全 文 ：文章编号:1009-2439(2001)03-0199-05
凤尾草抗菌药物的提取与开发研究
余有贵　赵良忠　段林东　李新社　舒叶平
(邵阳高等专科学校生物工程系　湖南邵阳 422004)
摘要:采用碱液提取凤尾草中的有效成分 , 确定了最佳提取方法;对提取物进行细菌和真菌的抑菌作用及最
低抑菌浓度的研究结果表明:该提取物对金黄色葡萄球菌 、枯草杆菌 、黑曲霉均有很强的抑菌效果 , 对大肠杆菌 、
青霉均有不同程度的抑菌效果 ,对黄曲霉基本上没有抑制作用.对金黄色葡萄球菌 、枯草杆菌 、黑曲霉的最低抑菌
浓度(提取物 g/ 100 ml培养基)分别为 0.59 , 0.72 , 0.78;对青霉 、枯草杆菌的最低抑菌浓度(提取物 g/ 100 ml培养
基)为 0.98、1.05.
关键词:凤尾草;碱液提取法;提取物;抑菌作用
中图分类号:R282.4　　　文献标识码:A
　　收稿日期:2001-06-27
凤尾草(Pteris multi f ida Poir),又名井栏边草 、小叶凤尾草 、蜈蚣蕨知 ,我国中草药资源丰富 ,并拥有
上千年的应用历史.据有关资料报道 ,凤尾蕨等 ,属于凤尾蕨科.据《新药志》介绍:它具有清热利湿 ,消肿解
毒 ,凉血止血 ,主治痢疾等功效.本研究旨在确定凤尾草中有效成分的最佳提取方法 ,对提取物进行抑菌效
果试验 ,为开发天然饲用抗菌添加剂筛选原料.
1　材料与方法
1.1　风尾草:采自邵阳高等专科学校的周围山坡.
1.2　供试菌种:(1)细菌类:大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Baci llus ubtcis)、金黄色葡萄球菌
(S taphy lococcus aureus ;(2)真菌类:黑曲霉(Aspergillus niger)、黄曲霉(Aspergi llus f lavus)、青霉
(Peniciuium S p.).以上菌种均为我校生物工程系微生物实验室提供.
1.3　培养基:细菌培养基:牛肉膏蛋白胨培养基;霉菌培养基:查氏培养基.
1.4　主要仪器与设备:真空浓缩装置 ,真空干燥箱 ,离心机 ,高压蒸汽灭菌锅.
1.5　试验方案
1.5.1　试验步骤
采凤尾草全草※清洗晒干※粗粹※提取※抽滤※滤液※测 OD 值(真空浓缩※抑菌实验)
↑
真空浓缩※抑菌实验
1.5.2　原料的处理:采集凤尾草全草去杂 ,洗涤干净 ,晒干或先在 60℃下烘干 ,用刀或剪刀将凤尾草破碎
成约 1 ～ 4 cm 长的碎片备用.
1.5.3　抗菌物提取方法
(1)用甲醇为溶剂:称取原料粗粉 5 g加入 40 ～ 60 ml的甲醇 ,进行沸水浴回流 10 ～ 30 min时间以后 ,
趁热过滤得滤液即提取物.取甲醇用量(A)和回流时间(B)两因素 ,其水平分别为 40 ,50 ,60 ml和 10 ,20 ,30
min按L0(2)3进行正交试验;
(2)用碱液提取:称取原料粗粉 5 g 加入 10 ～ 14倍的水 ,煮沸 ,在搅拌下缓慢加入饱和的石灰乳澄清溶
液调 pH 8 ～ 10后 ,继续加热微沸 30 min ,趁热抽滤 ,滤液在 60 ～ 70℃下用 6 mol/ l HCl调 pH 至 3 ～ 5 ,搅
第 14 卷　第 3 期 邵阳高等专科学校学报 Vol.14.No.3
2001 年 9 月 Journal o f Shaoyang College Sep.2001
匀 ,静置 24 h ,制得样品的原液.正交实验所取因素 、水平为 A:加水倍数 A 1 =10 A 2=12 A 3=1;B:煮沸后
的 pH值 B1 =8 , B2=9 ,B3 =10;C:用HCl沉淀时的pH 值:C1 =3 ,C2=4 ,C3=5 ,根据 L0(2)3 正交表确定最
佳提取条件.
