全 文 ：连作对地黄根际土壤细菌群落多样性的影响*
张重义1,2 摇 陈摇 慧2 摇 杨艳会1 摇 陈摇 婷2 摇 林瑞余2 摇 陈新建1 摇 林文雄2**
( 1 河南农业大学中药材系, 郑州 450002; 2 福建农林大学农业生态研究所, 福州 350002)
摘摇 要摇 采用末端限制性片段长度多态性(T鄄RFLP)技术研究地黄连作下根际土壤细菌群落
的动态变化.结果表明:地黄根际土壤细菌群落的香农多样性指数、丰富度指数和相似性指数
均为对照(CK)>1 年>2 年,地黄连作下细菌优势种群的比例显著下降,种植 1 年土壤中厚壁
菌门的芽孢杆菌纲在整个细菌群落中处于主导地位, 而种植 2 年土壤中变形菌门 着鄄变形菌
纲处于主导地位.地黄连作使其根际土壤细菌种类大量减少,群落结构趋于简单.连作后细菌
群落多样性水平的变化导致根际土壤微生物群落功能的失调,可能是引发连作障碍的原因之
一.
关键词摇 末端限制性片段长度多态性摇 连作摇 地黄摇 根际土壤摇 细菌群落
文章编号摇 1001-9332(2010)11-2843-06摇 中图分类号摇 S567摇 文献标识码摇 A
Effects of continuous cropping on bacterial community diversity in rhizosphere soil of
Rehmannia glutinosa. ZHANG Zhong鄄yi1,2, CHEN Hui2, YANG Yan鄄hui1, CHEN Ting2, LIN
Rui鄄yu2, CHEN Xin鄄jian1, LIN Wen鄄xiong2 ( 1Department of Chinese Medicinal Materials, Henan
Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2 Institute of Agroecology, Fujian Agriculture
and Forestry University, Fuzhou 350002, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2010,21 (11): 2843 -
2848.
Abstract: In this paper, T鄄RFLP ( terminal restriction fragment length polymorphism) technique
was adopted to study the dynamic changes of bacterial community in the rhizosphere soil of continu鄄
ously cropped Rehmannia glutinosa L. The results showed that the Shannon diversity index,
Margalef index, and similarity index of bacterial community in the rhizosphere soil all decreased in
the order of control > one鄄year cropping > two鄄year continuous cropping. Under continuous crop鄄
ping, the proportion of dominant bacterial species declined obviously. In one鄄year cropping soil,
the class Bacilli of phylum Firmicute dominated the bacteria community; while in two鄄year continu鄄
ous cropping soil, the class Epsilonproteobacteria of phylum Proteobacteria became dominant. Con鄄
tinuous cropping of R. glutinosa decreased the bacteria species, and simplified the bacterial com鄄
munity structure. The changes of bacterial community diversity under continuous cropping of R.
glutinosa led to the disorder of the functions of bacterial community, and thereby, the destruction of
the ecological balance in rhizosphere soil, which might be one of reasons causing the obstacles of
continuous cropping of R. glutinosa.
Key words: T鄄RFLP; continuous cropping; Rehmannia glutinosa; rhizosphere soil; bacterial com鄄
munity.
*国家自然科学基金项目(30772729, 30671201)和国家“十一五冶科
技支撑计划项目(2006BAI09B03)资助.
**通讯作者. E鄄mail: wenxiong181@ 163. com
2010鄄04鄄16 收稿,2010鄄08鄄30 接受.
摇 摇 地黄(Rehmannia glutinosa)为玄参科多年生草
本植物,以干燥块根入药,是我国著名的常用大宗药
材,在我国栽培历史悠久. 地黄生产中,遇到的突出
问题是连作障碍,地黄是根及根茎类中药材中连作
障碍表现最为严重的药用植物之一[1-3] . 本课题组
经过 2007、2008 连续 2 年的试验和观察发现,连作
地黄植株生长前期并不表现为常见的抑制出苗和病
害严重,而是表现为:地上植株生长较慢,植株矮小,
生长势弱,地下块根不能正常膨大,根冠比失调,最
后不能正常生长,生育期缩短,不能形成商品药材,
如何解决连作障碍是地黄生产以及中药产业可持续
发展中亟待解决的重大课题.
