全 文 ：风沙土微生物总 DNA不同提取和纯化方法比较*
徐晓皎摇 曹成有**摇 崔振波摇 杨摇 敏
(东北大学理学院, 沈阳 110004)
摘摇 要摇 为筛选和建立风沙土中总 DNA的提取和纯化方法,选取了 5 种直接提取法、1 种间
接提取法和 2 种纯化法分别对风沙土中总 DNA 进行了提取和纯化,并对其质量和产量进行
了比较.结果表明:6 种方法均可从风沙土中提取到大小为 23 kb 左右的总 DNA,其中改进后
的高盐提取法(用 40%聚乙二醇 8000 和 4 mol·L-1 NaCl沉淀 DNA)效果最好,纯化后总 DNA
的纯度最高,可进行 16S rDNA的 PCR扩增,且产量仅稍低于试剂盒提取法;电泳加柱回收纯
化法的纯化效果较好,经该方法纯化后的总 DNA大部分可进行 PCR扩增,可满足后续分子操
作对 DNA纯度的要求.
关键词摇 风沙土摇 总 DNA摇 提取摇 纯化摇 PCR扩增
文章编号摇 1001-9332(2010)05-1327-07摇 中图分类号摇 S154. 4摇 文献标识码摇 A
Comparison of the methods for extracting and purifying microbial total DNA from an aeolian
sandy soil. XU Xiao鄄jiao, CAO Cheng鄄you, CUI Zhen鄄bo, YANG Min (College of Sciences, Northeast鄄
ern University, Shenyang 110004, China). 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2010,21(5): 1327-1333.
Abstract: In order to select and establish an appropriate method for extracting and purifying the mi鄄
crobial total DNA from an aeolian sandy soil, six extraction methods ( five direct methods and one
indirect method) and two purification methods were examined, with the quantity and quality of ex鄄
tracted and purified total DNA compared. All the six extraction methods could extract the total DNA
with a length of approximately 23 kb, among which, the improved SDS high salt extraction method
(using 40% PEG8000 and 4 mol·L-1 NaCl to precipitate DNA) was the best. This method could
have a yield slightly less than that obtained by using kits, and the extracted DNA had the highest
purity after purification, being available in 16S rDNA PCR amplification. Among the purification
methods, the effect of agarose gel electrophoresis plus minicolumn was satisfactory, with most of the
purified total DNA being able to be PCR鄄amplified and meet the requirements of the purity of DNA
in the follow鄄up molecular operations.
Key words: aeolian sandy soil; total DNA; extraction; purification; PCR amplification.
*国家自然科学基金项目(40871247)和中央高校基本科研业务费
(N090405010)资助.
**通讯作者. E鄄mail: caochengyou@ 163. com
2009鄄09鄄15 收稿,2010鄄03鄄10 接受.
摇 摇 风沙土是发育于风成沙性母质的幼年土壤,广
泛分布在我国北纬 36毅—49毅的干旱和半干旱地区,
具有碱性、低养分、低水分等特征,致使生存于其中
的微生物也具有特殊性,因此风沙土中微生物的群
落特征越来越受到学者们的关注[1-5] .目前,对土壤
微生物的研究多采用纯培养的方式进行. 但近年来
的分子生态学研究表明,自然栖息群中的微生物仅
0郾 01% ~1%可以培养,绝大部分微生物处于非可培
养状态[6-7] .因此许多科学家开始尝试利用分子生
物学方法直接对环境中微生物的种类、群落结构及
其功能进行研究,极大地扩展了微生物基因资源的
利用空间,丰富了人们对土壤中不可培养微生物的
认识[8] .在基因水平上研究土壤微生物的关键之一
便是从土壤样品中高效地获得可进行分子操作的基
因组 DNA.随着微生物生态学的发展,各种提取方
法陆续建立起来.目前从土壤样品中提取 DNA的方
法大体上分为两类[9]:一类是直接提取法,即直接
利用物理、化学或是生物的方法原位裂解微生物细
胞后再提取纯化 DNA;另一类是间接提取法,即通
过差速离心等物理方法,将微生物菌体与土壤颗粒
分开,再用较温和的方法从菌体中提取 DNA. 一般
前者的提取效率较高,但不易去除抑制剂,而后者的
纯度较高,片段较大,但提取量小. 由于土壤理化性
质复杂多样,到目前为止仍没有发现某种方法能适
合于所有的土壤类型,而从风沙土中提取和纯化
应 用 生 态 学 报摇 2010 年 5 月摇 第 21 卷摇 第 5 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, May 2010,21(5): 1327-1333
DNA的研究尚未见报道.由于风沙土中有机质和水
分含量低,微生物数量远远低于其他土壤,所以从风
沙土中提取 DNA的难度较大,技术要求较高.
