全 文 ：研究报告
2014年第 40卷第 1期(总第 313期) 19
不同比例酪蛋白与牛明胶酶促交联产物的功能性质*
罗振玲，赵新淮
(东北农业大学，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨，150030)
摘 要 将酪蛋白和明胶以 2∶ 1、4∶ 1和 6∶ 1的质量比混合，并利用转谷氨酰胺酶进行酶促反应，制备酪蛋白-明胶
交联复合物，通过对交联复合物功能性质的测定，研究明胶比例不同对复合物功能性质的影响，以开发新型蛋白
质配料。在 5% (w /v)底物浓度下，每克蛋白质添加转谷氨酰胺酶 10 U，45℃反应 4 h，等电点沉淀除去游离明
胶和交联明胶，得到 4-羟脯氨酸含量分别为 51. 37、33. 38、25. 97 g /kg 蛋白质的 3 个复合物。复合物在 pH 4. 5
或更低时溶解性优于酪蛋白，但在中性或弱碱性时则低于酪蛋白。与酪蛋白相比，复合物的吸水性、吸油性均有
显著提高，明胶含量高的复合物其吸油性较高，而吸水性相应较低。不过，复合物的体外消化能力低于酪蛋白，
并且随着明胶含量的增加其体外消化能力降低。
关键词 酪蛋白，明胶，转谷氨酰胺酶，交联，功能性质
第一作者:硕士研究生(赵新淮教授为通讯作者，E-mail:zhaoxh
@ mail． neau． edu． cn)。
* 国家高技术研究发展计划(863计划)(项目编号2013AA102205)
收稿日期:2013 － 10 － 04，改回日期:2013 － 10 － 17
转谷氨酰胺酶可以催化蛋白质分子内或分子间
形成 ε-(γ-谷氨酰基)-赖氨酸异肽键［1 － 2］，因此能够
交联蛋白质而形成聚合物。微生物来源的转谷氨酰
胺酶被广泛应用于食品工业［3］，用于修饰蛋白质的
一些功能特性。例如，它诱导的交联作用可以降低
β-酪蛋白的乳化活性、但提高乳化稳定性［4］。又如，
它还可以提高山羊奶酸奶的质地［5］，以及提高乳清
分离蛋白的热稳定性［6］。
酪蛋白是牛奶中蛋白质的主要成分，占 80%以
上，是食品加工中的重要配料。明胶来自于动物皮、
结缔组织，经过酸或碱水解而得，具有良好的溶解性、
胶凝性、起泡性、乳化性，广泛应用于食品、医药、化妆
品等［7］。为此，本研究将酪蛋白、明胶以 2∶ 1、4∶ 1、6∶ 1
的质量比混合，经转谷氨酰胺酶催化得到 3 个复合物，
分别测定复合物的溶解性、体外消化性、吸水性和吸油
性，研究明胶比例不同对复合物功能性质的影响，评估
其作为新型蛋白质配料的可能性。
1 材料与方法
1. 1 材料
酪蛋白(蛋白质含量 89%)，上海山浦化工有限
公司;明胶(Type A，等电点 pH 8. 0 ～ 9. 0，蛋白质含
量 89. 67%)，湖南金龙明胶有限公司;转谷氨酰胺酶
(酶活力为 100 U /g)，江苏一鸣精细化工有限公司;
4-L-羟脯氨酸，Sigma公司;胰蛋白酶(56 kU /g);胃蛋
白酶(40 kU /g);精炼大豆油，九三集团哈尔滨惠康
食品有限公司;其他化学试剂均为分析纯。
1. 2 主要设备
DELTA 320 型精密 pH计，梅特勒-托利多中国有
限公司;AL204 型分析天平，梅特勒-托利多仪器中国
有限公司;HZQ-F160 型全温振荡培养箱，哈尔滨东
联电子技术开发有限公司;LGJ·1 冷冻干燥机，上海
医分仪器制造有限公司;UV-2401PC 型紫外可见分
光光度计，日本岛津公司;H-1 型微型漩涡混合器，上
海精科实业有限公司;DK-98-1 型电热恒温水浴锅，
天津市泰斯特仪器有限公司;DB-3B 型不锈钢电热
板，天津市泰斯特仪器有限公司。
2 实验方法
2. 1 复合物的制备和化学分析
2. 1. 1 复合物的制备
分别配制浓度为 50 g /L 的酪蛋白与明胶溶液，
调节 pH至 7. 5，二者分别以 2∶ 1、4∶ 1、6∶ 1的比例混合
后进行酶促反应，反应条件参考张伊宁等条件［8］略
作修改。转谷氨酰胺酶添加量为 10 U /g 蛋白质、反
应温度为 45℃、反应时间为 4 h。反应结束后，样品
置于沸水浴中加热 15 min，冷却至室温。
调节样品溶液 pH值至 4. 6，8 000 r /min 离心 15
min，弃上清液。所得沉淀加一定体积蒸馏水(pH
4. 6)，清洗 2 次，离心、弃上清液。将得到的沉淀重新
分散溶解在蒸馏水中，调节 pH 值至 6. 8，冻干后烘
干、恒重、粉碎(＜ 150 $m)，得到 3 个复合物，分别为
