全 文 ：安徽科技学院学报，2015，29(3) :25 ～ 30
Journal of Anhui Science and Technology University
收稿日期:2015 － 03 － 10
基金项目:安徽省自然科学基金项目(10040606Q13) ;国家自然科学基金(81403268)。
作者简介:周国梁 (1979 －) ，男，河南省浚县人，讲师，硕士，主要从事中药分析研究。
* 通讯作者:俞浩，副教授，E － mail :yhz_1230@ 163． com。
星点设计 －效应面法优化凤尾草总黄酮超声提取工艺
周国梁1，2，刘小胖1，3，俞 浩1* ，刘汉珍1，郭元新1，马世堂1
(1．安徽科技学院食品药品学院，安徽凤阳 233100;2． 安徽中医药大学，安徽合肥 230038;3． 温州医学院，浙江温州325000)
摘 要:目的:星点设计 －效应面法优化凤尾草总黄酮的提取工艺。方法:采用超声波提取法提取，在单因
素试验的基础上，以乙醇浓度(%)、提取时间(分钟)和料液比(倍数)为自变量，以凤尾草中总黄酮提取
率为考察量，利用线性多元回归和拟合二项式方程对自变量不同因素水平进行预测，设计星点设计 －效应
面法优化最佳提取工艺，并预测分析结果。结果:最佳提取工艺为乙醇浓度 63． 7%，提取时间 25． 80min，
液料比 44． 47 倍。凤尾草总黄酮提取率预测值为 1． 831%，与实际值 1． 814%的偏差为 － 0． 928%。结论:
试验设计简便合理，稳定可行，可预测性好。
关键词:凤尾草;总黄酮;超声提取;星点设计;效应面优化法
中图分类号: 文献标识码:A 文章编号:1673 － 8772(2015)03 － 0025 － 06
Optimal Extraction of Total Flavonoids from Pteris multifida with Ultrasonic Wave
by Central Composite Design －Ｒesponse Surface Methodology
ZHOU Guo － liang1，2，LIU Xiao － pang1，3，YU Hao1* ，LIU Han － zhen1，GUO Yuan － xin1，MA Shi － tang1
(1． College of Food and Drug，Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China;
2． Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230012，China;3． Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000，China)
Abstract:AIM:It is to optimize the extraction of total flavonoids in Pteris multifida by central composite design
－ response surface methodology． METHODS:With Ultrasonic wave extraction，the independent variables were
ethanol concentration(%) ，extraction time(min)and liquid － to － solid ratio(times) ，while the dependent varia-
ble was the extraction rate of total flavonoids in Pteris multifida on the basis of the single factor experiment of in-
fluencing factors． Linear or second － order quadratic models were used to estimate the relationship between inde-
pendent and dependent variables． Central composite design － response surface methodology was used to optimize
the process of extraction． Prediction was carried out through comparing the observed and predicted value． ＲE-
SULTS:The optimum extraction conditions were as follows，63． 7% ethanol concentration，extraction time for 25．
8 minutes，and liquid － to － solid ratio was 44． 7 times． Under these conditions，the experimental rate was 1．
814%，bias between predicted and observed rates was － 0． 928%，close to the predicted value 1． 831% ． CON-