本研究在阅读相关文献的基础上,根据风沙土
的特殊性质,选取了 6 种典型的 DNA 提取方法和 2
种纯化方法,并对其中一种提取方法进行了改进,以
期找出适合于风沙土中总 DNA的提取和纯化技术,
为今后在分子生物学水平上研究风沙土中微生物多
样性及其生态功能提供参考.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试土壤
供试土壤样品于 2008 年 5 月采集于科尔沁沙
地西部内蒙古翁牛特旗乌兰敖都地区一个典型的固
定沙丘(43毅02忆 N,119毅39忆 E). 采样点分别为沙丘
的迎风坡、背风坡和坡顶的 25 年生人工栽培小叶锦
鸡儿(Caragana microphylla)群落根际和灌间土壤.
伴生植物主要有绿珠藜(Chenopodium acuminatum)、
雾冰藜(Bassia dasyphyllum)、猪毛菜( Salsola colli鄄
na)、狗尾草 ( Setaria viridis)、虫实 ( Corispermum
thelegium)等.土壤样品按 5 点梅花取样法取 0 ~ 5
cm的土壤,然后按九分法充分混匀,过 4 mm 筛后
用无菌自封袋封装,当天运回实验室,保存于 4 益冰
箱.
1郾 2摇 土壤样品的预处理
参照赵勇等[10]的方法,稍加改动:称取 10 g 土
壤样品于 50 ml 无菌三角瓶中,加入 5 倍体积的
TENP缓冲液(50 mmol·L-1 Tris鄄base,20 mmol·L-1
EDTA,100 mmol·L-1 NaCl,0郾 01 g·ml-1 PVP,pH
10郾 0),涡旋 10 min,将上部液体转至 50 ml 无菌离
心管中,10000 r·min-1离心 5 min,收集沉淀,并通
过加入相同体积的 TENP缓冲液将离心管中的沉淀
全部转移至三角瓶中,重复该步骤 2 次(如果离心
后的上清液颜色较深,则重复以上步骤直至上清液
较为澄清). 然后向三角瓶中加入 5 倍体积的 PBS
缓冲液(8 g NaCl、0郾 2 g KCl、1郾 44 g Na2HPO4、0郾 24
g KH2PO4 溶于 1 L水,pH 7郾 4)涡旋混匀,用相同的
方法洗涤土壤样品 3 次. 再向三角瓶中加入 5 倍体
积的无菌超净水,涡旋混匀,用相同的方法洗涤土壤
样品 1 次,-20 益保存沉淀备用.
1郾 3摇 DNA直接提取法
1郾 3郾 1 玻璃珠打击高盐提取法(方法 1) 摇 参照张瑞
福等[11]的方法稍加改动. 具体步骤:将离心管里 10
g预处理后的土壤样品通过与 5 ml DNA 提取液
(100 mmol·L-1 Tris鄄base,100 mmol·L-1 EDTA,100
mmol·L-1磷酸钠,1郾 5 mol·L-1 NaCl,1% CTAB,
pH 8郾 0)混合转至 50 ml 三角瓶中(管中加有 40 颗
左右无菌玻璃珠),加入 100 滋l 蛋白酶 K(10 mg·
ml-1)和 2 ml溶菌酶(25 mg·ml-1),于 225 r·min-1
摇床上 37 益摇动 30 min,再加入 600 滋l 20% SDS
(十二烷基磺酸钠),轻轻混匀,65 益水浴 2 h,每隔
15 ~ 20 min 轻轻颠倒几下,室温 6000 r·min-1离心
10 min,收集上清并转移到无菌的 50 ml 离心管中;
然后向土壤沉淀中再加入 1郾 7 ml 提取液和 200 滋l
20% SDS,涡旋 20 s,停 10 s,重复 3 次,使沉淀重悬,
65 益水浴 10 min,室温 6000 r·min-1离心 10 min,
合并上清液.重复上述操作步骤 1 次.将上清与等体
积的酚 /氯仿 /异戊醇(25 颐 24 颐 1 体积比)混合,
15000 r·min-1室温离心 10 min,吸取水相,加入等
体积的氯仿 /异戊醇(24 颐 1 体积比)混合,15000 r·
min-1室温离心 10 min,吸取水相,并将其转移到 1郾 5
ml无菌的离心管中(每个离心管加入 0郾 8 ml),然后
加入 0郾 6 倍体积的异丙醇(-20 益预冷)和 0郾 1 倍体
积 5 mol·L-1醋酸钠,4 益沉淀过夜,室温 15000 r·
min-1离心 20 min,收集核酸沉淀,用冷的 70%乙醇
洗涤沉淀(轻摇洗盐) 2 次,12000 r·min-1离心 5
min弃乙醇,晾干,将提取出的 DNA重悬于 TE 缓冲
液,终体积为 150 滋l.
