全 文 ：8第 1 3 卷 第 6 期
2011 年 6 月
辽 宁 中 医 药 大 学 学 报
JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM
Vol. 13 No. 6
Jun .，2011
山绿茶为冬青科植物海南冬青Ilex hainanensis
Merr. 的干燥叶经加工炮制而成，主要分布于广西、
广东一带，该药已收载于《广西中药材标准》（1990
年版）[1]。山绿茶具有清热解毒、消肿止痛、活血通
脉的功效。主要用于降血压、降血脂、降胆固醇及
冠心病、脑血管意外所致的偏瘫，以及风热感冒、肺
热咳嗽、咽喉水肿、扁桃体炎、痢疾等病症。目前对
山绿茶的研究主要集中在化学成分的提取分离与
鉴定 [2-3]，以及降压等药理 [4-5] 研究方面。本实验对
山绿茶药材指纹图谱进行了研究，为提高药材质量，
充分利用山绿茶药材资源，制定山绿茶规范化质量
标准，提高产品质量和市场竞争能力提供了理论依
据，并对广西地方中草药的开发利用起到促进作用。
1 材料、实验仪器与试剂
1.1 材料
实验药材为采集于广西上林县，经本文作者鉴
定为冬青科植物海南冬青Ilex hainanensis Merr.，共
13 批具体见表 1。山绿茶对照药材由中国药品生物
制品检验所提供（批号：1247-0301）。芦丁对照品由
中国药品生物制品检验所提供（批号：0080-9705，
供含量测定用）。
1.2 实验仪器
Agilent1100 高效液相色谱仪，含在线真空脱气
机（G-1322A），高压四元梯度泵（G-1311A），标准自
动进样器（G-1313A），智能化柱温箱（G-1316A），可
变波长检测器（G-1314A），Agilent1100 series 色谱
工作站（美国安捷伦科技公司）。LG-16W 高速微量
离心机（北京医用离心机厂）；B3500S-MT 超声波清
洗器（上海必能信公司）；Millipore Simplicity-185 超
纯水器（美国密里博公司）；BP211D 电子分析天平
（德国赛多利斯）。
表 1 实验用山绿茶药材的产地及采收时间
药材编号 药材来源 采收时间
1
2~13
对照药材
广西上林县
不详
2005.3— 2007.6
1.3 试剂
甲醇、乙腈（色谱纯），其他试剂均为分析纯。
2 实验方法与结果
2.1 参照物溶液的制备
取芦丁对照品 2mg，精密称定置 10mL 量瓶中，
用适量 50% 乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓
度为 0.2mg/mL 的对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备
取山绿茶药材干燥粉末 0.6g，精密称定，精密加
入 50% 乙醇 25mL，称重，超声处理 40min，放冷，称
重，补加 50% 乙醇至原重量，滤过，取续滤液离心，
广西山绿茶药材 HPLC 指纹图谱研究
陈勇 1，李立 2，谢臻 1，李兵 1，李耀华 1，黄颖 1
（1.广西中医学院药学院，广西 南宁 530001；2.广西南宁食品药品检验所，广西 南宁 530001）
摘 要：目的：建立山绿茶药材HPLC指纹图谱分析方法。方法：采用反相高效液相色谱法，C18 柱（5μm，4.6mm
×150mm），乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长340nm，柱温30℃，使用“计算机辅助相似度
评价软件”进行数据处理。结果：建立了山绿茶药材的HPLC指纹图谱，以芦丁为参照峰，确立了山绿茶药材指纹
图谱中的12个共有峰。结论：所建立的指纹图谱有较强的针对性，为山绿茶的研究开发以及制定山绿茶的质量标
准提供了科学依据。
关键词：山绿茶；芦丁；HPLC；指纹图谱
中图分类号：R282.71 文献标识码：A 文章编号：1673-842X (2011) 06- 0008- 03
收稿日期：2010-12-12
基金项目：广西自然科学基金项目（桂科自 054297）
作者简介：陈勇（1961-），男，江西南昌人，教授，学士，研究方向：中药质量分析研究。
Study on Fingerprints of Ilex hainanensis Merr. by HPLC
CHEN Yong1，LI Li2，XIE Zhen1，LI Bing1，LI Yao-hua1，HUANG Ying1
（1.Faculty of Pharmacy，Guangxi College of Tradional Chinese Medicine，Nanning 530001，Guangxi，
China；2.Nanning Institute for Food and Drug Control，Nanning 530001，Guangxi，China）
Abstract：Objective：To establish the HPLC fingerprints of Ilex hainanensis Merr. Methods：RP-
HPLC was used on a C18 column，with a mixture solution of acetonitrile and 0.1%H3PO4 as mobile phase
using a gradient elution. The flow rate was 1.0mL/min，the column temperature was 30℃，and the detection
wavelength was 340nm. Use the“Computer Aided Similarity Evaluation”software to compare the quality
of PLT. Results：The HPLC fingerprints of Ilex hainanensis Merr. showed 12 characteristic peaks，the
reference peak is Rutin. Conclusion：The fingerprint has pertinency. It can be used for the foundation of
quality control and further research of Ilex hainanensis Merr.