CLUSION:The experimental design is simple，reliable and highly predictive．
Key words:Pteris multifida Poir;Total flavonoids;Ultrasonic wave extraction;Central composite design;Ｒe-
sponse surface methodology
凤尾草为凤尾蕨科植物凤尾草(Pteris multifida Poir)的干燥全草，主要功效为清热解毒，凉血止血，消
肿解毒［1］。凤尾草中的成分较多，其中主要含黄酮类、萜类、甾醇类等化学成分。根据近年文献报道表
明，凤尾草中黄酮类化合物在抗菌、抗病毒和抗肿瘤等方面具有明显活性，因此对其研究具有一定的研究
价值［2］。均匀设计和正交设计是对试验设计中常用的的工艺优化方法，但这两种方法在试验设计方面精
度不够，不能有效进行数学模型拟合［3］，星点设计试验方法在试验设计中具有较高的精确性，采用集数学
和统计学方法于一体的效应面优化法优化试验条件，该方法使用简便，结果分析较为精确，具有很高的应
用性。本研究旨在利用星点设计 －效应面法优化凤尾草中总黄酮提取工艺，为其提取工艺研究提供参考。
1 仪器与材料
1． 1 仪器与试剂
TU －1810PC紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司) ;JA3003 电子天平(上海方瑞精密
仪器有限公司) ;SHB － A96 型循环多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司) ;KQ － 250 型超声波清洗器
(合肥金尼克机械制造有限公司)。使用所有试剂均为分析纯;水为自制蒸馏水;芦丁标准品(中国食品药
品检定研究院，批号:100080 － 201309)。
1． 2 药材
凤尾草(Pteris multifida Poir)购自安徽亳州沪谯饮片厂(批号:20130615) ，经中药实验室刘汉珍副教
授鉴定为正品。
2 方法与结果
2． 1 凤尾草总黄酮含量测定
2． 1． 1 药材的处理 凤尾草在 60 ～ 70℃烘箱中恒温干燥 3 ～ 4h，粉碎过 40 目筛，冷冻保存备用。
2． 1． 2 线性关系考察 精密称取干燥至恒重的芦丁标准品 2． 00mg，置于 10mL容量瓶中，采用参考文献
方法［3］制定芦丁标准曲线，以芦丁对照品浓度 C(mg /mL)为横坐标，吸光度 A为纵坐标制备标准曲线，得
回归方程为:A =11． 72634C － 0． 07716，r = 0． 9995，芦丁在 10． 0 ～ 65． 0μg /mL 范围内其浓度与吸光度呈现
良好的线性关系。
2． 1． 3 凤尾草中总黄酮成分的提取 精密称取 5 份凤尾草粉末各 2． 00g，置 100mL 锥形瓶中，在一定乙
醇浓度、提取时间、料液比条件下超声波辅助提取，提取液离心后，抽滤除渣，得提液后，按照 2． 1． 2 中的方
法测定凤尾草中总黄酮含量，并计算提取率。每个试验重复做 3 次，取平均值。
总黄酮提取率(%)=样品溶液中的总黄酮量 /样品重 × 100%
2． 1． 4 精密度考察 精密吸取 2． 1． 2 项下对照品溶液，按照 2． 1． 2 条件下连续测定 6 次，记录吸光度，计
算 ＲSD为 1． 35%。
2． 1． 5 样品稳定性考察 取供试品溶液，在 0、1、2、4、6 h 按照 2． 1． 2 条件下分别测定吸光度，计算 ＲSD
为 1． 33%(n = 6) ，表明样品溶液在 6 小时内稳定。
2． 1． 6 加样回收试验 精密称定已知含量的凤尾草样品 2． 00g，置 9 个 50ml 的锥形瓶中，精密加入浓度
为 0． 238mg /mL的芦丁对照品溶液 1． 0、1． 0、1． 0、2． 0、2． 0、2． 0、3． 0、3． 0、3． 0mL，作为高、中、低浓度回收
率测定用样品，按 2． 1． 3 下方法制备，依照 2． 1． 2 下测定方法测定吸光度并计算回收率，结果平均回收率
为 98． 10%，ＲSD =1． 7%(n = 6) ，表明方法准确良好。
2． 2 单因素提取条件的选择［4 － 5］
2． 2． 1 乙醇浓度的选择 精密称取 5 份凤尾草粉末各 2． 00g，置于 100 mL 锥形瓶中，分别加入 40%、
50%、60%、70%、80%和 90%浓度的乙醇溶液 80mL，加热温度为 25℃，超声提取 30min。提取液离心，抽
滤除渣，得粗提液后，按照 2． 1． 3 中的方法测定凤尾草中总黄酮含量，并计算提取率。结果如图 1 所示。
从图 1 分析可以看出，凤尾草中总黄酮提取率并不随乙醇浓度的升高而增加。在乙醇浓度为 60%
时，总黄酮提取率出现峰值，之后开始下降。因此确定提取凤尾草总黄酮乙醇提取浓度范围为 40% ～
70%。
62 安徽科技学院学报 2015 年
图 1 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响
Fig． 1 Effect of Ethanol concentration on
extraction of the total flavonoids
图 2 提取时间对凤尾草中总黄酮提取率的影响
Fig． 2 Effect of extraction time on extraction