1.5.4　真空浓缩　制得样品的原液在真空度 0.09 MPa(60℃)下浓缩 10倍
1.5.5　抑菌实验
(1)菌种活化:将大肠杆菌 、枯草杆菌 、金黄色葡萄球菌 、青霉 、黑曲霉 、黄曲霉分别进行接种扩大培养.
(2)制备 6 mm ～ 8 mm 的含抗菌物质的滤纸片:用打孔器打好直径 6 mm ～ 8 mm 的滤纸片 ,将
滤纸浸泡在A 2B2C1 原液中浸泡 4 h ,然后取出滤纸放入平皿中 ,再放进真空干燥箱中 ,真空度为 0.09 MPa
(60℃)的条件下约 10 min ,再干燥后盖上盖子取出 ,注意不要暴露于空气中 ,即制备好无菌干燥滤纸片备
用.
(3)灭菌　洗净后的培养皿用报纸包好洗净的试管分别用报纸扎好 ,与培养基一起放入高压蒸汽灭菌
锅中 121℃灭菌 20 min.
(4)制备无菌水　将装好自来水的试管(9 m l 支)包扎好后放入高压火菌锅中 121℃,灭菌 15 min.
(5)　无菌室的经灭菌消毒处理后进入无菌室操作　用接种环刮菌种放入装有无菌水的试管中 ,在试
管中加入无菌的玻璃珠 2 ～ 4粒 ,振荡试管 ,使细菌均心分散于无菌水中 ,制得原菌液 ,再用 10倍稀释法稀
释菌液 ,每个培养皿加入菌液 1ml.再倒培养基 10 ～ 15 ml 皿(注意培养基的温度在 45℃左右 ,不能过高)并
使菌液为培养基混和均心 ,待培养基凝固后 ,用无菌镊子夹取无菌滤纸片(每片直径为 7 mm)均匀的放置
在平皿中的培养基上 ,4 ～ 6片 皿.再放入恒温箱中培养 ,温度细菌:37度 ,24 h;青霉 32度 ,培养 2 ～ 3 d ,后
测量滤纸片周围抑菌圈的大小 ,并根据抑菌圈的大小确定抑菌的效果.
(6)　青霉素的对照实验
将青霉素 80×104(μmol min)依次配制成 10 000 , 1 000 ,800 ,500 , 200μmol min 6个浓度 ,在系列浓度
的青霉素液中分别浸泡 7 mm 滤纸片 ,代替样品浸泡后的滤纸片做成抑菌试验 ,测抑菌圈的大小.
图 1　风尾草碱液提取物的透光度
1.6　检测方法:
(1)凤尾草提取物中黄酮类物质的定
性测定　根据凤尾草的化学成分 ,用甲酸
回流一段时间以后 ,趁热过滤 , 取滤液 1
ml ,加 HCl 4 ～ 5滴及镁粉少量 ,溶液呈橙
红色 ,说明有黄酮类物质存在.
(2)凤尾草提取物在浸提效果测定 　
用 7520型分光光度计测定提取物的最大
吸收峰 ,然后在最大吸收峰的波长处测定
斜值.
(3)凤尾草提取物抑菌效果的测定　通过测量抑菌圈的直径确定 ,抑菌圈越大者效果越好.
(4)凤尾草提取物最低抑菌浓度的测定　将配制好的细菌或真菌培养基按每管 8 ml分别装入 100支
试管中取 0.1 ml大肠杆菌 、枯草杆菌 、金黄色葡萄球菌 、青霉 、黑曲霉分别装入上述 100 支试管中 ,重复 2
次 ,放入 32℃中恒温箱中培养 36 h后 ,用目测法观察混浊程度 ,混浊程度越低者效果越好.
2　实验结果与分析
2.1　凤尾草提取物中黄酮类物质的定性检测
在甲醇回流提取物中 ,取滤液 1m l ,加HCl4 ～ 5滴及镁粉少量 ,结果溶液呈橙红色 ,说明有黄酮类物质
存在 ,所以提取方法可行.
2.2　物最大吸收波长测定
2.2.1　先取甲醇提取滤液 1m l稀释 100 倍 ,用 7520 型分光光度计扫描凤尾草提取液的最大吸收波长 ,结
200　 邵阳高等专科学校学报 第 14 卷
果见表 1 ,从表中数据看出 ,最大吸收波长为 266 nm .以此波长测定凤尾草提取物浸提效果的依据.