Key words：Ilex hainanensis Merr.；rutin；HPLC；fingerprint
DOI：10.13194/j.jlunivtcm.2011.06.10.cheny.092
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备用。
2.3 色谱条件
色 谱 柱 Shim-packVP-ODS（5μm，4.6mm×
150mm，岛津公司）。流动相按表 2 进行梯度洗脱。
表 2 色谱流动相洗脱程序
时间（min） 流动相 A（%） 流动相 B（%）
0 9 91
30 15 85
50 25 75
70 40 60
检 测 波 长 340nm；流 速 1mL/min；柱 温 30 ℃；
进样量 10μL；理论塔板数以芦丁峰计应不低于
10000。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验
取 编 号 为 9 号 的 供 试 品，按 供 试 品 溶 液 制
备 方 法 制 备，在 上 述 色 谱 条 件 下 记 录 指 纹 图
谱。 结 果 表 明，各 色 谱 峰 的 相 对 保 留 时 间 RSD
值 在 0.03%~0.32%，各 峰 相 对 峰 面 积 RSD 值 在
0.15%~1.85%。表明仪器的精密度良好。
2.4.2 稳定性试验
取编号为 9 号的供试品，按供试品溶液制备方
法制备，在上述色谱条件下，分别在 0、4、8、12、16、
24h 检测指纹图谱，结果表明，各色谱峰的相对保留
时间 RSD 值在 0.04%~0.29%，各峰相对峰面积 RSD
值在 0.24%~2.48%。
2.4.3 重复性试验
精 密 称 取 山 绿 茶 药 材 粉 末（9 号 药 材）6 份，
按供试品溶液制备方法制备，在上述色谱条件下
测定，记录指纹图谱，考察实验方法的重复性。结
果 表 明，6 份 样 品 各 色 谱 峰 的 相 对 保 留 时 间 RSD
值 在 0.01%~0.18%，各 峰 相 对 峰 面 积 RSD 值 在
0.74%~4.86%。
3 指纹图谱的建立及技术参数
3.1 参照色谱峰的建立
《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》
规定：制定指纹图谱必须设立参照峰，应根据供试
品中所含化学成分的性质，选择适宜的对照品作为
参照物；实验选取芦丁（5 号峰）作为参照物峰，进行
相对保留时间和相对峰面积的计算，符合指纹图谱
研究需要。在同样色谱条件下，取芦丁对照溶液和
山绿茶对照药材供试液分别进样，色谱图见图 1~2。
min0 10 20 30 40 50 60 70
mAU
0
20
40
60
80
100
VWD1 A, =340 nm (D:\ \ \ \20080227\20080227000009.D)
3
4.