of the total flavonoids
2． 2． 2 提取时间的选择 精密称取 5 份凤尾草粉末各 2． 00g，置于 100 mL 锥形瓶中加入 60%乙醇溶液
80mL，加热温度为 25℃，超声提取时间分别 5、10、15、20、25、30min。提取液离心，抽滤除渣，得粗提液后，
按照 2． 1． 3 中的方法进行凤尾草中总黄酮含量测定，并计算提取率。结果如图 2 所示。
从图 2 分析可以看出，凤尾草中总黄酮提取率并不随提取时间的增加而增加。在提取时间为 20min
后，凤尾草中总黄酮提取率变化不大。因此确定提取总黄酮的最佳提取时间范围为 10min到 30min。
2． 2． 3 液料比的选择 精密称取 5 份凤尾草粉末各 2． 00g，置于 100 mL 锥形瓶中，分别加入 20、40、60、
80 和 100mL浓度为 60%的乙醇溶液，加热温度为 25℃，超声提 20min。提取液离心，抽滤除渣，得粗提液
后，按照 2． 1． 3 中的方法进行凤尾草中总黄酮含量测定，并计算提取率。结果如图 3 所示。
当液料比为 10 到 40 倍数时，随液料比的增加，凤尾草中总黄酮提取率也随之增加，在液料比为 50 倍
时，凤尾草中总黄酮提取率开始下降，所以料液比最佳范围选为 20 ～ 60 倍数。
图 3 液料比对凤尾草中总黄酮提取率的影响
Fig． 3 Effect of liquid － to － solid ratio on extraction of the total flavonoids
2． 3 星点设计试验
2． 3． 1 因素水平设计 以单因素试验结果为依据，乙醇浓度(%) (X1)、提取时间(min) (X2)及液料比
(倍数) (X3)为考察因素设计因素水平表
［6 － 10］，设计并建立因素水平表见表 1。
表 1 因素水平表
Table 1 Table of factors and levels
因素
水平
－ 1． 732 － 1． 0 0． 00 + 1． 0 + 1． 732
(X1)乙醇浓度 /% 40． 00 46． 30 55． 00 63． 70 70． 00
(X2)提取时间 /min 10． 00 14． 20 20． 00 25． 80 30． 00
(X3)液料比 /倍 20． 00 28． 50 40． 00 51． 50 60． 00
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2． 3． 2 星点设计试验分组及结果 根据试验因素水平设计，按照表 1 进行星点设计试验，结果见表 2。
表 2 星点设计试验分组及结果
Table 2 Composite design experimental group table and result
试验号 X1(乙醇浓度 /%) X2(提取时间 /min) X3(液料比 /倍数) Y(总黄酮提取率 /%)
1 － 1 － 1 － 1 1． 418
2 + 1 － 1 － 1 1． 174
3 － 1 + 1 － 1 1． 623
4 + 1 + 1 － 1 1． 406
5 － 1 － 1 + 1 1． 835
6 + 1 － 1 + 1 1． 420
7 － 1 + 1 + 1 1． 105
8 + 1 + 1 + 1 1． 898
9 － 1． 732 0 0 1． 271
10 + 1． 732 0 0 1． 326
11 0 － 1． 732 0 1． 322
12 0 + 1． 732 0 1． 615
13 0 0 － 1． 732 0． 899
14 0 0 + 1． 732 1． 489
15 － 20 0 0 0 1． 782
注:15 ～ 20 为重复试验取平均值。
2． 3． 3 模型建立及显著性检验 根据表 2 结果，利用 Design Expert 8． 0 软件，以总黄酮提取率为指标
(Y) ，采用线性多元回归和二项式方程对(X1、X2、X3)因素进行拟合，得出拟合方程如下:
线性多元回归方程:
Y = 0． 98214 + 8． 39884 × 10 －5X1 + 3． 42590 × 10
－3X2 + 4． 42374 × 10
－3X3 (Ｒ
2 = 0． 8428)
多元线性回归 Ｒ2 = 0． 8428，P = 0． 4395 ＞ 0． 01，结果分析拟合效果不佳，因此线性模型不能采用，故采
用二项式方程进行拟合。
二项式方程:
Y = －2． 84971 +0． 10065X1 －8． 88723 ×10
－3X2 +0． 084417X3 +3． 06183 ×10
－3X1X2 +1． 04698 ×10
－3X1
X3 － 1． 29310 × 10
－3X2X3 － 1． 85143 × 10
－3X21 － 2． 48122 × 10
－3X22 － 1． 32301 × 10
－3X23 (Ｒ
2 = 0． 8784)
对建立模型进行回归模型分析，结果见表 3。结果分析显示该模型具有显著性(P ＜ 0． 01) ，失拟项不
显著以及模拟相关性较好 Ｒ2 = 0． 8784，该方程拟合度和可信度均良好，误差较小，故可用采用此模型对凤
尾草总黄酮的提取工艺进行分析和预测。
表 3 回归模型分析
Table 3 The fitted value and F value P
方差来源 平方和 自由度 平均方差 F值 P值 显著性