有研究指出,聚乙二醇(PEG)在沉淀 DNA时腐
殖酸类物质不容易与之共沉淀,所以能得到更纯净
的 DNA[12] .另有研究发现,先加入 0郾 3 倍体积的异
丙醇后离心除去沉淀,上清再用 0郾 3 倍体积的异丙
醇沉淀 DNA,可使样品的颜色变得很浅,而 DNA 含
量不发生变化[13] .由此对方法 1 进行以下改进:
1) 改进 1 摇 收集上清和吸取水相的步骤同方
法 1,然后向水相中加入 0郾 3 倍体积异丙醇,4 益沉
淀 1 h,15000 r·min-1离心 10 min,取水相,再向水
相中加入 0郾 3 倍体积的异丙醇和 0郾 1 倍体积 5 mol
·L-1醋酸钠,4 益沉淀过夜,室温 15000 r·min-1离
心 20 min,收集核酸沉淀,后续步骤同方法 1.
2) 改进 2 摇 收集上清和吸取水相的步骤同方
法 1,然后向水相中加入 0郾 5 倍体积的 PEG 8000 和
0郾 5 倍体积的 4 mol·L-1 NaCl溶液,4 益沉淀过夜,
室温 15000 r·min-1离心 20 min,收集核酸沉淀,后
续步骤同方法 1.
1郾 3郾 2 异硫氰酸胍提取法(方法 2) 摇 参照 Porteous
等[14]的方法稍加改动.具体步骤:将 10 g 预处理的
土壤样品通过与 2 ml EN(0郾 1 mol·L-1 NaCl,0郾 25
8231 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 21 卷
mol·L-1 EDTA)混合转移至 50 ml 三角瓶中(瓶中
装有 30 颗左右无菌玻璃珠以便振荡时驱散土壤颗
粒),200 r·min-1摇床振荡 20 min,然后加入 1 ml
20% SDS,68 益温育 30 min,每 10 min 轻轻摇动 1
次,再加入 0郾 5 ml 5 mol·L-1异硫氰酸胍(GITC),
68 益温育 1 h,每 10 min 轻轻摇动 1 次,10000 r·
min-1离心 10 min,将上清液移入 1郾 5 ml无菌的离心
管中(每个离心管加入 0郾 45 ml),然后加入 0郾 125
倍体积的 5 mol · L-1 醋酸钾和 0郾 42 倍 40%
PEG8000,-20 益沉淀 2 ~ 4 h,10000 r·min-1室温离
心 20 min,取沉淀,再加 1 ml 2 伊CTAB(2% CTAB,
1郾 4 mol·L-1 NaCl,0郾 1 mol·L-1 EDTA)溶解沉淀,
68 益温育 15 min.后续用等体积的酚 /氯仿 /异戊醇
(25 颐 24 颐 1 体积比)去除蛋白质等步骤同方法 1.
最后将提取出的 DNA 用适量 TER(含 RNase 20 滋g
·ml-1)溶解,37 益水浴 30 min,以除去 RNA,终体
积为 70 滋l.
1郾 3郾 3 液氮研磨提取法(方法 3) 摇 参照 Dojka 等[15]
的方法稍加改动. 具体步骤:称取 10 g 未处理的土
壤,放入研钵中,加适量的液氮研磨,重复 3 次,使土
壤颗粒研磨成粉末,将研磨好的土样转移至三角瓶
中,加入 4郾 5 ml DNA 提取液( 100 mmol·L-1 Tris鄄
base,100 mmol·L-1 EDTA,100 mmol·L-1 NaCl,1%
PVP,2% SDS,pH 8郾 0)和 0郾 5 ml 溶菌酶(25 mg·
ml-1),涡旋混匀,37 益水浴 2 h,每隔 15 ~ 20 min轻
轻颠倒几下,室温 10000 r·min-1离心 5 min,收集上
清并转移到 1郾 5 ml 离心管中(每个离心管加入 0郾 7
ml).后续用等体积的酚 /氯仿 /异戊醇(25 颐 24 颐 1
体积比)去除蛋白质等步骤基本同方法 1(除了在向
上层水相中加 0郾 6 倍体积的异丙醇和 0郾 1 倍体积 5
mol·L-1醋酸钠后改为-20 益放置过夜),最后将提
取出的 DNA重悬于 TE缓冲液,终体积为 200 滋l.
1郾 3郾 4 SDS 反复冻融提取法(方法 4) 摇 参照 Tsai
等[16]的方法稍加改动.具体步骤:将 10 g 预处理的
土壤样品通过与裂解液 I (0郾 15 mol·L-1 NaCl,0郾 l
mol·L-1 EDTA,pH 8郾 0) 3 ml和 5% CTAB 1 ml混
合转移至 50 ml三角瓶中(瓶中装有 30 颗左右无菌
玻璃珠,以便振荡时驱散土壤颗粒),200 r·min-1摇
床振荡 10 min. 然后加入 25 mg·ml-1溶菌酶 1郾 5
ml,37 益水浴 2 h,每 20 ~ 30 min 摇一下,然后加裂
解液 II(0郾 1 mol·L-1 NaCl,0郾 5 mol·L-1 Tris鄄base,
10% SDS,pH 8郾 0) 4郾 5 ml,-70 益冰浴 10 min,65
益 水浴 10 min循环 3 次,接着将三角瓶中的土壤悬
浊液转移至 50 ml 离心管中,5000 r·min-1离心 20
min,取上清并将其转移至无菌的 1郾 5 ml 离心管中
(每个离心管加入 0郾 8 ml),后续用等体积的酚 /氯
仿 /异戊醇(25 颐 24 颐 1 体积比)去除蛋白质等步骤
同方法 3,最后将提取出的 DNA重悬于 TE 缓冲液,
终体积为 50 滋l.
