄酮得率的影响
图 2 提取时间及微波功率对黄酮得率的影响
3. 2 总抗氧化活性
根据实验方法 2. 3，测定样品和维生素 C 在
不同浓度下的吸光度，得到其抗氧化活性强弱，
结果如图 3。
图 3 吸光度与样品液浓度的关系
磷钼络合物法的测定原理是 Mo (Ⅵ)被抗
氧化物质还原生成绿色的 Mo (Ⅴ)络合物，其
最大吸收波长为 695nm。抗氧化物质活性越强，
测定的吸光度值越大［9］。由图 3 可以看出，样品
液浓度增大时，吸光度值均相应增大，说明抗氧
化活性随浓度的增大而增强。通过与抗氧化剂维
生素 C相比，樱桃叶黄酮的抗氧化性比维生素 C
弱，随着样品液浓度的增加，其差异愈加显著。
3. 3 结晶紫法测定樱桃叶黄酮对·OH的清除率
根据实验方法 2. 4，测定样品和维生素 C 在
不同浓度下的吸光度，根据公式 (1)计算对·
OH的清除率，结果如图 4。
图 4 羟自由基清除率与样品液浓度的关系
羟自由基是活性氧的一种，会杀死红细胞，
降解 DNA、细胞膜和多糖化合物，是毒性最强的
自由基，会导致诸多疾病的产生并加速机体老
化。结晶紫分光光度发测定· OH 的基本原
理［10］:H2O2与 Fe
2 +发生 Fenton 反应产生·OH，
·OH会与结晶紫中具有高电子云密度的·C = C
·基团发生亲电加成反应使结晶紫褪色。通过测
定结晶紫吸光度值的变化可间接测定出·OH 的
产生量。
在 Fe2 +与 H2O2发生 Fenton之前加入·OH清
除剂，可减少·OH 与结晶紫的结合量，整个体
系颜色也会随着清除剂用量的增加而加深，吸光
度值随之增大。由图 4 可以看出，在 5 × 10 －4mg /
mL 2. 5 × 10 －3mg /mL的浓度变化范围内，样品
清除·OH的能力随浓度增大而增大，当浓度达到
最大值时，樱桃叶黄酮的·OH 清除率达到了
31. 84%。与抗氧化剂维生素 C 相比，樱桃叶黄酮
107
溶液清除·OH的能力远强于维生素 C。因此，樱
桃叶黄酮可有效清除·OH，且对人体健康有益。
3. 4 清除超氧阴离子自由基的能力
根据实验方法 2. 5. 1，扫描邻苯三酚自氧化
随时间而变化的吸收光谱，结果如图 5。
图 5 邻苯三酚的紫外吸收光谱
由图 5 可知，中间产物在 319nm 处吸光度有
较强的上升趋势，随着时间的增加，体系的吸光
度不断增加，且在 2min 6min 内呈线性增加，
故选择 319nm作为本实验邻苯三酚自氧化体系的
检测波长。根据实验方法 2. 5. 2，以 319nm 作为
邻苯三酚自氧化体系的检测波长，每隔 1min读取
1 次吸光度，以时间为横坐标，吸光度为纵坐标
进行回归分析，加样品液前的斜率为邻苯三酚自
氧化的反应速率 (V0) ，加样品液后邻苯三酚自
氧化的速率 (Vs) ，结果见图 6。
图 6 加样品液前后邻苯三酚自氧化随时间变化的斜率
图中 a、b、c 为样品液浓度分别为 0. 1mg /
mL、0. 2mg /mL 和 0. 3mg /mL 时，邻苯三酚的自
氧化速率。
根据图 6 得到的 V0及 Vs，按公式 (2)计算
得出不同浓度下樱桃叶黄酮及维生素 C 对 O －2 ·
的抑制率，结果见图 7。
图 7 样品液对超氧阴离子自由基清除率
由图 7 可知，樱桃叶黄酮对超氧阴离子的抑
制率随着样品液浓度的增加而增加，在 0. 1mg /
mL的浓度下，其抑制率高于维生素 C 对超氧阴
离子的抑制率，但是随着样品液浓度的增加，樱
桃叶黄酮对超氧阴离子的抑制率低于维生素 C。
3. 5 清除 DPPH自由基
根据实验方法 2. 6，按照公式 (3)计算样品
溶液对 DPPH自由基的清除率，结果见图 8。
图 8 DPPH自由基清除率与样品液浓度的关系
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DPPH自由基在有机溶剂中最稳定，其乙醇
溶液呈深紫色，在 517nm 波长条件下有强吸收，
当其与抗自由基活性物质的孤对电子配对时，吸
收消失或减弱，通过测定吸收减弱的程度来评价
自由基清除剂的活性。由图 8 可以看出，樱桃叶
黄酮溶液对 DPPH 自由基的清除率随着样品液浓
度的增大而增大，当其浓度为 0. 1mg /mL 时，清
除率已达到 87. 81%，高于同浓度的抗氧化剂维
生素 C，但是在高浓度时，樱桃叶黄酮溶液清除
DPPH自由基的能力虽然有增加但却略低于维生
素 C的清除率。
3. 6 对卵黄脂蛋白过氧化的抑制率
按照实验方法 2. 7，得到不同浓度樱桃叶黄
酮溶液和维生素 C的吸光度，根据公式 (4) ，计
算出样品液对卵黄脂蛋白过氧化的抑制率，见
图 9。
图 9 对卵黄脂蛋白脂质的抑制率
通过图 9 看出，樱桃叶黄酮对卵黄脂蛋白的
抑制率随着浓度的增加而增大，与同浓度的抗氧
化剂维生素 C相比，樱桃叶黄酮溶液对卵黄脂蛋
白的抑制率强很多，在 0. 3mg /mL 的浓度时，能
够达到 61. 68%的抑制率。
4 结论
实验表明，没有一种单一的方法能够全面评
价一种物质的抗氧化性能。因此，本文通过樱桃
叶黄酮的总抗氧化能力、清除 O －2 ·能力、清除
·OH能力、清除 DPPH 自由基能力以及对卵黄
脂蛋白脂质抗氧化能力等五个方面的考察，可以
较为客观地说明，天然抗氧化剂的抗氧化效果不
比抗氧化剂维生素 C 的效果差，在某些方面更远
远优于维生素 C。实验表明，樱桃叶黄酮在清除
·OH和对卵黄脂蛋白脂质抗氧化的能力优于抗
氧化剂维生素 C，在清除 O －2 ·、DPPH 自由基和
总体抗氧化能力方面略逊于抗氧化剂维生素 C，
故樱桃叶黄酮可以作为一种天然抗氧化剂在食品
工业中加以开发利用。
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