全 文 ：生 物 技 术 2011 年 21( 1)
2 020． 9、1 993． 6、1 948． 2u /mL和 2 975． 5、2 893． 6、2 784． 5、2 639． 1
u /mL。它们的相对酶活力如图 10。
图 10 修饰胰蛋白酶与原胰蛋白酶的热稳定性比较
Fig． 10 Comparison of thermal stability of modified and original trypsin
由数据可知，将修饰酶液和原酶液置于 4℃下 2h后，二者
的酶活力最高;并且修饰酶保留了原酶活力的 69． 1%，活力较
原酶有所下降。但由图 10 可知，将酶置于 50℃ 2h后，原酶与
修饰酶分别保留了其置于 4℃ 2h后活力的 88． 7%和 94． 7%。
说明修饰酶较原酶具有较好的热稳定性。
3 讨论
近几年国内外采用高碘酸盐法修饰酶的报道并不多，而
选用麦芽糖作为修饰剂修饰酶的研究未有报道。韩薇妍等［9］
以 β －环糊精的链状衍生物和环状衍生物分别修饰超氧化物
歧化酶( SOD) 。以环状衍生物修饰 SOD 后，其耐酸性和热稳
定性均有所提高，而以链状衍生物修饰 SOD后，其耐酸性和热
稳定性均下降。采用链状衍生物修饰 SOD的原理与本试验相
同，但其结果与本试验稳定性提高的结果相反。原因可能是
麦芽糖的极性明显高于 β －环糊精的链状衍生物，连接到酶蛋
白上作为亲水的侧链基团，从而提高了胰蛋白酶的稳定性。
通过本试验得到以下结论: ( 1) 采用高碘酸钠氧化法制备
改性麦芽糖的最佳条件为: 高碘酸钠浓度 0． 05g /mL，高碘酸
钠与麦芽糖质量比 1． 1∶ 1，初始 pH 1． 0，反应时间 3h，反应温
度 30℃。在此条件下制得的改性麦芽糖中的醛基含量最高，
其值为 22． 349mmol /g。( 2) 采用改性麦芽糖化学修饰胰蛋白
酶的最佳条件为: pH6． 0，改性麦芽糖与胰蛋白酶质量比 1∶ 1，
反应温度 4℃，反应时间 24h。( 3 ) 在最佳条件下修饰胰蛋白
酶后，其耐碱稳定性和热稳定性均有所提高。
参考文献:
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药与饲料添加剂，2009，14( 4) : 26 － 28．
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草麻黄细胞悬浮培养体系的建立
张红梅1，蔡宝宏2，张连忠3，信佳言1
( 1．华北煤炭医学院生物科学系，河北 唐山 063000; 2．唐山市第一中学生物教研室，河北 唐山 063000;
3．唐山师范学院生命科学系，河北 唐山 063000)
摘要:目的:建立草麻黄悬浮培养体系。方法:采用组织培养的方法探讨了水解酪蛋白( CH) 、基本培养基、取材时间、和摇床
转速对麻黄愈伤组织悬浮培养的影响。结果:MS基本培养基、300mg / l水解酪蛋白、继代 25d的愈伤组织、转速 110r /min是愈伤
组织悬浮培养的适宜条件，愈伤组织细胞增殖量分别为 0． 76g、0． 80g、0． 80g、0． 80g。结论:初步选择出草麻黄愈伤组织细胞的悬
浮培养条件，为麻黄细胞扩大培养及有效成分提取奠定基础。
关键词:草麻黄;悬浮培养;水解酪蛋白;取材时间; 转速
中图分类号: Q949 文献标识码: A doi: 10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2011． 01． 029
Cell Suspension Culture of Ephedrae sinica Stapf
ZHANG Hong － mei1，CAI Bao － hong2，ZHANG Lian － zhong3，XIN Jia － yan1
( 1． Department of Biological Science，North China Coal Medical College，Tangshan 063000，China; 2． The First Middle
School of Tangshan，Tangshan 063000; 3． Department of Life Science，Tangshan Normal University，Tangshan 063000，China)