表 1　凤尾草提取液扫描
波长 , nm 240 245 250 260 261 266 267 268 270 290 300 320 340
T 0.3 0.5 0.6 0.6 0.63 0.62 0.61 0.6 0.57 0.5 0.45 0.4 0.4
2.2.2　取碱提原液 1m l稀释 100倍 ,用分光光度计扫描出凤尾草提取液的最大吸收波长 ,结果见图 1 ,从
图中曲线看出 ,最大吸收波长为 266 nm.以此波长测定凤尾草提取物浸提效果的依据.
2.3　最佳提取工艺条件的确定
2.3.1　甲醇提取法　按 L9(2)3 正交实验的结果见表 2 ,表 2最佳提取条件的正交实验结果(L9(2)3).
表 2　最佳提取条件的正交实验结果(L9(2)3)
试验号 甲酸用量 回流时间 滤液体积 T A
1 40 10 25 20.2 0.695
2 50 10 38 23.0 0.639
3 60 10 44 26.4 0.580
4 40 20 39 22.5 0.649
5 50 20 40 15.16 0.811
6 40 30 20 17.8 0.756
7 40 30 20 17.8 0.756
8 50 30 38 24.8 0.606
9 60 30 40 19.2 0.720
Ⅰ水平一数值之和
Ⅱ水平二数值之和
2.1
2.05
1.914
2.07
Ⅲ水平三数值之和 1.91 2.082
极差 N 0.19 0.168
效率 N 3 0.063 0.036
　　由表 2分析得最佳提取方案为 A2 B3 即 5 g原料用 50 m l甲醇 ,回流时间为 30 min.经济效益分析:甲
酸价格贵 ,且有毒 ,一般不用此法提取.
2.3.2　采用碱液提取法提取
黄酮甙类虽有一定极性 ,可溶于水但却难溶于酸性水 ,易溶于碱性水 ,故可用碱性水提取 ,再在碱性水
中提取液中加入酸 ,黄酮甙类沉淀出 ,获得提取物.
由资料表明用碱酸提取时 ,要注意用碱浓度不宜过高 ,以免在强碱性下 ,尤其加热时破坏黄酮母核 ,在
加酸酸化酸性也不宜过强 ,以免生成锌盐 ,致使祈出的黄酮类化合物又重新溶解 ,以使上需含镁粉的杂质
生成钙盐沉淀 ,不致溶出 ,这将有利于黄酮类化合物的纯化处理[ 3] .
按 L9(3)3 正交表结果见表 2.从表中数据表明:效应值最大因素为 B即煮沸后 pH 值 ,其次是 A ,最后
是C.由表格数据分析得最佳提取方案为:B9A 2C1 .即加水倍数 12 ,煮沸后 pH 值为 9 ,用 HCl的沉淀的 pH
值为 3.
2.3.3　凤尾草碱法提取粗制品的提取率
称取原料 190 g ,加水 2 280 ml煮沸在搅拌下缓慢加入石乳调pH 值至 9 ,在此条件下煮沸 30 min ,乘热
抽滤得滤液 2 800 m l.用 6 mol l的 HCl调 pH 值至 3 ,静置 24 h ,用离心机离心(转速 30 000 r min)得沉淀
物 ,将沉淀物在真空干燥箱中干燥(真空度为 0.09 ～ 0.1 MPa、温度 60℃)干燥得粗粉 20 g ,提取充为:(20
190)×100%=10.5%
第 3 期 余有贵等:凤尾草抗菌药物的提取与开发研究 201　
表 3　碱液提取法的正交表
试验号 1 列 2 列 3列加水倍数 煮沸后 pH 值 用 HCl沉淀 A T
1 1 1 3 0.398 39.8
2 2 1 1 0.852 14.1
3 3 1 2 0.916 12.0
4 1 2 2 0.635 23.1
5 2 2 3 1.050 8.7
6 3 2 1 0.820 15.1
7 1 3 1 0.633 21.6
8 2 3 2 0.851 15.4
9 3 3 3 0.250 56.2
Ⅰ三次水平一的数值之和 1.695 1.41 2.335
Ⅱ三次水平二的数值之和 1.986 1.728 1.68
Ⅲ三次水平三的数值之和 1.067 1.097 0.725
极差效率值 0.350 0.366 0.240
　　注:极差:指三次水平数值之和的最大值与三次水平数值之和的最小值之差效应值:指极差除以 3所得的数值.
2.4　凤尾草碱法提取物抑菌效果
2.4.1　所得的实验数据如下表 4.