1郾 3郾 5 试剂盒法(方法 5)摇 Biotech(百泰克)公司的
土壤基因组 DNA 提取试剂盒采用独特的抽提和裂
解体系迅速裂解细胞(壁)和灭活细胞内核酸酶,不
需要借助玻璃珠破壁,有效保证了基因组 DNA的完
整性,经过特殊处理的纯化柱能有效去除杂质和腐
殖酸,极大地提高了 DNA 的纯度.本研究参照产品
的使用说明用试剂盒提取了土壤总 DNA.
1郾 4摇 DNA间接提取法———Blending法
参照 Gabor 等[17]的方法稍加改动. 具体步骤:
称取 100 g土壤样品加 100 ml预冷的 Blending 缓冲
液(100 mmol·L-1 Tris鄄base,100 mmol·L-1 EDTA,
0郾 1% SDS,1% CTAB,pH 8郾 0),用高速粉碎机匀质
3 次,每次匀质 4 min,停 1 min,再在摇床上间歇振
荡 40 min(每个循环振荡 2 min,停 2 min,共 10 个循
环),3200 r·min-1离心 10 min 收集上清液,重复此
操作 2 次.将 3 次上清混合,4 益 12000 r·min-1离
心 30 min,收集微生物细胞沉淀,然后分别用 150 ml
0郾 1%焦磷酸钠(4 益预冷)和 100 ml 洗涤缓冲液
(0郾 33 mol·L-1 Tris鄄base,1 mmol·L-1 EDTA,pH
8郾 0)洗涤,12000 r·min-1离心 10 min,取沉淀,该沉
淀即为分离出的菌体细胞.后续用 DNA提取液提取
DNA以及用等体积的酚 /氯仿 /异戊醇(25 颐 24 颐 1
体积比)去除蛋白质的步骤同方法 1,最后将提取出
的 DNA重悬于 TE缓冲液,终体积为 40 滋l.
1郾 5摇 DNA的纯化
1郾 5郾 1 参照文献[18]的纯化方法稍加改动摇 具体步
骤:吸取 DNA 粗提液 40 滋l,加入 20 滋l 4 mol·L-1
NaCl和 20 滋l 40% PEG 8000,然后放在冰中 20 ~ 30
min,4 益 12000 r·min-1离心 20 min,弃上清,用
70%乙醇清洗沉淀,12000 r·min-1离心 10 min,取
沉淀,重复该步骤 1 次.然后将沉淀在通风槽中干燥
10 min,让乙醇挥发干净,并用 40 滋l 的 TE 缓冲溶
液溶解[18] .
1郾 5郾 2 电泳加柱回收纯化方法摇 具体步骤:吸取 20
滋l的 DNA粗提液,加入 4 滋l的 6伊上样缓冲液充分
混匀,在 90 V电压下采用浓度为 0郾 7%的琼脂糖凝
胶(含 0郾 5 滋g·ml-1溴化乙锭)电泳 90 min.电泳结
束后将胶表面液体吸干,在长波紫外灯下,以最快的
速度用干净刀片将所需回收的 DNA条带切下,尽量
92315 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 徐晓皎等: 风沙土微生物总 DNA不同提取和纯化方法比较摇 摇 摇 摇 摇
切除不含目的条带的凝胶,得到凝胶体积越小越好.
然后利用 Biotech(百泰克)公司的琼脂糖凝胶 DNA
回收试剂盒(DP1601)中的纯化柱使 DNA片段在高
离序盐存在的情况下,选择性地吸附于离心柱内的
硅基质膜上,再通过一系列快速的漂洗离心的步骤
去除核酸和蛋白酶等杂质,最后用低盐、高 pH 值的
洗脱缓冲液将纯净的 DNA 从硅基质膜上洗脱回
收[19] .具体操作步骤参见产品使用说明.
1郾 6摇 DNA的纯度和质量检测
在 80 V 电压下采用 0郾 8%的琼脂糖凝胶(含
0郾 5 滋g·ml-1溴化乙锭)电泳 40 min,电泳缓冲液为
1伊TAE,然后在紫外分析仪中观察拍照,通过与标准
的 姿DNA鄄Hind 芋进行比较,检测 DNA 的大小和完
整性.另外,利用微量核酸检测仪(Nanophotometer)
测量纯化前后的 DNA 溶液在波长为 230、260、280
nm下的 OD值,以检测 DNA的产量和纯度.