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2014.01.036
食品与发酵工业 FOOD AND FEＲMENTATION INDUSTＲIES
20 2014 Vol. 40 No. 1 (Total 313)
复合物(2∶ 1)、为复合物(4∶ 1)、为复合物(6∶ 1)。
2. 1. 2 蛋白质含量测定
采用凯式定氮法测定蛋白质含量，酪蛋白、明胶
的转换系数分别为 6. 38、5. 46。
2. 1. 3 4-羟脯氨酸含量测定
参考 Sky 等［9］方法。称取 0. 1 g 样品于安瓿瓶
中，加入 4 mL HCl(7. 5 mol /L)和 1 mL苯酚(5%)溶
液，封口，110℃水解 24 h。调节 pH至 6. 0，定容至 25
mL，过滤，滤液用乙酸钠-柠檬酸钠缓冲溶液(pH
6. 0)稀释到适宜倍数。取 2 mL 稀释液于试管中，加
入 1 mL 氯胺-T 溶液(0. 06 mol /L 氯胺-T 溶于 50%
正丙醇-水)，混匀后室温反应 20 min;再加入 2 mL 对
二甲氨基苯甲醛溶液(0. 05 mol /L 对二甲氨基苯甲
醛、3. 7 mol /L高氯酸溶于 60%正丙醇-水)，混匀后
于 60℃恒温水浴反应 20 min;反应结束后立即冷却，
在 550 nm处测定吸光度值。
以恒重后 4-L-羟脯氨酸为标准品，配制 50 μg /
mL标准溶液。标准溶液稀释到不同浓度(1 ～ 5 μg /
mL)，同上反应，测定吸光度值。以 4-L-羟脯氨酸浓
度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 2 复合物的功能性质测定
2. 2. 1 溶解性
以氮溶解指数(NSI)反映蛋白质样品的溶解
性［10］。称取 0. 3 g 样品分散在 15 mL pH 值为 2、3、
4. 5、7 和 8 的磷酸钠缓冲溶液(0. 2 mol /L)中，振荡
1 h，10 000 × g下离心 15 min，测定上清液的可溶性
氮:
NSI /% =上清中可溶性氮量
样品总氮量
× 100
2. 2. 2 体外消化能力
参考 Yin等人［11］的方法，测定蛋白质样品的体
外消化能力。
胃蛋白酶水解:0. 1 g样品分散在 10 mL水中，调
节 pH值至 2. 0，加 2 mg 胃蛋白酶，37℃恒温反应 2
h;加 10 mL 200 g /L三氯乙酸(TCA)溶液终止反应;
10 000 × g下离心 20 min，收集上清液，加 4 倍体积蒸
馏水稀释，在 280 nm处测定吸光度值。
胃蛋白酶-胰蛋白酶水解:0. 1 g 样品经胃蛋白酶
水解 1 h，沸水浴加热 5 min，电热板上缓慢加热蒸干，
重新溶解于 10 mL 磷酸盐缓冲溶液(0. 2 mol /L，pH
8)中;加 6 mg胰蛋白酶，继续反应 1 h。后续处理方
法同上。
2. 2. 3 持水性
称取 0. 5 g样品于事先称重的离心管内，加一定
量蒸馏水，搅拌使蛋白样品与水充分混合，室温静置
1 h，3 000 × g 离心 20 min，弃上清液，称量离心管与
沉淀的重量［12］。蛋白质持水能力(WHC)计算如下:
WHC / ( g·g－1 ) =
W2 － W1
W0 － W
式中:W0，加入蛋白质干重，g;W1，离心管与干燥
蛋白质重量之和，g;W2，离心管与离心后沉淀重量之
和 g;W，上清液中溶解的蛋白质质量，g。
2. 2. 4 吸油性
称取 0. 5 g样品于事先称重的离心管内，加 5 mL
精炼大豆油，充分混合，室温放置 1 h，3 000 × g 离心
20 min，缓慢倒出未被吸附的大豆油，再次称重［13］。
蛋白质的吸油性(OAC)计算:
OAC /(g·g－1)=
W2 － W1
W0
式中:W0，加入蛋白质干重，g;W1，离心管与干燥
蛋白质重量之和，g;W2，离心管与离心后沉淀重量之
和，g。
2. 3 数据统计分析
采用 SPSS 16. 0 软件中 Duncan’s多重比较对试
验数据进行统计分析(P ＜ 0. 05)，利用 Excel 2003 软
件绘图报告结果。每组试验或分析重复数为 3 次。
3 结果与讨论
3. 1 三种复合物中 4-羟脯氨酸含量
对所得到的 3 种复合物中的 4-羟脯氨酸含量进
行分析，得到图 1 所示结果。酶促交联反应时明胶加
