全 文 ：文章编号:1671-1114(2009)03-0066-03
正交设计法筛选槐耳菌丝体液体培养基的研究
收稿日期:2008-10-28
基金项目:天津市科委自然科学基金项目(06ZHCXNC05900)
第一作者:杨子美(1984—),女,硕士研究生.
通讯作者:郭成金(1952—),男,副教授 ,主要从事植物营养生理与蕈菌生物学的研究.
杨子美 , 郭成金
(天津师范大学化学与生命科学学院 , 天津 300387)
摘　要:以槐耳菌丝体生物量为主要指标 ,采用不同碳源和氮源进行单因素初选试验 ,然后以不同比例的混合碳氮源
进行正交试验.结果表明 ,槐耳菌丝体液体最佳培养基是玉米渣 200 g/ L , 蔗糖 20 g/ L ,酵母膏 3 g/ L , 麦麸 3.5 g/ L ,
KH2PO4 2.0 g/ L ,MgSO4 ·7H2O 1.0 g/ L和 VB1 6 mg/ L ,温度 28 ℃, pH 自然.其菌丝体生物量得率为 21.6 g/ L.
关键词:槐耳;液体培养基;菌丝体;生物量;正交设计
中图分类号:Q93-335　　　　　　　文献标识码:A
Selection on liquid culture medium for mycelium of
Trametes robiniophila Nurr.by orthogonal design
Y ANG Zimei , GUO Chengj in
(College of Chemis t ry and Life S cien ce , Tianjin Normal University , Tianjin 300387 , China)
Abstract:Biomass of mycelium in liquid culture medium for Trametes robiniophila Murr.as major index , firstly different
carbon source and nitrogen source w ere adopted to early out the single facto r primary election in the experiment , carrying
out tests again fo r different proportional commix ture of carbon source and nitrog en source.The results show ed that the op-
timal medium w as leaching so lution of corn 200 g/ L , cane sugar 20 g/ L , yeast extract 3 g/ L , wheat bran 3.5 g/ L ,
KH2PO4 2.0 g/ L , MgSO4 ·7H2 O 1.0 g/ L , VB1 6 mg/ L with 28 ℃, natural pH.The production rate of biomass on
mycelium of Trametes robiniophila Murr.reached 21.6 g/ L in the liquid culture medium.
Key words:Trametes robiniophila M urr.;liquid culture medium;mycelium;biomass;o r thogonal design
　　槐耳学名槐栓菌 (Trametes robiniophi la
Murr.),隶属非褶菌目 、多孔菌科 、栓菌属[ 1] , 自然
分布于河北 、陕西 、辽宁 、湖南 、广西和福建等地 ,在
自然条件下生长于槐 、洋槐等阔叶树的树干上[ 2] .
近代误认为它是槐树上的黑木耳 ,以致对其认识产
生混乱.经详细考证 ,槐耳在 1500年前《肘后方》至
明《本草纲目》上均有记载.其味苦辛无毒 ,能“治
风” 、“破血” 、“益力” ,但湮没于 300余年前的清代 ,
现已确证槐耳为槐栓菌[ 3] .近几年研究发现 ,槐耳
所含的有效成分能抵抗和治疗多种疾病 ,在防治肝
类疾病方面有显著疗效 ,可抑制肿瘤生长 、诱生体内
多种细胞因子 、提高机体免疫力等[ 4] .
目前 ,可以生长槐耳的中国槐日益稀少 ,而且在
自然条件下槐耳对生长条件要求严格 ,生长周期长 ,
生物学效率低 ,难以分化成子实体 ,并且人工培育方
法生长周期长 ,达 2年以上 ,造成野生资源和人工栽
培的紧缺[ 5] .采用液体深层发酵菌丝体生产技术比
传统的食用菌生产方式有明显的优越性 ,在短时间
内能产生大量的菌丝体 , 可进行工业化生产菌种 ,
具有生产周期短 、菌龄整齐[ 6] 、接种便捷等优点 ,利
于机械化 、自动化操作 ,易于规模化 、工厂化生产[ 7] .