1郾 7摇 16S rDNA的 PCR扩增
PCR扩增引物依据细菌 16S rDNA V3 区一个
长度约为 200 bp 的基因片段设计,引物序列[20]为
341GCf(5爷鄄CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGC鄄
GGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG鄄3 爷);
534r (5爷鄄ATTACCGCGGCTGCTGG-3爷). PCR 扩增
反应体系:2郾 5 滋l 10伊PCR 缓冲液,2郾 5 滋l dNTP(每
种各 2郾 5 mmol·L-1),1 滋l引物 341GCf(10 滋mol·
L-1),1 滋l 引物 534r(10 滋mol·L-1),1 ~ 2 滋l DNA
模板,0郾 8 滋l Taq DNA 聚合酶(5U·滋l-1),加无菌
三重蒸馏水到 25 滋l. PCR扩增的反应程序为:95 益
预变性 5 min后,按 94 益 30 s、48 益 60 s、72 益 60 s
的程序循环 30 次,最后 72 益延伸 10 min,4 益保
存.
PCR扩增产物在 85 V 电压下采用 1郾 2%的琼
脂糖凝胶(含 0郾 5 滋g·ml-1溴化乙锭)电泳 50 min,
电泳缓冲液为 1伊TAE,并用 DL2000 Marker 作为标
准分子量参照物,在紫外分析仪观察拍照.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 土壤总 DNA的大小和完整性
分别用 6 种方法提取风沙土中的总 DNA,其琼
脂糖凝胶电泳检测结果见图 1. 由图 1 可以看出,6
种方法均能从风沙土样品中提取出土壤总 DNA,且
图 1摇 不同方法提取总 DNA的电泳结果
Fig. 1摇 Electrophoresis results of total DNA extracted by different methods
Marker:姿DNA鄄Hind芋标准分子量参照物 姿DNA鄄Hind芋 molecular standard marker. 下同 The same below. 1,2: 用同一种方法提取的两份平行的
土壤样品 Two parallel soil samples extracted by the same method; A:方法 1 Method 1; B:方法 2 Method 2; C:方法 3 Method 3; D:方法 4 Method 4;
E:方法 5 Method 5; F:间接法 Indirect method.
0331 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 21 卷
表 1摇 不同方法提取总 DNA(粗提)的平均产量及 A260 / A280
和 A260 / A230
Tab. 1 摇 Average yields, A260 / A280 and A260 / A230 of the
crude total DNA extracted by different methods
产量 Yield
(滋g·g-1
DM soil)
A260 / A230 A260 / A280
方法 1Method 1 0郾 464 0郾 664 1郾 239
方法 2 Method 2 0郾 042 0郾 540 1郾 352
方法 3 Method 3 0郾 571 0郾 718 1郾 270
方法 4 Method 4 0郾 058 0郾 821 1郾 234
方法 5 Method 5 1郾 080 1郾 200 0郾 813
间接法 Indirect method 0郾 002 0郾 733 1郾 452
提取出的 DNA片段主条带清晰,大小均在 23 kb 左
右(方法 3 提取出的总 DNA 片段稍大于 23 kb),符
合后续分子操作对基因组完整性的基本要求. 而 6
种方法都存在不同程度的拖尾现象,说明在操作过
程中存在一定程度的 DNA降解和被剪切.
2郾 2摇 土壤总 DNA(粗提)纯度和产率的测定
通过测定土壤总 DNA 溶液(粗提)A260的数值
计算了土壤总 DNA(粗提)的产率(表 1).由表 1 可
以看出,方法 5 从每克干土中粗提得到的 DNA 最
多,大约是方法 1 和方法 3 的 2 倍,而方法 4 的粗提
效果一般,仅为方法 3 的 1 / 10. 间接法的土壤总
DNA(粗提)产率明显低于直接提取法,这可能是微
生物细胞与土壤颗粒粘附紧密、不易分开的缘故.
A260 / A280和 A260 / A230可以用来检测 DNA 样品
中蛋白质和腐殖酸杂质的污染程度. 一般 A260 / A230
的值越大,DNA 越纯;反之,腐殖酸污染越严重. 而
A260 / A280比值>1郾 7 时,表明 DNA 较纯,否则有蛋白
质污染.从表 1 可以看出,用 6 种方法粗提得到的
DNA溶液中均含有大量的腐殖酸和蛋白质,干扰甚
至阻止了 PCR扩增,所以 6 种方法均未得到目的条
带.但其中方法 5 粗提得到的 DNA溶液 A260 / A230值
最高,说明方法 5 中腐殖酸污染程度最轻,然后依次
是方法 4>间接法>方法 3>方法 1>方法 2.而间接法
的 A260 / A280值最高,蛋白质污染程度最轻,然后依次
是方法 2>方法 3>方法 1>方法 4>方法 5.综合这两
个比值的情况看来,间接法粗提得到的总 DNA 最
纯,与以往文献报道的结果一致.