09
5
图 1 芦丁对照品色谱图
min0 10 20 30 40 50 60 70
mAU
0
20
40
60
80
100
120
VWD1 A, =340 nm (D:\ \ \ \20070920000024.D)
1
2
3 4
5
6 7
8
9
10
11
12
图 2 山绿茶对照药材指纹色谱图
3.2 各批次山绿茶药材指纹图谱的采集
按照 2.2 项下的方法制备 13 批次山绿茶药材供
试品溶液，以《中药注射剂指纹图谱研究的技术要
求（暂行）》建立山绿茶药材 HPLC 指纹图谱。通过
记录 120min 图谱，可以看到 70min 后已无色谱峰出
现，从而确定指纹图谱的采集时间为 70min。取供
试品溶液依次进样，记录 13 批山绿茶药材 HPLC 色
谱图。13 批山绿茶药材 HPLC 叠加色谱图见图 3。
图 3 13 批山绿茶药材 HPLC 叠加色谱图
3.3 共有指纹峰的标定
实验借助了国家药典委员会颁布的《中药色谱
指纹图谱相似度评价系统 A 版》软件对指纹图谱的
相关参数进行自动匹配，标定药材的共有指纹峰，同
时给出对照指纹图谱等。采用软件自动匹配 13 批
次山绿茶药材 HPLC 图谱，标定其中匹配数目为 13
的 12 个色谱峰为共有指纹峰。选择山绿茶对照药
材图谱为参照图谱，以中位数法作为对照指纹图谱
的生成方法，设定时间窗宽度为 0.20min，山绿茶药
材的共有模式建立对照指纹图谱见图 4。
图 4 共有模式建立对照指纹图谱
峰面积占总峰面积 5% 以上的共有峰为：2、5、
9、10、12 号。本文选定指纹图谱中峰高和峰面积相
对适中的已知成分芦丁（5 号峰）为参照峰。以参
照峰的保留时间和峰面积作为 1，分别计算共有指
纹峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，不
同批次山绿茶药材共有峰相对保留时间 RSD 小于
0.2%，而相对峰面积 RSD 较大。由此可知，本实验
建立的色谱方法可以使不同批次山绿茶药材具有基
本一致的色谱行为，但药材之间各种化学成分的含
量受多种因素的影响具有较大差异。
3.4 山绿茶药材相似度评价
本实验采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系
统 A 版》对山绿茶药材 HPLC 指纹图谱进行相似度
计算，计算结果见表 3。13 批次山绿茶药材与对照
指纹图谱的相似度计算结果均大于 0.9，表明各批次
山绿茶药材与对照指纹图谱有较好的一致性，本方
法可用于综合评价药材的整体质量。
4 讨论与小结
为了使山绿茶药材中的主要化学成分能够在
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HPLC 指纹图谱中得到充分反映，必须确定一个有
效的色谱分离方法与条件。实验过程中对色谱柱、
流动相、柱温、流速及检测波长等几个方面进行了考
察，最后确定了实验所采用的色谱条件。
表 3 山绿茶药材 HPLC 指纹图谱相似度计算结果
山绿茶药材 相关系数 1 相关系数 2
对照药材 1 0.985
药材（2005 年 3 月） 0.937 0.964
药材（2005 年 4 月） 0.979 0.976
药材（2005 年 5 月） 0.889 0.944
药材（2005 年 6 月） 0.937 0.964
药材（2006 年 3 月） 0.985 0.993
药材（2006 年 4 月） 0.983 0.972
药材（2006 年 5 月） 0.969 0.951
药材（2006 年 6 月） 0.981 0.978
药材（2007 年 3 月） 0.953 0.988
药材（2007 年 4 月） 0.986 0.970
药材（2007 年 5 月） 0.985 0.993
药材（2007 年 6 月） 0.952 0.988
注：1. 以山绿茶对照药材为模板；2. 以 13 批药材均值为
模板。
实验比较了提取溶剂，结果表明以 50％乙醇为
提取溶剂时，峰面积大，整体基线好。实验比较了提
取方法，结果以超声提取法各峰面积较大。
本实验借助《中药色谱指纹图谱相似度评价
系统 A 版》软件对指纹图谱相关参数进行自动匹
配，标定了 13 批山绿茶药材的共有指纹峰，避免人
工判峰的盲目性，保证共有峰确定的公正和客观。