入量越高(例如酪蛋白-明胶比为 2 ∶ 1)，复合物中 4-
羟脯氨酸含量越高(51. 37 g /kg 蛋白质);反之，明胶
加入量越低(如酪蛋白-明胶比为 6 ∶ 1)，复合物中 4-
羟脯氨酸含量越低(25. 97 g /kg 蛋白质)。羟脯氨酸
是明胶特有的氨基酸［14］。4-羟脯氨酸含量越高，复
合物中明胶含量越多。因此，复合物中明胶的量与交
联反应底物中明胶的添加水平成正比。
3. 2 三种复合物的功能性质
3. 2. 1 溶解性
在 5 个 pH条件下对 3 种复合物的氮溶解指数
进行分析，得到图 2 所示结果。反应底物中明胶的添
加量越高，导致复合物在中性或弱碱性条件下的溶解
性越好，氮溶解指数大小顺序为复合物(2∶ 1) ＞复合
物(4∶ 1) ＞复合物(6 ∶ 1)，但是均低于酪蛋白。不
过，在 pH≤4. 5 的条件下，复合物的溶解性优于酪蛋
研究报告
2014年第 40卷第 1期(总第 313期) 21
图 1 复合物中 4-羟脯氨酸含量
Fig. 1 4-Hydroxyproline content of the
prepared composites
白，尤其是当反应底物中明胶的添加量较高，例如，复
合物(2∶ 1)的溶解性为最高。这是由于蛋白质交联
反应形成大分子聚合物时，因此溶解性降低;同时，交
联反应直接导致游离氨基减少，改变了其等电点［15］。
明胶具有良好的溶解性，等电点偏碱性;复合物中明
胶含量越高，酸性条件下溶解性越好。
图 2 不同 pH条件下 3 个复合物的溶解度
Fig. 2 Nitrogen solubility indices of the prepared
composites at five pH conditions
3. 2. 2 体外消化性
对复合物进行体外消化能力分析，得到的结果如
图 3 所示。在胃蛋白酶消化中，3 个复合物之间的差
异性不显著，但都低于酪蛋白。在胃蛋白酶-胰蛋白
酶消化中，3 个复合物的消化能力仍然低于酪蛋白，
吸光度值分别降低 27. 2%、15. 0%、11. 9%，并且复
合物(2∶ 1)的消化能力显著低于其他的复合物，呈现
出反应底物中明胶的添加量越高、复合物消化能力越
低的趋势。这是由于交联作用使得蛋白质中的肽键
不易被水解［17］，所以复合物的体外消化能力低于酪
蛋白。胃蛋白酶消化能力较弱，因此复合物在胃蛋白
酶水解过程中不能表现出显著的差异;胰蛋白酶具有
较强的水解能力，主要水解蛋白质中赖氨酸、精氨酸
的羧基构成的肽键［18］;明胶中赖氨酸、精氨酸含量低
于酪蛋白［19］，因此复合物(2∶ 1)中明胶含量高，更不
易被胰蛋白酶水解，相应的体外消化能力越低。
图 3 3 个复合物的体外消化性
Fig. 3 In vitro digestibility of the prepared composites
3. 2. 3 持水性和吸油性
对 3 个复合物的持水性进行评估，得到图 4 结
果。与酪蛋白(3. 17 kg /kg 蛋白质)相比，复合物具
有更强的持水能力。酶促反应中反应底物中明胶的
添加量高，复合物(2 ∶ 1)的持水性只有 19. 97 kg /kg
蛋白质;反之明胶的添加量低，复合物(6 ∶ 1)的持水
性高达 35. 08 kg /kg 蛋白质。蛋白质的交联能够显
著增强其持水能力［20 － 21］，所以复合物的持水性好于
酪蛋白。
对 3 个复合物的吸油性进行分析，得到结果如图
4 所示。复合物的吸油性也好于酪蛋白;另外，复合
物中明胶含量越高，例如复合物(2 ∶ 1)，其吸油能力
越强。蛋白质的吸油性主要依赖于其网络结构的物
理吸附［22］。蛋白质的交联、明胶的三螺旋结构均有
利于网络结构的形成和扩大。因此交联反应时反应
底物中明胶添加量越高，复合物的吸油性相对越强。
图 4 3 种复合物的持水性和吸油性
Fig. 4 Water holding capacity and oil absorption
capacity of the composites
4 结论
(1)在酪蛋白-明胶质量比为 2 ∶ 1、4 ∶ 1、6 ∶ 1条件
下制备的 3 个复合物，分别含 4-羟脯氨酸 51. 37、
33. 38、25. 97 g /kg蛋白质，复合物中明胶的量与反应
食品与发酵工业 FOOD AND FEＲMENTATION INDUSTＲIES
22 2014 Vol. 40 No. 1 (Total 313)
底物中明胶的添加水平成正比。