2郾 3摇 高盐提取法的提取效果
用方法 1 的两种改进方法分别提取了风沙土中
总 DNA,其琼脂糖凝胶电泳检测结果见图 2,其纯度
(粗提)测定结果表 2.结果表明,改进方法 1 能在一
定程度上减少蛋白质含量,但对腐殖酸的去除效果
并不明显,而改进方法 2 能有效地去除蛋白质和腐
殖酸等杂质,提高总 DNA 的纯度.由于这两种改进
方法都采用和原方法相同体积的 TE 缓冲溶液溶解
总 DNA 沉淀,所以在琼脂糖凝胶电泳图上,条带的
亮度和总 DNA 含量成正比.由图 2 可以看出,两种
改进方法均不会造成 DNA的大量损失,且改进方法
2 能沉淀出更多的总 DNA.
综合表 2 和图 2 的结果看来,两种改进方法的
提取效果均比原方法的效果要好,尤其是改进方法
2.但将这两种改进方法粗提出的土壤总 DNA 进行
PCR扩增时,还是未能得到目的条带,所以还需对
其进行纯化才能满足后续分子操作对 DNA 纯度的
要求.
2郾 4摇 不同纯化方法的纯化效果评价
纯化方法 1 能够在一定程度上减少溶液中含有
的蛋白质和腐殖酸,提高总 DNA 的纯度,但纯化一
遍和纯化两遍的效果没有明显的差异(电泳图和数
据未列出).再由 PCR扩增检测结果可知,不论是纯
化一遍还是纯化两遍,总 DNA 中仍存在超过 PCR
扩增限制量的蛋白质和腐殖酸,所以两者均未得到
目的条带.
图 2摇 改进方法提取总 DNA的电泳结果
Fig. 2摇 Electrophoresis results of total DNA extracted by the im鄄
proved methods郾
1,2:用方法1提取的两份平行的土壤样品Two parallel soil samples extrac鄄
ted by the method 1;1#,2#:用方法1的两种改进方法提取的土壤样品Two
soil samples extracted respectively by the improved method 1 and 2.
表 2摇 改进方法提取总 DNA(粗提)的 A260 / A280和 A260 / A230
Tab. 2摇 A260 / A280 and A260 / A230 of crude total DNA extrac鄄
ted by the improved methods
提取方法
Extraction method
A260 DNA产量
Yield of
crude DNA
(滋g·g-1
DM soil)
A260 /
A280
A260 /
A230
方法改进 1
Improved method 0郾 062 0郾 237 1郾 265 0郾 596
方法改进 2
Improved method 0郾 072 0郾 275 1郾 440 0郾 774
13315 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 徐晓皎等: 风沙土微生物总 DNA不同提取和纯化方法比较摇 摇 摇 摇 摇
表 3摇 用纯化方法 2 纯化后总 DNA的产量和纯度
Tab. 3摇 Yield and purity of the final total DNA using the
purification method 2
编 号
Number
产量 Yield
(10-2 滋g·
g-1 DW soil)
A260 / A280 A260 / A230
1 3郾 78 1郾 222 0郾 221
1# 6郾 08 1郾 178 0郾 192
1#爷 6郾 31 1郾 774 0郾 733
3 4郾 89 1郾 333 0郾 296
3忆 1郾 53 1郾 429 0郾 204
3义 2郾 29 1郾 250 0郾 375
2 0郾 37 1郾 167 0郾 350
4 3郾 25 1郾 000 0郾 112
5 11郾 00 1郾 714 0郾 383
J 0郾 05 1郾 545 0郾 367
1, 2, 3, 4, 5, J: 分别用方法 1 ~方法 5 和间接法提取的两份平行
总 DNA的混合液 Mixed solution of two parallel samples of total DNA
extracted respectively by the method 1 ~ 5 and the indirect method; 1#,
1#爷 : 用方法改 1 和方法改进 2 分别提取的总 DNA Total DNA extrac鄄
ted respectively by the improved method 1 and 2; 3忆, 3义:用方法 3 提取
的总 DNA分别用纯化方法 1 纯化 1 次和 2 次 Total DNA (extracted
by the method 3) purified respectively by the method 1 once and twice.
摇 摇 采用电泳加柱回收纯化方法(纯化方法 2)对所
有 DNA粗提液进行纯化,其琼脂糖凝胶电泳检测结
果见图 3(为了便于和纯化后的总 DNA 量进行对
比,纯化前的溶液也是每个样品各吸取 10 滋l(共 20
滋l)用 TE溶液稀释到 30 滋l后再进行电泳检测),其
纯度测定结果见表 3.
图 3摇 用纯化方法 2 纯化前后总 DNA的电泳结果
Fig. 3 摇 Electrophoresis results of total DNA before and after
purification using the purification method 2.