模型 1． 21 9 0． 13 4． 34 0． 0059 ＊＊＊
A －乙醇浓度 1． 256* 10 －5 1 1． 256* 10 －5 4． 046* 10 －4 0． 9843
B －提取时间 0． 034 1 0． 034 1． 11 0． 3177
C －料液比 0． 020 1 0． 020 6． 32 0． 0307 *
AB 0． 019 1 0． 019 6． 15 0． 0326 *
AC 0． 088 1 0． 088 2． 83 0． 1236
BC 0． 060 1 0． 060 1． 92 0． 1964
A2 0． 026 1 0． 026 8． 51 0． 0154 *
B2 0． 084 1 0． 084 2． 69 0． 1319
C2 0． 43 1 0． 43 13． 70 0． 0041 ＊＊
残差 0． 31 10 0． 031
失拟项 0． 31 5 0． 062 4． 14 0． 0723
纯误差 6． 833* 10 －3 5 1． 376* 10 －3
总和 1． 52 19
注:差异极显著，＊＊＊P ＜ 0． 001;．差异高度显著，＊＊P ＜ 0 ． 01;显著，* P ＜ 0 ． 05。
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采用 F检验对二项式方程中的各项系数进行检验后，简化方程，删除不显著因素，简化后方程 Ｒ2 增
加，故可以采用简化方程，简化方程为:
Y =1． 71665 + 9． 75652 × 10 －4X1 + 0． 051015X
2 + 0． 12196X3 + 0． 16387X1X2 － 0． 12782X
2
1 － 0． 16477X
2
2
(Ｒ2 = 0． 8967)
2． 3． 4 效应面法优选工艺条件 应用 Deseign Expert 8． 0 软件制作三维曲面，以凤尾草中总黄酮提取率
为考察量，从三个变量中选择一个为不变量与另两个影响因素拟合为三维曲面图，以拟合目标函数建立数
学模型，绘制考察量曲面如下图 6 － 8，对结果进行分析，经简化后的二项式模型预测分析，凤尾草总黄酮
提取率最大值为 1． 831%，最优工艺为:乙醇浓度为 63． 70%，提取时间 25． 80min，液料比 44． 47 倍。
图 6 乙醇浓度、提取时间交互作用影响效应面图
Fig． 6 Correlative effects of ethanol concentration and extraction time
图 7 乙醇浓度、液料比交互作用影响效应面图
Fig． 7 Correlative effects of ethanol concentration and the ratio of liquid － to － solid
图 8 液料比、提取时间交互作用影响效应面图
Fig． 8 Correlative effects of liquid － to － solid and extraction time
2． 3． 5 最佳提取工艺的验证 按照优选出的凤尾草最佳提取工艺制备凤尾草样品溶液，即乙醇浓度
63． 7%，提取时间 25． 8min，液料比 44． 47 倍，做 3 组平行试验，结果平均值与拟合方程预测值相比较，
见表 5。
92第 29 卷第 3 期 周国梁，等 星点设计 －效应面法优化凤尾草总黄酮超声提取工艺
表 5 验证试验预测值与实际值
Table 5 Verification experiment predicted and actual values
组别
凤尾草总黄酮提取率预测值
(%)
凤尾草总黄酮提取率试验值
(%)
平均试验值
(%)
ＲSD
(%)
试验与预测值偏差率
(%)
1 1． 831 1． 858
2 1． 831 1． 801
3 1． 831 1． 783
1． 814 0． 02 － 0． 928
注:试验与预测值偏差率% =(平均试验值 －总黄酮提取率预测值)/总黄酮提取率预测值 × 100%。
验证得到实际值与预测值的偏差率为 － 0． 928%，偏差较小，表明预测值较为准确，模型预测性较好。
3 讨论
星点设计 －效应面法优化主要需要依靠合理的包括最佳试验条件的试验范围，本试验设计过程中为
了得到合理的较优的试验条件，首先进行了单因素条件考察，确定了优化条件的范围，因此在使用星点设
计 －效应面法之前，建立合理的试验各因素与水平非常重要［11］。
本试验设计中采用星点设计法克服了以往正交设计和均匀设计的缺陷，通过采用非线性拟合的中心
组合 －效应面法研究各因素间相互作用的一种回归分析方法。该法采用非线性数学模型拟合，在试验过
程中能够以中心点为中心，连续进行重复性试验不断提高试验精度，因此复相关系数较高，结果显示预测
值更接近真实值［12］。
在提取方法中，本试验采用超声波提取法，主要是利用超声波产生振动能够引起强烈空化效应和搅拌
作用，使药材植物细胞破裂，药材细胞中成分能够快速渗透到溶剂之中，加速了药材中的有效成分溶出，提
取时间缩短，提取效率大幅增加。该法所需设备简单，使用操作方便，并且在提取过程中温度较低，能够防
止黄酮类成分的氧化分解，所以比较适合该类成分的提取［13］。
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(责任编辑:马世堂)
03 安徽科技学院学报 2015 年