(2)复合物在酸性条件下的溶解性优于酪蛋白，
在中性或弱碱性条件下则低于酪蛋白;复合物具有好
于酪蛋白的吸水、吸油能力。其中，吸水性随着复合
物中明胶含量的增加而减弱，而吸油性则随复合物中
明胶含量增加而增强。
(3)复合物的体外消化能力显著低于酪蛋白，交
联反应时明胶添加水平较高(2∶ 1)时尤其如此。
参 考 文 献
［1］ Dichinson E. Enzymic cross-linking as a tool for food
colloid rheology control and interfacial stabilization ［J］.
Trends in Food Science and Technology，1997，8 (10):
334 － 339.
［2］ Motok M，Seguro K. Transglutaminase and its use for food
processing［J］. Trends in Food Science and Technology，
1998，9 (5) :204 － 210.
［3］ De Jong G A H，Koppelman S J. Transglutaminase cata-
lyzed reactions:impact on food applications［J］. Journal
of Food Science，2002，67 (8) :2 798 － 2 806.
［4］ Liu M，Damodaran S. Effect of transglutaminase-catalyzed
polymerization of β-casein on its emulsifying properties
［J］． Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，
47 (4) :1 514 － 1 519.
［5］ Domagala J，Wszolek M，Tamime A Y，et al. The effect of
transglutaminase concentration on the texture， syneresis
and microstructure of set-type goat’s milk yoghurt during
the storage period［J］. Small Ｒuminant Ｒesearch，2013，
112 (1 － 3) :154 － 161.
［6］ Damodaran S，Agyare K K. Effect of microbial transglu-
taminase treatment on thermal stability and pH-solubility of
heat-shocked whey protein isolate ［J］. Food Hydrocol-
loids，2013，30 (1) :12 － 18.
［7］ Mhd Sarbon N，Badii F，Howell N K. Preparation and
characterization of chicken skin gelatin as an alternative to
mammalian gelatin ［J］. Food Hydrocolloids，2013，30
(1) :143 － 151.
［8］ 张伊宁，赵新淮 . 酪蛋白与明胶的酶促交联与产物的流
变学性质［J］. 中国乳品工业，2011，39 (3):20 － 23.
［9］ Syk I，gren M S，Adawi D，et al. Inhibition of matrix
metalloproteinases enhances breaking strength of colonic
anastomoses in an experimental model［J］. British Journal
of Surgery，2001，88 (2) :228 － 234.
［10］ Bera M B，Mukherjee Ｒ K. Solubility，emulsifying，and
foaming properties of rice bran protein concentrates［J］.
Journal of Food Science，1989，54 (1) :142 － 145.