A:纯化前 Before purification;B:纯化后 After purification郾 1, 2, 3, 4,
5, J: 分别用方法 1 ~方法 5 和间接法提取的两份平行总 DNA 的混
合液 Mixed solution of two parallel samples of total DNA extracted re鄄
spectively by the method 1 ~ 5 and the indirect method; 1#,1#爷 :用方法
改进 1 和方法改进 2 分别提取的总 DNA Total DNA extracted respec鄄
tively by the improved method 1 and 2; 3忆,3义:用方法 3 提取的总 DNA
分别用纯化方法 1 纯化 1 次和 2 次 Total DNA (extracted by the meth鄄
od 3) purified respectively by the method 1 once and twice. 下同 The
same below.
图 4摇 用纯化方法 2 纯化后总 DNA PCR扩增的电泳结果
Fig. 4摇 Electrophoresis result of PCR amplification of the final
total DNA purified by the method 2.
M:DL2000 标准分子量参照物 DL2000 molecular standard marker.
摇 摇 图 3 表明,经过电泳加柱回收纯化以后,总
DNA存在一定程度上的量的损失,并且存在较为明
显的拖尾现象.由表 3 可以看出,纯化后方法 5 的产
率最高,方法改进 2 的产率略小于方法 5,但方法改
进 2 纯化后总 DNA 的 A260 / A280为 1郾 774,A260 / A230
为 0郾 733,均为所有方法中的最高,方法 5 纯化后总
DNA的纯度次之.
以纯化后的总 DNA 为模板进行 PCR 扩增,除
了方法 1,其他方法均能成功扩增出了一段长为 200
bp的目的条带,其琼脂糖凝胶电泳检测结果见图 4,
说明电泳加柱回收纯化方法能够有效地去除蛋白
质、腐殖酸等影响 PCR 扩增的杂质,经它纯化后的
总 DNA已经满足了 PCR扩增对模板纯度的要求.
3摇 讨摇 摇 论
由于风沙土的土壤矿质部分几乎全部由细砂颗
粒组成,土壤保水保肥能力弱,致使其中含有的有机
质以及水分非常少,不利于微生物的生长繁殖,所以
从风沙土中获得高浓度、大片段、无偏好的土壤总
DNA较为困难.本研究在前期阅读大量文献的基础
上选取了 6 种具有代表性的方法,既包括直接提取
法又包括间接提取法,其中直接提取法中又包含了
3 种典型的物理破碎和一种化学破碎. 试验结果表
明,在普通提取法中,液氮研磨提取法和玻璃珠打击
高盐提取法的效果较好,这可能是由于风沙土中微
生物为了更好地适应低水分、低养分的生存环境,多
数为厚壁菌,例如芽孢杆菌、部分固氮菌和放线菌
等,所以只有用较为剧烈的物理破碎方法才能将其
细胞壁打破,释放其中的 DNA. 在沉淀 DNA 时,以
2331 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 21 卷
往使用的是 0郾 6 倍体积的异丙醇.而对比本研究中
方法改进 2 和原方法 1 的提取和纯化结果,发现
PEG 8000 的沉淀效果更好,而且由于 PEG 易溶于
乙醇,所以在用乙醇去除总 DNA中含有的盐类杂质
时 PEG 可被一并除去,无需添加其他的除杂步骤,
不会造成总 DNA产量的损失.另外,在前期 PCR 条
件探索过程中,本研究还尝试过其他常用的退火温
度,例如 58 益、55 益 [2]、52 益、50 益等,均未获得成
功,只有在 48 益时才扩增出了目的产物.这也说明
了风沙土中的微生物具有其特殊性.
本研究中还利用商品化的土壤基因组 DNA 提
取试剂盒进行提取效果的比较,结果表明试剂盒的
提取效果也很好,不仅产量大,纯度高,而且操作迅
速,但其提取成本非常高,是普通提取法的 50 ~ 100
倍,所以在经济条件允许的情况下也可选用.相比较
而言,改进的玻璃珠打击高盐提取法(用 40% PEG
8000 和 4 mol·L-1 NaCl 沉淀 DNA)得到的总 DNA
不仅纯度最高,而且其产量仅比试剂盒法稍小,所以
在需要大量提取风沙土中总 DNA时,该方法最佳.