Abstract: Objective: To establish the suspension culture system of Ephedrae sinica Stapf callus． Method: The effect factors on casein hy-
drolysate，basal culture medium，sampling time and rotating speed of Ephedrae sinica Stapf suspension culture have been studied． Result:
The best condition for callus suspension culture was MS basal culture medium，300mg / l casein hydrolysate，callus generation of 25 days，
culture rotating speed of 110r /min． Reproduce amount of callus cell is respectively 0． 76g，0． 80g，0． 80g and 0． 80g． Conclusion: The
condition of Ephedrae sinica Stapf suspension culture was preliminary established． This test lay a foundation for the expanding culture and
extracting active ingredient of Ephedrae sinica Stapf cell．
Key words: Ephedrae sinica Stapf; suspension culture; casein hydrolysate; sampling time; rotating speed
收稿日期: 2010 － 07 － 29; 修回日期: 2010 － 11 － 08
资助项目:唐山市科技攻关项目( “草麻黄体外培养高产药用成分的研
究”，09130202 A － 3 － 1) 资助
作者简介:张红梅( 1977 － ) ，女，唐山人，硕士，讲师，从事植物基因工
程与分子生物学研究，发表论文 10 余篇。
麻黄( Herba Ephedrae) 作为一种传统中药材，性温、味辛、
微苦，具发汗解表、宣肺平喘、利水消肿的功效［1］。人们获取
麻黄碱的方法常以采集野生麻黄为代价。当采集量超过麻黄
自然资源的再生能力时，会导致麻黄物种濒危甚至灭绝。为
了解决药用植物的产量少，而需求多的矛盾，人们开始人工栽
培草麻黄，而人工种植的草麻黄产量、质量波动较大。因此，
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2011 年 21( 1) 生 物 技 术
应用细胞悬浮培养技术，提取麻黄次生代谢产物，进行工厂化
生产，可缓解当前麻黄资源匮乏的困境，是一种解决资源危机
的理想途径。本文系统探讨了草麻黄细胞悬浮培养体系的建
立，为细胞工厂化生产奠定基础。
1 材料和方法
1． 1 材料
由草麻黄子叶于 MS + 2，4 － D 2． 0mg / l + 6 － BA 1． 0mg / l
培养基上诱导出的愈伤组织，于MS + 2，4 － D 1． 5 + 6 － BA 1． 5
培养基上继代培养，取继代培养 25d的愈伤组织( 特殊情况除
外) 。
1． 2 方法
1． 2． 1 愈伤组织诱导及继代培养［2，3］
1． 2． 2 细胞悬浮培养的影响
取继代培养生长 5、7、10、15、20、25、30d 的松脆型愈伤组
织 2 ～ 3g( 干重约 0． 1g) ，用镊子将愈伤组织分散开，置于 40ml
相应 MS、White、B5、N6 基本培养基中进行悬浮培养。准确称
取每瓶接种的愈伤组织的干重量均为 0． 1g。培养温度 26℃，
摇床转速选 30、50、70、90、110、130、150r /min。培养 25d后，分
别过滤收集培养物，烘干，称重。每种培养基培养 5 瓶，将每
瓶增加的干重表示细胞的生长量，最后计算 5 瓶增长量的平
均增长干重。
培养过程中无特殊说明外，以 MS 为基本培养基，附加不
同种类和质量浓度的细胞分裂素和生长素，蔗糖 30mg / l，水解