迄今为止 ,对槐耳生长条件的研究只有零星报道 ,并
只集中于生长因子方面.本研究试图采用正交试验
方法筛选出槐耳液体培养最佳培养基 ,以获得较高
生物量 ,旨在为槐耳液体菌种生产 、其细胞学和分子
生物学育种等方面的进一步开发利用提供物质基
础 、理论依据及技术支持.
Vol.29 No.3
Jul.2009第 29卷　第 3期2009 年 7 月 　　　　　　 天 津 师 范 大 学 学 报(自然科学版)Journal of T ianjin Norma l Unive rsity(Natural Science Edition)
1　材料与方法
1.1　菌株
供试菌种槐耳(Trametes robiniophi la Murr.)
由天津师范大学生物学系蕈菌研究开发室提供.
1.2　试验试剂
玉米渣(浸提液)、马铃薯(浸提液)、麦麸(市售)、
葡萄糖 、蛋白胨 、MgSO4 ·7H2O 、KH2PO 4 、VB1 、蔗
糖 、甘露醇 、麦芽糖 、酵 母粉 、NH 4NO3 、KNO3 、
NH 4Cl 、琼脂(青岛冻粉厂海燕牌),以上除注明外均
为AR级.
1.3　试验仪器
YXQG02手提式压力蒸汽消毒器 ,山东新华医
疗器械厂;SW-CJ-2超净工作台 , 上海锦屏仪器仪
表有限公司;BP31009 电子分析天平 ,德国;WDP
型微生物多用培养箱 , 广东省医疗器械厂;电热恒
温鼓风干燥箱 , 天津医疗器械厂.
1.4　培养基配方(W/V)
斜面培养采用 PDA培养基.
液体培养基:葡萄糖 2%, 蛋 白胨 0.3%,
KH2 PO 4 0.3%,MgSO 4 ·7H 2O 0.15%,VB1 微量 ,
pH 自然 .
碳源初选培养基:蛋白胨 0.3%, KH 2PO 4
0.3%,MgSO 4 · 7H2O 0.15%, VB1 微量 , pH 自
然.分别以葡萄糖 2%,蔗糖 2%,甘露醇 2%,麦芽
糖 2%,马铃薯 20%,玉米渣 20%为碳源.
氮源初选培养基:葡萄糖 2%, KH2 PO 4 0.3%,
MgSO 4 ·7H 2O 0.15%, VB1 微量 , pH 自然.分别
以蛋白胨 0.3%, 酵母膏 0.3%, 麦麸 0.3%,
NH 4NO 30.3%,KNO3 0.3%,NH4Cl 0.3%为氮源.
1.5　试验方法
1.5.1　菌种活化与提纯复壮
将保存的菌种提前 5 d活化.在无菌条件下 ,
制平板培养菌落 ,挑取强壮菌丝体前端 ,接于斜面培
养基上 ,于 28 ℃下培养 6 d即可使用.
1.5.2　菌丝体液体培养
从斜面上切取约 0.5 cm 的种块 ,接种于摇瓶液
面上 ,每瓶接种 4 ～ 5块 , 28 ℃静置 24 h ,然后置于
28 ℃,120 r/min 旋转式摇床上培养 6 d ,每个水平
3次重复.将抽滤后的菌丝体置于 60 ℃烘箱中烘
干 ,恒重后称重.
1.5.3　碳氮源培养基正交试验
依据初选中碳氮源等单因素试验的结果 ,选较好
的碳氮源各 2个 ,按 L9(34)设计 4因素 、3 水平试验
进行复选 , 与 KH2PO4 0.3%和 MgSO 4 · 7H2O
0.15%组成 9个配方 ,以碳氮源单因素培养基为对
照 ,正交因素与水平见表 1.
1.5.4　无机盐及维生素水平实验
根据混合碳氮源正交实验的结果 ,选出最佳碳氮
源组合作为基础培养基 ,再设置不同的浓度梯度向其
中添加 KH2PO 4 ,MgSO4 ·7H2O和 VB1(见表 2).