在本实验过程中，选取了已知有效成分芦丁为参照
物，并用其进行相对保留时间和相对峰面积的计
算，在今后的实验研究中应尽可能设立多个参照
物，以便获得更多信息，使山绿茶药材 HPLC 指纹
图谱更完善。
本实验是参考《中药注射剂指纹图谱研究的
技术要求（暂行）》的相关要求建立了山绿茶药材的
HPLC 指纹图谱，对指纹图谱的相关项目进行了考
察。建立的山绿茶指纹图谱的特征共有色谱峰，可
为山绿茶药材的鉴别提供了可靠的科学依据。目前
山绿茶药材中有的化学成分还不完全清楚，未能对
指纹特征共有色谱峰进行峰的归属，各色谱峰对应
功效、药理不清，未能做到谱效关系对应，仍需进一
步对山绿茶指纹共有特征峰的化学成分及其药理做
深入研究。◆
参考文献
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技出版社，1992：20，137-138.
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1984，19 ( 9 )：691.
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医结合杂志，2001，21 ( 2 )：134-135.
强精煎对小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因表达影响的研究
宾彬，王杰，陈定雄，莫秋柏，徐杰新，崔锦珠
（广西中医学院第一附属医院，广西 南宁 530023）
摘 要：目的：观察强精煎对实验小鼠睾丸Fas、Fasl、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。方法：将80只健康雄性昆
明种小鼠分为正常组、模型组、强精煎组、黄精赞育胶囊组，以环磷酰胺注射液40mg/kg腹腔注射制造小鼠生精功
能障碍模型，以HE染色观察小鼠睾丸病理形态，采用Johnson 评分评价精子发生和发生障碍程度，用免疫组织化学
SABC法检测Fas、Fasl、Bcl-2和Bax蛋白在小鼠睾丸实质组织中的表达率。结果：模型组小鼠睾丸组织可见明显的
病理损伤，强精煎组则生精功能良好，黄精赞育胶囊组稍差。与正常组比较，模型组Johnson 评分偏低，且Fas和Fasl
蛋白表达率偏高（P<0.01），强精煎组和黄精赞育胶囊组与正常组各方面差异均无统计学意义（P>0.05）。与模型组
比较，正常组、强精煎组和黄精赞育胶囊组睾丸Johnson评分偏高，Fas、Fasl和Bax 蛋白表达率显著降低（P<0.01），
Bcl-2表达率显著升高（P<0.01），细胞内 Bcl-2/Bax比值显著升高（P<0.01）。结论：强精煎可以抑制Bax、Fas和
Fasl，并促进Bcl-2蛋白在受损伤小鼠睾丸实质组织中的表达。
关键词：强精煎；生精功能障碍；实验研究；细胞凋亡
中图分类号：R321.1 文献标识码：A 文章编号：1673-842X (2011) 06- 0010- 03
收稿日期：2010-12-14
基金项目：广西中医学院自然科学基金项目（Y2007023）；广西壮族自治区卫生厅计划课题（Z2007111）；广西壮族自治区教育厅面上项目
（200610MS191）
作者简介：宾彬（1965-），男，广西平南人，教授、主任医师，硕士生导师，研究方向：男性生殖医学与性医学。
Experimental Study of Effects of“Qiangjing Decoction”on Expression of Genes
Related Apoptosis of Spermatogenic Cells in Model-mouses Testis
BIN Bin，WANG Jie，CHEN Ding-xiong，MO Qiu-bai，XU Jie-xin，CUI Jin-zhu
（First Hospital Affiliated to Guangxi College of Traditional Chinese
Medicine，Nanning 530023，Guangxi，China）
Abstract：Objective：To study the effects of“Qiangjing Decoction”on the expression of Fas，Fasl，