酪蛋白加入量分别为 100、150、200、250、300 和 350mg / l，pH为
5． 8 ～ 6． 0。光照 12h /d，温度 25℃左右。
2 结果与分析
2． 1 水解酪蛋白对细胞悬浮培养的影响
以 MS + 2，4 － D 2． 0mg / l + 6 － BA 1． 5mg / l为基本培养基
激素组合，分别加入 100、150、200、250、和 300mg / l的水解酪蛋
白，转速 110r /min、培养 25d后的结果见表 1。由表 1 可知，在
相同的培养条件下，随着水解酪蛋白浓度的增加，悬浮培养愈
伤组织的增长量也逐渐增加，但当水解酪蛋白浓度增加到 350
mg /l时，悬浮培养物的增长量有所下降。此外，从愈伤组织的
生长状态可知，以 300、350 mg / l 水解酪蛋白浓度的生长状态
为好，因此实验确定 300 mg / l 水解酪蛋白适宜进行草麻黄细
胞悬浮培养。
表 1 水解酪蛋白对草麻黄细胞悬浮培养生长的影响
Tab． 1 Effect on casein hydrolysate to suspension culture of Ephedrae sini-
ca Stapf cell
水解酪蛋白浓度
( mg / l)
接种量
( 干重，g)
细胞增殖量
( 平均干重，g)
愈伤组织生长状况
100 0． 1 0． 29 细胞团发白，清亮
150 0． 1 0． 34 细胞团发白，清亮
200 0． 1 0． 64 浅绿色，培养液浓稠
250 0． 1 0． 67 浅绿色，培养液浓稠
300 0． 1 0． 80 绿色，培养液浓稠
350 0． 1 0． 76 绿色，培养液浓稠
2． 2 基本培养基对细胞悬浮培养的影响
愈伤组织于 MS、White、B5、N6 四种基本培养基中进行悬
浮培养，激素组合均为 2，4 － D 2． 0 mg / l + 6 － BA 1． 5mg / l。
从表 2 看出基本培养基对麻黄细胞悬浮培养的影响，MS 培养
基对麻黄细胞培养较适宜。
2． 3 取材时间对细胞悬浮培养的影响
分别取继代培养生长 5、7、10、15、20、25、30d的愈伤组织，
培养基配方均为 2，4 － D 2． 0 + 6 － BA 1． 5 + CH 300mg / l。从
表 3 可看出取材时间对愈伤组织的悬浮培养有一定影响，随
着所取愈伤组织继代时间天数的延长，悬浮培养细胞的增殖
量逐渐增加，但当所取愈伤组织继代时间为 30d 时，悬浮培养
细胞的增殖量降低，因此确定继代培养 25d 左右的愈伤组织
适宜进行悬浮培养。
表 2 基本培养基对草麻黄细胞悬浮培养生长的影响
Tab． 2 Effect on basal culture medium to suspension culture of Ephedrae
sinica Stapf cell
基本培养基
接种量
( 干重，g)
细胞增殖量
( 平均干重，g)
愈伤组织生长状况
MS 0． 1 0． 76 绿色，培养液浓稠
White 0． 1 0． 30 初期为绿色，后期褐化
B5 0． 1 0． 06 细胞团发白，清亮
N6 0． 1 0． 03 细胞团发白，清亮
表 3 取材时间对草麻黄细胞悬浮培养生长的影响
Tab． 3 Effect on sampling time to suspension culture of Ephedrae sinica
Stapf cell
取材时间
( d)
接种量
( 干重，g)
细胞增殖量
( 平均干重，g)
愈伤组织生长状况
5 0． 1 0． 57 绿色，培养液浓稠
7 0． 1 0． 56 绿色，培养液浓稠
10 0． 1 0． 60 绿色，培养液浓稠
15 0． 1 0． 67 绿色，培养液浓稠
20 0． 1 0． 74 绿色，培养液浓稠
25 0． 1 0． 80 绿色，培养液浓稠
30 0． 1 0． 76 绿色，培养液浓稠
2． 4 摇床转速对细胞悬浮培养的影响
实验所用培养基均为 2，4 － D 2． 0 + 6 － BA 1． 5 + CH
300mg / l。由表 4 可知，培养愈伤组织的摇床转速对其增殖量
也有影响。30、50、70、90、110r /min，随着转速的增加，悬浮培
养细胞增殖量也逐渐增加，但当转速超过 130r /min后，悬浮培
养细胞增殖量开始下降，原因有待进一步研究。因此确定愈
伤组织适宜进行悬浮培养的摇床转速为 110r /min。