　表 1　正交 4 因素 3 水平试验 g/ L
水平 A B C D
1 200 25 3 3.5
2 150 20 2.5 3
3 100 15 2 2.5
　　A 为玉米渣;B为蔗糖;C为麦麸;D 为酵母膏 ,下同
　　　　表 2　无机盐及 VB1 因素与水平试验 g/ L
水平 ρKH2 PO4 ρMgSO4 ·7H2O ρVB1
1 1.5 0.5 0.004
2 2.0 1.0 0.006
3 2.5 1.5 0.008
4 3.0 2.0 0.010
2　结果与分析
2.1　槐耳对氮素营养的利用
氮源是蕈菌菌丝细胞内的酶类 、核酸 、蛋白质等
的重要组成部分 ,为细胞生长和生殖所必需[ 8] .槐
耳可利用的氮源比较广泛 ,其具体利用氮源的顺序
是酵母膏 >麦麸 >蛋白胨 > KNO 3 > NH4 Cl >
NH 4NO 3 .其中 ,有机氮明显好于无机氮 ,这可能是
因为当使用无机氮作为氮源时 ,菌丝必须利用无机氮
合成自身生长所需要的氨基酸 ,而有些氨基酸是不能
通过菌丝自身合成的[ 7] .方差分析(表 3-4)结果也
证实了槐耳菌丝细胞对于不同氮源的利用率存在明
显的差异 ,以酵母膏为氮源的培养基中菌丝体的生物
量最高 ,麦麸次之 ,NH4NO3 最低 ,因此选择酵母膏和
麦麸作进一步筛选.
　　表 3　不同氮源对槐耳菌丝体生物量的影响 g/ 100 mL
重复 NH4NO 3 NH 4Cl KNO3 C 蛋白胨 D
1 0.05 0.06 0.07 0.30 0.30 0.48
2 0.02 0.04 0.05 0.47 0.23 0.38
3 0.05 0.05 0.05 0.31 0.27 0.43
平均值 0.04 0.05 0.06 0.36 0.27 0.43
显著性 0.04c 0.05c 0.06c 0.36ab 0.30ab 0.43ab
　a为极显著 ,b为显著 , c为不显著 ,下同
表 4　不同氮源配方产量的方差分析
交差来源 平方和 自由度 均方 F
培养基间 0.474 5 0.095 30.004
误差 0.038 12 0.003
总和 0.512 17
2.2　槐耳对碳素营养的利用
碳源是液体培养基的基础成分 ,是菌丝生长分
化的物质和能量基础 ,它既能被菌丝利用合成细胞
结构成分 ,又是菌丝产生各种代谢产物及细胞内贮藏
的主要物质原料[ 9] .槐耳能广泛利用各种碳源 ,却有
·67·第 29卷　第 3 期 　 杨子美 , 等:正交设计法筛选槐耳菌丝体液体培养基的研究
明显的差异 ,利用碳源的能力依次为玉米渣>蔗糖>
麦芽糖>马铃薯>葡萄糖>甘露醇.由表 5-6结果
可明显看出 ,在不同碳源的培养基上 ,菌丝生长情况
有显著差异.为了获得碳氮源培养基的最佳配方 ,选
择玉米渣与蔗糖作为碳源 ,再进行碳氮源正交试验.