应 用 生 态 学 报摇 2010 年 11 月摇 第 21 卷摇 第 11 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Nov. 2010,21(11): 2843-2848
目前,有关连作障碍的研究主要集中在根系分
泌物的自毒作用[4-6]、土壤理化性状劣变[7-8]、土壤
传染性病虫害的发生[9-10]等方面.据报道,根系分泌
物对土壤微生物、尤其是土传病害的病原微生物的
选择性促进以及由此导致的土壤微生态系统失衡,
是引发连作障碍的主要原因之一[11-15] . 一般来说,
土壤中细菌在三大微生物类群中占主要部分,它在
植物根系的微生态环境中对物质和能量转化起重要
的作用[16] .然而,造成地黄连作根际土壤微生物区
系特别是未培养微生物变化的研究还未见报道. 为
此,本文从根际微生物的微生态角度出发,利用现代
分子生物学 T鄄RFLP 技术,对地黄连作的根际土壤
细菌群落动态变化进行了研究,对于深入揭示地黄
连作障碍的产生机理, 建立田间生态控制技术体系
有着极其重要的理论与实际意义.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试材料
试验在河南省焦作市武陟县阳光农业示范园进
行, 土壤样品取自种植年限为 1 年(头茬)和 2 年
(重茬)的地黄(Rehmannia glutinosa) 品种“温 85鄄
5冶根际土壤,取邻近未种植地黄的空白地、距地表 5
~10 cm的土壤为对照(CK). 2009 年 8 月 30 日,在
地黄的块根膨大期取土样,每处理取 15 株,采用抖
落法收集根际土壤,均匀混合,过 80 目筛,放于-80
益超低温冰箱中,备用于土壤 DNA的提取.
1郾 2摇 测定方法
采用末端限制性酶切长度片段多态性( terminal
restriction fragment length polymorphism, T鄄RFLP)技
术分析土壤细菌群落,具体方法如下:
1)土壤微生物 DNA 的提取与纯化摇 土壤微生
物总 DNA 的提取采用 SDS鄄高盐缓冲液抽提
法[17-18] . 1%琼脂糖凝胶电泳检测后,用 UNIQ鄄10 柱
式 DNA胶回收试剂盒(上海生工)回收纯化,电泳
检测后保存于-20 益备用.
2)细菌 16S rDNA 的扩增和酶切 摇 用带 FAM
荧光标记的细菌通用引物 8F鄄FAM(5爷鄄AGAGTTT鄄
GATCCTGGCTCAG鄄3爷)和 926(R5爷鄄CCGTCAATTC鄄
CTTTRAGTTT鄄3爷)扩增 16S rDNA片段. PCR扩增采
用 4 管平行,反应体系 25 滋l 包括:10 伊PCR buffer
2郾 5 滋l(含 Mg2+),dNTP(25 滋mol·L-1 )2 滋l,引物
(10 滋mol·L-1)各 0郾 8 滋l, rTaq 酶 0郾 15 滋l,BSA 2
滋l,模板 1 滋l郾 反应条件:94 益预变性 5 min;94 益
变性 1 min,49郾 5 益退火 45 s,72 益延伸 1 min,35 个
循环;最后 72 益延伸 3 min.取 5 滋l用 1%琼脂糖凝
胶进行电泳检测. 4 管混合后用 UNIQ鄄10 柱式 DNA
胶回收试剂盒回收.用限制性内切酶Msp玉和 Hae芋
消化纯化后的细菌 16S rDNA的 PCR产物,于 37 益
消化 3 h. Msp玉酶切体系 20 滋l 包括:1 滋l Msp玉,2
滋l T缓冲液,2 滋l BSA,5 滋l 超纯水(ddH2O),10 滋l
PCR 产物,37 益温浴 5 h. Hae 芋酶切体系 30 滋l 包
括:1 滋l Msp玉,2 滋l H 缓冲液,7 滋l ddH2O,10 滋l
PCR 产物,37 益温浴 5 h.
3)毛细管电泳与测序分析 摇 酶切产物脱盐后
与上样缓冲液和标准 Marker ( GeneScan鄄500郾 1,
Applied Biosystems)混合,96 益变性 4 min,迅速置于
冰上,然后在 ABI 自动测序分析仪 ( model 3130
Applied Biosystems)上进行毛细管电泳.