表 4 转速对草麻黄细胞悬浮培养生长的影响
Tab． 4 Effect on rotating speed to suspension culture of Ephedrae sinica
Stapf cell
绕床转速
( r /min)
接种量
( 干重，g)
细胞增殖量
( 平均干重，g)
愈伤组织生长状况
30 0． 1 0． 48 绿色，培养液浓稠
50 0． 1 0． 50 绿色，培养液浓稠
70 0． 1 0． 56 绿色，培养液浓稠
90 0． 1 0． 64 绿色，培养液浓稠
110 0． 1 0． 80 绿色，培养液浓稠
130 0． 1 0． 63 绿色，培养液浓稠
150 0． 1 0． 58 绿色，培养液浓稠
通过实验研究，初步选择出培养草麻黄愈伤组织细胞的
基本培养基、水解酪蛋白浓度、愈伤组织取材时间、摇床转速
的理想范围，有效提高细胞的增殖量，为扩大培养和有效成分
提取奠定基础。
3 讨论
水解酪蛋白的加入有利于草麻黄愈伤组织的生长，但是
水解酪蛋白的浓度不宜太高，浓度高时反而不利于愈伤组织
增殖。，这与陈春伶［4］在对栓皮栎的研究中发现水解酪蛋白有
利于胚性组织增殖的研究结果一致。此外，张建瑛［5］对胡桃
楸胚性愈伤组织的诱导研究中，发现 700mg /L 水解酪蛋白有
利于愈伤组织的诱导。表明水解酪蛋白作为有机氮源在一定
程度上有利于愈伤组织的生长。悬浮培养过程中，基本培养
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生 物 技 术 2011 年 21( 1)
基、摇床转速的选择、接种的种龄对愈伤组织的增殖也有影
响。不同的基本培养基由于所含营养成分不同，因而对不同
植物体愈伤组织的生长有影响。这与陈书安等［6］对藏红花细
胞悬浮培养的研究结果一致。
药用植物细胞悬浮培养已被广泛应用于生物学的各个领
域，建立一个稳定的植物细胞悬浮培养体系十分重要。如通
过草麻黄细胞悬浮培养体系生产其次生代谢产物，必须建立
其悬浮培养体系，其中所选择的基本培养基、激素、水解酪蛋
白、取材时间等条件均影响细胞的悬浮生长，同时对其次生代
谢产物的合成也可能有影响。本研究初步建立了草麻黄细胞
悬浮培养体系，为下一步通过生物反应器规模化生产麻黄碱
奠定基础。
参考文献:
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青霉 SWD － 28 产低温纤维素酶发酵培养基研究
董硕1，2，迟乃玉1，2，张庆芳1，2*
( 1．大连大学生物工程学院，辽宁 大连 116622; 2． 辽宁省海洋微生物工程技术研究中心，辽宁 大连 116622)
摘要:目的:对青霉( Penicillium sp． ) SWD －28 发酵生产低温纤维素酶的培养基进行优化。方法:在单因素试验的基础上，采
用 Plackett － Burman( P － B) 设计和响应面试验设计( RSM) 对产酶进行优化。结果:影响 SWD － 28 产酶的主要因素为玉米粉、硫
酸铵和麸皮的添加量。培养基最佳组成浓度为玉米粉 2． 2%，硫酸铵 0． 24%，麸皮 1． 5%，磷酸二氢钾 0． 2%，氯化钠 1%，硫酸镁
0． 04%，氯化钙 0． 03%，吐温 － 80 0． 08%。结论:此时滤纸酶活力为 109． 8U /mL，是优化前的 2． 25 倍。
关键词:低温纤维素酶;青霉; Plackett － Burman;响应面法
中图分类号: Q939． 9 文献标识码: A doi: 10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2011． 01． 030
Research of Cold － active Cellulase Produced by SWD － 28 ( Penicillium sp． )
DONG Shuo1，2，CHI Nai － yu1，2，ZHANG Qing － fang1，2*
( 1． College of Bioengineer，Dalian University，Dalian 116622;
2． Liaoning Technology of Marine Microbiological Engineering Research Center，Dalian 116622，China)