表 4　凤尾草碱法提取物抑菌效果
抑菌滤纸片片数 抑菌圈平均值 平均直径
培养器编号 1　2　3　4　5　6 1 2 3 4 5 6 原液(1 , 2 , 3) 浓缩液(4 , 5 , 6)
培养杆菌 3　4　5　5　5　6 10 12 12.5 15 16 15 11.5 15.3
枯草杆菌 4　4　6　4　6　6 12 14 14 16 17 18 13.3 17
金黄色葡萄球 6　6　6　6　6　6 14 16 16 18 20 19 15.3 19
青霉 4　5　5　5　6　6 14 10 10 11 15 16 11.3 14
黄曲霉 0　0　0　0　0　0 0 0 0 0 0 0 0　 0
黑曲霉 4　4　6　6　6　5 10 14 14 16 16 15 11.3 15.6
　　由表 4数据分析可得:提取物对金黄色葡萄球菌 、黑曲霉 、枯草杆菌 ,均有很强的抑菌效果 ,对大肠杆
菌 、青霉有较强的抑制作用 ,对黄曲霉几乎没有抑制作用.
2.4.2　青霉素的对照实验
将青霉素 80×104μmol min依次配制成 10 000 ,1000 , 800 ,500 ,200 μmol min 6个浓度 ,在系列浓度的
青霉素液中分别浸泡 7 mm 滤纸片 ,代替样品浸泡后的滤纸惩做成抑菌试验测得抑菌圈的大小见表 5.
表 5　不同浓度的青霉素的抑菌效果表
青霉素浓度μmol min 100 00 1 000 800 500 200 100
直径(mm) 完全抑制 22 18 17 14 12
　　由表格数据分析比较得:凤尾草原液相当于 200 μmol min青霉素 ,浓缩液相当于 800 μmol min青霉
素.
2.5　最低抑菌浓度测定
2000年 6月 4日 ,观察提取物对 5种供试菌种抑菌度试验结果见表 6.
表 6　提取物抑菌浓度试验结果
抑菌浓度系列
供试菌种 90% 80% 70% 65% 60% 55% 50% 45% 40%
大肠杆菌 +++ ++ ++ + - - - - -
枯草杆菌 ++ - - - - - - - -
金黄色葡萄球菌 +++ ++ ++ ++ ++ ++ +- - -
青霉 ++ +- - - - - - - -
黑曲霉 +++ ++ ++ +- - - - -
　　注:“ +”表示抑菌效果明显 , “ +”越多就越明显.“ -”表示抑菌效果不明显.
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3　结论与展望
3.1　试验结果表明:凤尾草碱液提取法提取的提取物对金黄色葡萄球菌 、枯草杆菌 、黑曲霉均有很强的抑
菌效果 、对大肠杆菌 、青霉 、均有不同程度的抑菌效果 ,对黄曲霉基本上没有抑制作用.对金黄色葡萄球菌 、
枯草杆菌 、黑曲霉的最低抑菌浓度分别为提取物 0.59 g 100 ml培养基 、提取物 0.72 g 100 m l培养基 、提取
物0.78 g 100 ml培养基;对青霉 、枯草杆菌的最低抑菌浓度为提取物 0.98 g 100 ml培养基 、提取物 1.05
g 100 m l培养基.
3.2　抑菌试验证明对大肠杆菌 、枯草杆菌 、金黄色葡萄球菌 、黑曲霉等均有较强的抑菌作用.尤其是对黑
曲霉有较强的抑菌作用 ,是本研究的新发现.
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Study pteris multifida poir action
and antimicroblal effect
ZHAI Liang_zhong　YU You_gui　DUAN Lin_dong 　LI Xin_shen　SHU Ye_pin
(Department of Mathemat ics , Shangyang Teachers College , Shaoyang 422004)
Abstract:Adhibil ly e distill efffectiv component of the pteris multifida poir.make sure best distill method The inverstgate reault
make know this distill substance have very strong antibacterial effect to staphy locoeeus aureus、bacillus bulcis 、Aspergillus niter;to
Escherichis coli、peniciuium sp.have antibacterial effect , best of low antibacterial concentration(g distill substance 100ml culture me-
dium)to staphy lococcus aureus、bacillus ubleis 、Aspcrgillus nigcr is 0.59 , 0.72 , 0.78 , to Escherichia co li、peniciuium sp is 0.98 , 1.
05.
Key words:Petris multifida poir , ly e distil me thod , distillsubstance antibacterial effect.
(责任编辑　钱关民)
第 3 期 余有贵等:凤尾草抗菌药物的提取与开发研究 203