1郾 3摇 数据分析
末端限制性片段( terminal restriction fragments,
T鄄RFs)的大小和强度图采用 GeneMarker V1郾 2 软件
分析处理. 细菌序列的长度与 Ribosomal Database
Project 域数据库进行对比,找出 T鄄RFs 所对应的细
菌类群 ( http: / / wdcm. nig. ac. jp / RDP / trflp / # pro鄄
gram).每个 T鄄RF的丰度百分比(Ap)按照公式 Ap =
ni / N伊100 计算,其中 ni 代表每个可分辨的 T鄄RF 的
峰面积,N代表所有 T鄄RF峰面积的总和[19] .种群多
样性指数用 BIO鄄DAP 软件计算. 依据公式 Cs =
2NA+B / (NA+NB)计算样品之间 Sorenson[20-21]的相似
系数,其中 NA+B是指两样品共有的条带数目,NA、NB
是指两样品各自包含的条带数目.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 地黄根际土壤细菌 Msp玉和 Hae芋的 T鄄RFLP
图谱分析
从 PCR产物分别用限制性切酶 Msp玉、Hae芋进行
酶切,毛细管电泳后采用 GeneMarker V1郾 2 软件对测
序进行处理,从图 1和图 2可以看出不同种植年限地
黄根际细菌群落在块根膨大期存在明显差异.
2郾 2摇 地黄根际土壤细菌群落结构多样性的变化
由表 1 可以看出,地黄不同种植年限根际土壤
细菌群落多样性指数和丰富度指数的变化规律均为
CK>1 年>2 年,均为 CK 土最高,2 年土壤最低,连
作年限为 2 年的地黄根际土壤细群落的多样性指数
和丰富度指数分别比对照降低了 9郾 8%和 31郾 8% .
即土壤中细菌群落的多样性水平以对照土最高,其
次为种植 1 年的正茬土壤,而种植 2 年的重茬土壤
多样性水平最低.表明种植地黄后的土壤细菌群落
结构多样性水平下降,而且连作后下降明显.
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图 1摇 不同处理地黄根际细菌 Msp玉的 T鄄RFLP分析图谱
Fig. 1摇 T鄄FRLP profiles digested by Msp 玉 of the rhizospheric bacterial community under different treatments.
a) 对照 CK; b) 1 年 One鄄year; c) 2 年 Two鄄year. 下同 The same below.
图 2摇 不同处理地黄根际细菌 Hae芋 T鄄RFLP分析图谱
Fig. 2摇 R鄄TFLP profiles digested by Hae芋 of the rhizospheric bacterial community under different treatments.
2郾 3摇 地黄土壤细菌群落结构的相似性
从地黄不同种植年限根际土壤细菌群落结构相
似性系数分析(表 2)可知,种植地黄后 1、2 年土壤
根际细菌群落结构与 CK土壤的根际细菌群落结构
相似性系数均小于 0郾 5;随着种植年限的增加,其相
似性系数逐渐下降,CK与 2 年的土壤细菌群落结构
差异最大,其相似性系数为 0郾 429.表明种植地黄后
土壤细菌群落结构发生了较大变化,且连作会使根
际土壤的细菌群落发生较大改变.
2郾 4摇 地黄土壤细菌群落组成
用 Msp玉和 Hae芋两种酶进行 T鄄RFs 片段比对
(表 3),从 CK、1 年和 2 年土样分别获得 145、123 和
548211 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 张重义等: 连作对地黄根际土壤细菌群落多样性的影响摇 摇 摇 摇 摇 摇
表 1摇 地黄根际土壤细菌群落多样性指数变化
Tab. 1摇 Changes in diversity index of bacterial community
in rhizospheric soil of Rehmannia glutinosa
项目
Item
样品 Sample
对照
CK
1 年
One鄄year
2 年
Two鄄year
多样性指数 Diversity index 3郾 88a 3郾 70a 3郾 50b
丰富度指数 Richness index 13郾 04a 10郾 64b 8郾 90c
同行不同字母表示差异显著(P<0郾 05) Different small letters in the
same line indicated significant difference at 0郾 05 level.
表 2摇 地黄根际土壤细菌群落的相似性系数
Tab. 2 摇 Similarity coefficient of bacterial community in
rhizospheric soil of Rehmannia glutinosa
处理
Treatment
对照
CK
1 年
One鄄year
2 年
Two鄄year
对照 CK 1
1 年 One鄄year 0郾 448 1
2 年 Two鄄year 0郾 429 0郾 490 1
81 个片段, 3 种土壤样品中相同的片段共有 33 个,
CK与 1 年土样相同的片段有 27 个,CK与 2 年土壤
相同的片段有 14 个,1 年与 2 年土样相同的片段有
17 个. CK、1 年和 2 年特有的片段分别是 71、46 和
17 个.可见,种植地黄后根际土壤中细菌种类和群
落结构发生了巨大的变化,种植 1 年的土壤细菌群
落种类较 CK 下降了 15郾 2% ,种植 2 年的根际土壤
细菌种类较 CK 下降了 44郾 1% .表明连作地黄使根
际土壤细菌群落组成趋于简单.