Abstract: Objective: Penicillium sp． SWD －28 was selected as cold － adapted cellulase production strain for optimization of fermentation
medium． Method: Its cellulase production was studied under liquid fermentation condition with single factor，Plackett － Burman and re-
sponse surface method． Result: The optimal cultivation condition of SWD －28 was corn meal powder 2． 2%，ammonium sulfate 0． 24%，
branc 1． 5%，KH2PO4 0． 2%，NaCl 1%，MgSO4 0． 04%，CaCl2 0． 03%，Tween － 80 0． 08% ． Conclusion: Under the preferable condi-
tions，the FPase was 109． 8U /mL which is 2． 25 times of that before optimization．
Key words: cold － adapted cellulase; Penicillium sp; Plackett － Burman; response surface method
收稿日期: 2010 － 08 － 10; 修回日期: 2010 － 10 － 18
基金项目:国家“863”计划项目( “海洋低温纤维素酶中试研究及小规
模生产”，2007AA091505; “极端环境微生物资源的开发利用”，
2007AA021306) 资助
作者简介:董硕( 1984 － ) ，男，硕士生，研究方向: 微生物与发酵工程，
发表论文 10 篇，Email: skyhor@ 163． com; * 通讯作者: 张庆芳，Email:
zqf7566@ 126． com。
纤维素是自然界中公认的含量最丰富的天然可再生生物
资源［1，2］。目前常温纤维素酶生产菌的研究多集中在细菌方
面，如交替假单胞菌( Pseudoalteromonas) ［3］和芽孢细菌( Paeni-
bacillus) ［4］等。细菌所产的纤维素酶多为胞内酶，提取困难，
活力远不如霉菌。常温纤维素酶的高产菌以木霉、青霉、曲霉
的能力最突出，而作为近年来世界各国研究热点的低温纤维
素酶，其真菌源产生菌的研究相对较少［5 － 8］。同时随着生物
计算方法完善和计算机普及，响应面法为诸多科研领域广泛
应用。但是在微生物发酵中的应用还不是很广泛，特别在低
温纤维素酶的发酵方面未见报道。
故此，本文立足于利用青霉 SWD － 28 发酵生产低温纤维
素酶，在单因素的基础上，采用 Plackett － Burman 设计和响应
面设计，快速寻找主要因子，进而寻找最大响应区域，拟合数
学模型方程，获得了较为满意的结果，为将来的工业化推广应
用提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 菌株
青霉 SWD － 28 ( Penicillium sp． ) 由大连大学发酵工程实
验室分离筛选获得。
1． 1． 2 培养基
斜面培养基: 马铃薯 200g，葡萄糖 20g，琼脂 18g，蒸馏水
1 000mL，pH值自然;
种子培养基: 马铃薯 200g，葡萄糖 20g，蒸馏水 1 000mL，
pH值自然;
发酵培养基: 玉米粉 15g，麸皮 10g，硫酸铵 5g，磷酸二氢
钾 5g，蒸馏水 1 000mL，pH值自然。
根据研究需要，培养基成分的个别变动将在文中指出。
1． 2 方法
1． 2． 1 发酵方法
用接种环在培养斜面上挑取一环孢子接入种子培养基，
20℃、150r /min摇床振荡培养 20h，作为种子培养液，再将种子
培养液转接至发酵培养基中，20℃、150r /min 振荡培养。定时
取样测定发酵液中的酶活力，每个实验做 3 个平行。
1． 2． 2 低温纤维素粗酶液的制备方法
将发酵液于 4℃、6 000r /min下离心 15min，上清液即为粗
酶液。
48