参考文献
[1]摇 Jin Z鄄Z (靳正忠), Lei J鄄Q (雷加强), Xu X鄄W (徐
新文), et al. Relationships of soil microbial biomass
with soil environmental factors in Tarim Desert highway
shelter鄄forest. Chinese Journal of Applied Ecology (应用
生态学报), 2009, 20(1): 51-57 (in Chinese)
[2]摇 Jin Z鄄Z (靳正忠), Lei J鄄Q (雷加强), Xu X鄄W (徐
新文), et al. Microbial diversities of shelter鄄forest soils
in the extreme arid area. Acta Ecologica Sinica (生态学
报), 2009, 29(8): 4548-4559 (in Chinese)
[3]摇 Yang L鄄W (杨丽雯), Zhou H鄄Y (周海燕), Fan H鄄W
(樊恒文), et al. Advances of soil restoration research
on artificial sand鄄binding vegetation ecosystem in Shapo鄄
tou Desert region. Journal of Desert Research (中国沙
漠), 2009, 29(6): 1116-1123 (in Chinese)
[4]摇 Jin F鄄H (金发会), Li S鄄Q (李世清), Lu H鄄L (卢红
玲), et al. Variation of soil microbial biomass carbon,
soil microbial biomass nitrogen and nitrogen mineraliza鄄
tion potential in different soil types on the Loess Plat鄄
eau. Acta Ecologica Sinica (生态学报), 2008, 28
(1):227-236 (in Chinese)
[5]摇 Lin C鄄F (林超峰), Chen Z鄄Q (陈占全), Xue Q鄄H
(薛泉宏), et al. Nutrient contents and microbial popu鄄
lations of aeolian sandy soil in Sanjiangyuan region of
Qinghai Province. Chinese Journal of Applied Ecology
(应用生态学报), 2007, 18(1): 101-106 ( in Chi鄄
nese)
[6]摇 Johnston CG, Aust SD. Detection of Phanerochaete
chrysosporium in soil by PCR and restriction enzyme a鄄
nalysis. Applied and Environmental Microbiology, 1994,
60: 2350-2354
[7]摇 Amann RI, Ludwig W, Schleifer KH. Phylogenetic
identification and in situ detection of individual microbi鄄
al cells without cultivation. Microbiological Reviews,
1995, 59: 143-169
[8]摇 Ma W鄄L (马万里), Josquin T, Mark A. A new method
for research on soil microbial diversity. Acta Pedologica
Sinica (土壤学报), 2004, 41(1): 103-108 ( in Chi鄄
nese)
[9] Robe P, Nalin R, Capellano C, et al. Extraction of
DNA from soil. European Journal of Soil Biology, 2003,
39: 183-190
[10]摇 Zhao Y (赵摇 勇), Zhou Z鄄H (周志华), Li W (李摇
武), et al. DNA extraction from soil for molecular mi鄄
crobial community analysis. Journal of Agro鄄Environ鄄
ment Science (农业环境科学学报), 2005, 24(5):
854-860 (in Chinese)
[11]摇 Zhang R鄄F (张瑞福), Cao H (曹摇 慧), Cui Z鄄L (崔
中利), et al. Extraction and purification of soil micro鄄
bial total DNA. Acta Microbiologica Sinica (微生物学
报), 2003, 43(2): 276-282 (in Chinese)
[12]摇 Li J鄄M (李钧敏), Jin Z鄄X (金则新). A highly effec鄄
tive extraction method for PCR analysis of soil microbial
DNA. Chinese Journal of Applied Ecology (应用生态学
报), 2006, 17(11): 2107-2111 (in Chinese)
[13]摇 Fan S鄄D (范圣第), Quan C鄄S (权春善). Studies on
environmental DNA extraction and purification. Journal
of Dalian Nationalities University (大连民族学院学
报), 2005, 7(5): 1-4 (in Chinese)
[14] 摇 Porteous LA, Armstrong JL, Seidler RJ, et al. An ef鄄
fective method to extract DNA from environmental sam鄄
ple for polymerase chain reaction amplification and DNA
fingerprint analysis. Current Microbiology, 1994, 29:
301-307
[15]摇 Dojka MA, Harris JK, Pace NR. Expanding the known
diversity and environmental distribution of an uncultured
phylogenetic division of bacteria. Applied and Environ鄄
mental Microbiology, 2000, 66: 1617-1621
[16]摇 Tsai YL, Olson BH. Rapid method for direct extraction
of DNA from soil and sediments. Applied and Environ鄄
mental Microbiology, 1991, 57: 1070-1074
[17]摇 Gabor EM, Vries EJ, Janssen DB. Efficient recovery of
environmental DNA for expression cloning by indirect
extraction methods. FEMS Microbiology Ecology, 2003,
44: 153-163
[18]摇 Sambrook J, Russell DW, Huang P鄄T (黄培堂), et
al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Ed.
Beijing: Science Press, 2002: 128 (in Chinese)
[19]摇 Zhang Y鄄G (张于光), Li D鄄Q (李迪强), Wang H鄄M
(王慧敏), et al. Extraction method of soil microbial
DNA for molecular ecology study. Chinese Journal of Ap鄄
plied Ecology (应用生态学报), 2005, 16(5): 956-
960 (in Chinese)
[20] 摇 Baudoin E, Benizri E, Guckert A. Impact of artificial
root exudates on the bacterial community structure in
bulk soil and maize rhizosphere. Soil Biology and Bio鄄
chemistry, 2003, 35: 1183-1192
作者简介摇 徐晓皎,女,1987 年生,硕士研究生.主要从事土
壤微生物多样性研究. E鄄mail:didi5480317@ 126. com
责任编辑摇 肖摇 红
33315 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 徐晓皎等: 风沙土微生物总 DNA不同提取和纯化方法比较摇 摇 摇 摇 摇