2郾 5摇 种植 1 和 2 年的地黄根际土壤细菌群落 T鄄
RFs差异片段比较
为了进一步分析地黄连作后根际土壤细菌种群
之间的差异,将种植 1 和 2 年的特有片段进行比较
显示,随着地黄种植年限的增加,细菌种类变得越来
越单一,各种类的数量也不断减少,其多样性水平呈
表 3摇 不同处理土壤 T鄄RFs片段异同
Tab. 3摇 Sameness and difference of T鄄RF fragments in soil samples under different treatments
处理
Treatment
相同的 T鄄RFs片段数 Number of the same T鄄RFs
CK与 1 年
CK and
One鄄year
CK与 2 年
CK and
Two鄄 year
1 年与 2 年
One鄄year
and Two鄄year
特有 T鄄RFs片段数 Number of special T鄄RFs
对照
CK
1 年
One鄄 year
2 年
Two鄄 year
对照 CK 27 14 0 71 0 0
1 年 One鄄year 27 0 17 0 46 0
2 年 Two鄄year 0 14 17 0 0 17
下降趋势,1 年土壤中厚壁菌门的芽孢杆菌纲在整
个细菌群落中处于主导地位,所占的比例最大为
62郾 7% .然而 2 年土壤中处于主导地位的是变形菌
门 着鄄变形菌纲,所占的比例为 25郾 9% ,其次才是芽
孢杆菌纲,所占的比例较 1 年的下降了 40郾 5% ,此
外,2 年土壤中出现了 着鄄变形菌纲和浮霉菌纲,其中
着鄄变形菌纲主要以螺杆菌属为主,而帕美特螺杆菌
(Helicobacter pametensis)、幽门螺杆菌 (Helicobacter
pylori)等螺杆菌属都是病原菌,它们均会对植物的
生长和发育产生一些不利影响.
2 年土壤中除了 琢鄄变形菌纲和螺旋体纲外,茁鄄
变形菌纲、酌鄄变形菌纲、芽孢杆菌纲、梭菌纲、柔膜菌
纲和放线菌纲的数量分别减少了 22郾 2% 、50郾 0% 、
83郾 8% 、66郾 7% 、50郾 0%和 14郾 3% ,其中芽孢杆菌纲
下降的最多.可见,连作导致土壤细菌群落多样性下
降,其结构趋于简单,进而影响土壤生态系统功能.
3摇 讨摇 摇 论
T鄄RFLP技术是一种新兴的研究微生物多态性
的分子生物学技术,该技术已经成功应用于各种微
生物群落的分析比较、研究微生物群落多样性及结
构特征等多个方面[13,22] . 本文采用 T鄄RFLP 技术研
究地黄连作对根际土壤细菌群落的影响,结论可靠,
而且比 DGGE (denaturing gradient gel electrophore鄄
sis )、 PCR鄄SSCP ( polymerase chain reaction鄄single
strand conformation polymorphism)或 ARDRA (ampli鄄
fied ribosomal DNA restriction analysis)等方法具有更
强的分析能力,通过用限制性内切酶得到的土壤群
落各 DNA终端片段可以小到 1 bp,并且能被仪器检
测和数字化输出,大大减少了分析时的人为误
差[23-27] .同时,本试验采用双酶切方法,目的是找到
适合分析各个样品的最佳限制性内切酶,进一步提
高了试验的准确性.
本研究结果表明,随着地黄种植年限的增加,细
菌种类及数量不断减少,群落多样性水平呈下降趋
势,特别是芽孢杆菌纲和放线菌等种类下降,不利于
降解土壤中酚酸类、苯酚类等有毒化合物,使得群落
降解有毒物质的能力降低,对地黄生长产生抑制作
用;而螺杆菌属病原菌类增多,使地黄的生存环境恶
化,加重了病害对植物的侵袭,对植物生长发育不
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利.地黄连作障碍可能与地黄块根的根系分泌物有
关,类似于黄瓜[13]和大豆[28]的连作障碍.
由于涉及种植年限较短,而地黄根际土壤细菌
群落的变化可能会随种植年限延长而表现更加突
出,这就需要进一步进行多年定位监测;而根系分泌
物如何影响细菌的生长,以及细菌作用于受体植物
的具体方式如何等,也需进一步深入研究.
致谢摇 河南省焦作市温县农业科学研究所薛世跃所长、路翠
萍助理研究员在试验取样中给予大力帮助,谨表谢意!
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作者简介 摇 张重义,男,1963 年生,博士,教授. 主要从事药
用植物生理生态学和栽培学理论与技术研究, 发表论文 60
余篇. E鄄mail: hauzzy@ 163. com
责任编辑摇 肖摇 红
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