　　表 5　不同碳源对槐耳菌丝体生物量的影响 g/100 mL
重复 A 甘露醇 B 葡萄糖 麦芽糖 马铃薯
1 1.05 0.16 0.33 0.22 0.22 0.27
2 1.02 0.10 0.30 0.23 0.25 0.20
3 1.12 0.17 0.23 0.26 0.26 0.24
平均值 1.06 0.14 0.29 0.24 0.24 0.24
显著性 1.08a 0.14c 0.29b 0.23b 0.25b 0.24b
表 6　不同碳源配方产量的方差分析
交差来源 平方和 自由度 均方 F
培养基间 1.847 5 0.369 177.254
误差 0.025 12 0.002
总和 1.872 17
2.3　正交试验结果与分析
根据表 7对 4因素的极差(R)进行比较 ,可见 A
的极差最大 ,其次是B ,D和C ,其中A ,B显著大于C ,
D ,但 C ,D之间相差不大.极差越大 ,在该因素的水
平变动时菌丝体生物量的变化越大 ,也就是该因素对
生物量的变化影响越大[ 10] .因此 ,按极差大小顺序排
列 ,可知碳源是影响槐耳菌丝体生物量的主要因素 ,
实验中玉米渣是影响菌丝生物量的主要因素.表 7中
K 1 , K 2 , K 3 之间的差异是因素取 3个不同水平所引
起的 , K 值大的因素水平是较好的培养条件[ 11] .根
据水平之间 K 值大小比较得知 ,其最佳培养基组合
为 A 1B2C1D1 ,即玉米渣 200 g/ L ,蔗糖 20 g/ L ,麦麸
3 g/L ,酵母膏 3.5 g/L .
表 7　L9(34)正交直观分析表
配方 因素/(g· L -1)　A　　B　　　C　　　　D　　
菌丝生物量/
(g·(100 mL)-1)
实验 1 1(200) 1(25) 1(3) 1(3.5) 2.14
实验 2 1(200) 2(20) 2(2.5) 2(3) 1.95
实验 3 1(200) 3(15) 3(2) 3(2.5) 1.45
实验 4 2(150) 1(25) 2(2.5) 3(2.5) 1.33
实验 5 2(150) 2(20) 3(2) 1(3.5) 1.56
实验 6 2(150) 3(15) 1(3) 2(3) 1.22
实验 7 3(100) 1(25) 3(2) 2(3) 1.68
实验 8 3(100) 2(20) 1(3) 3(2.5) 1.75
实验 9 3(100) 3(15) 2(2.5) 1(3.5) 1.39
K 1 1.844 1.713 1.704 1.696
K 2 1.369 1.753 1.556 1.617
K 3 1.609 1.356 1.562 1.510
R 0.475 0.397 0.148 0.186
K 为均值 , R为极差
2.4　无机盐及 VB1使用量的筛选结果与分析
镁离子和磷酸盐与糖代谢有关 ,过多的镁离子
和磷酸盐使菌丝的新陈代谢过于旺盛而致其很快衰
老 ,从而影响菌丝的产量[ 11] ,但镁离子含量太少也
会影响碳源的氧化;另外 ,钾对糖酵解还有一定的促
进作用[ 12] .因此 , 为了完善培养基 , 本实验对
KH 2PO4 ,MgSO4 · 7H 2O 和 VB1进行了进一步的
筛选.实验结果见表 8 ,可知其最佳组合是处理 2 ,
即 KH 2PO4 2.0 g/ L , MgSO 4 ·7H2O 1.0 g/L 和
VB1 6 mg/ L.
　　　 　表 8　无机盐及 VB1 使用量对
　　　　　　　　槐耳菌丝体生物量的影响 g/100 mL
处理 菌丝体生物量 平均值 显著性
1 0.45 0.59 0.56 0.54 0.54b
2 0.74 0.67 0.75 0.72 0.72a
3 0.63 0.67 0.66 0.66 0.66ab
4 0.69 0.59 0.57 0.62 0.62ab
3　结论
本实验利用单因素试验和正交试验相结合的研
究方法 ,通过实验得出 ,槐耳菌丝体液体培养最佳培
养基为玉米渣200 g/L ,蔗糖 20 g/ L ,酵母膏 3 g/L ,
麦麸 3.5 g/ L , KH2 PO 4 2.0 g/L , MgSO 4 ·7H 2O
1.0 g/L和 VB1 6 mg/L ,温度为 28 ℃, pH 自然 ,其
生物量得率为 21.6 g/L .
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(责任编校　南凤仙)
·68· 天 津 师 范 大 学 学 报(自然科学版) 2009 年 7 月