［11］ Yin S W，Tang C H，Wen Q B，et al. Functional proper-
ties and in vitro trypsin digestibility of red kidney bean
(Phaseolus vulgaris L. )protein isolate:Effect of high-
pressure treatment ［J］. Food Chemistry，2008，110
(4) :938 － 945.
［12］ Saetae D，Kleekayai T，Jayasena V，et al. Functional
properties of protein isolate obtained from physic nut (Jat-
ropha curcas L. )seed cake［J］. Food Science and Bio-
technology，2011，20 (1) :29 － 37.
［13］ Lin M J Y，Humbert E S，Sosulski F W. Certain func-
tional properties of sunflower meal products［J］. Journal
of Food Science，1974，39 (2) :368 － 370.
［14］ Lin Y K，Kuan C Y. Development of 4-hydroxyproline a-
nalysis kit and its application to collagen quantification
［J］. Food Chemistry，2010，119 (3) :1 271 － 1 277.
［15］ Agyare K K，Xiong Y L，Addo K. Influence of salt and
pH on the solubility and structural characteristics of trans-
glutaminase-treated wheat gluten hydrolysate ［J］. Food
Chemistry，2008，107 (3) :1 131 － 1 137.
［16］ Souissi N，Bougatef A，Triki-Ellouz Y，et al. Biochemical
and functional properties of sardinella (Sardinella aurita)
by-product hydrolysates［J］. Food Technology and Bio-
technology，2007，45 (2) :187 － 194.
［17］ Ｒoos N，Lorenzen P C，Sick H，et al. Cross-linking by
transglutaminase changes neither the in vitro proteolysis
nor the in vivo digestibility of caseinate ［J］. Kieler
Milchwirtschaftliche Forschungsberichte，2003，55 (4) :
261 － 276.
［18］ Kishimura H，Tokuda Y，Yabe M，et al. Trypsins from
the pyloric ceca of jacopever (Sebastes schlegelii) and
elkhorn sculpin (Alcichthys alcicornis) :Isolation and
characterization［J］. Food Chemistry，2007，100 (4) :
1 490 － 1 495.
［19］ Schrieber Ｒ，Gareis H. Gelatin handbook:theory and in-
dustrial practice［M］. Darmstadt，Germany:John Wiely
＆ Sons，2007:60.
［20］ Imm J Y，Lian P，Lee C M. Gelation and water binding
properties of transglutaminase-treated skim milk powder
［J］. Journal of Food Science，2000，65 (2) :200 －
205.
［21］ Lorenzen P C. Techno-functional properties of transglu-
taminase-treated milk proteins ［J］. Milchwissenschaft，
2000，55 (12) :667 － 670.
［22］ Kinsella J E. Functional properties of proteins in foods:a
survey［J］. Critical Ｒeciews in Food Science and Nutri-
tion，1976，7 (3) :219 － 280.
研究报告
2014年第 40卷第 1期(总第 313期) 23
Somefunctional properties of the composites enzymatic crosslinked from
casein and bovine gelatin mixed in different ratios
LUO Zhen-ling1，ZHAO Xin-huai2
(Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)
ABSTＲACT Casein and bovine gelatin were mixed in three ratios of 2 ∶ 1，4 ∶ 1，6 ∶ 1 (w /w)，respectively，and
treated by transglutaminase to prepare three casein-gelatin composites，which were then evaluated for their functional
properties to reveal whether the addition levels of bovine gelatin had impacts on the evaluated properties and if the
composites were potential as new protein ingredients for food processing． Under the selected reaction conditions such
as transglutaminase addition of 10 U /g protein，reaction temperature of 45℃ and reaction time of 4 h，together with
an isoelectric precipitation procedure for the prepared composites to remove the free and cross-linked gelatin，three
composites thus obtained had 4-hydroxyproline content of 51． 27，33． 38，25． 97 g /kg protein，respectively． The com-
posites had better solubility than casein at pH 4． 5 or lower pH，but showed lower solubility than casein at neutral or
alkaline conditions． Compared to casein，the composites had better water holding capacity and oil absorption capaci-
ty． The composite containing more gelatin also exhibited higher water holding capacity but lower oil absorption capaci-
ty． The composites showed lower in-vitro digestibility compared with casein，especially if more gelatin was crosslinked
into the composite．
Key words casein，gelatin，transglutaminase，crosslinking，functional property