全 文 ：植物遗传资源学报 2012，13(5) :870-878
Journal of Plant Genetic Resources
紫云英 ISSR引物的筛选及 PCR反应体系的优化
孙清信1，2，3，陈 坚1，张 辉1，祁建民2，林忠平3，胡鸢雷3，林新坚1
(1福建省农业科学院，福州 350003;2福建农林大学生命科学院，福州 350002;3北京大学生命科学院，北京 100871)
摘要:以紫云英为研究材料，用哥伦比亚大学(UBC)公布的 100 条 ISSR引物和 11 种株系紫云英品种的 DNA为模板进行
PCR扩增，筛选出 33 条扩增条带较好的 ISSR引物，对其中的 ISSR引物进行梯度 PCR，筛选出最佳的退火温度。再采用正交
试验和单因素试验相结合的方法对紫云英 ISSR-PCR反应体系的 5 种因素(模板、Mg2 +、TaqDNA 聚合酶、dNTP 及引物)进行
优化浓度。确立了适合紫云英的 ISSR 分析的反应体系。在 25μl 反应体系中，其反应浓度为:DNA 模版 50． 00ng，Mg2 +
2． 00mol /L，Taq聚合酶 1． 0 U，dNTP 0． 25mmol /L，引物 0． 20μmol /L，2． 5μl 10 × buffer。本试验为以后利用 ISSR 技术进行紫云
英遗传多样性分析和物种保护奠定了技术基础。
关键词:紫云英;退火温度;ISSR引物;正交试验;体系优化
Optimization of ISSRs Primer and PCR Reaction
System for Astragalus sinicus L．
SUN Qing-xin 1，2，3，CHEN Jian1，ZHANG Hui1，QI Jian-min2，LIN Zhong-ping3，HU Yuan-lei3，LIN Xin-jian1
(1Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou 350003，2College of Life Sciences，Fujian Agriculture and Forestry University，
Fuzhou 350002，3College of Life Sciences，Peking University，Beijing 100871)
Abstract:The factors that affecting the ISSR(inter-simple sequence repeat)result of Astragalus sinicus L． were
researched． We studied and selected 33 ISSR primers which can amplify bands from the DNA of Astragalus sinicus
L． and the 33 ISSR primers all from the ISSR primers published by Columbia University． By setting the temperature
gradient，the available primersbest annealing temperature were explored． The effect of the five main reaction ele-
ments(Mg2 +，TaqDNA polymerase，dNTP、template and primer)on ISSR-PCR were all optimized by combining sin-
gle factor experiments and orthogonal test mathed． Then we established the best ISSR-PCR reaction system． The best
ISSR-PCR reaction system of Astragalus sinicus L． is 25μl reaction system concention:the DNA template 50． 00ng，
Mg2 + concentration 2． 00mmol /L，Taq enzyme dosages 1． 0U，dNTP 0． 25mmol /L，primers 0． 20μmol /L，2． 5μl 10 ×
buffer． The selected ISSR primers and annealing temperature were widespread and representative in Astragalus sini-
cus L． ISSR-PCR marker research and the result could provide the basis for the analysis of diversity，protection，and
exploitation of SSR primers of Astragalus sinicus L． ．
Key words:Astragalus sinicus L．;Annealing temperature;Primers of ISSR;Orthogonal design;System optimi-
zation
收稿日期:2011-10-05 修回日期:2012-01-17
基金项目:国家公益性行业(农业)专项(201103005) ;福建省省长基金项目(Sbxd0903) ;福建省财政专项(STIF_Y01)
作者简介:孙清信，硕士。研究方向:生物化学与分子生物学。E-mail:344198949@ 163． com
通讯作者:林新坚 ，研究员，主要从事土壤培肥与微生物研究。E-mail:xinjianlin @ 163. net
紫云英(Astragalus sinicus L．)属于豆科黄芪属
越年生草本植物，又称翘摇、红花草、草子等。在长
江中下游和华南地区广泛种植，由于其有很强的固
碳和固氮能力，依靠紫云英与其共生的根瘤菌，在改
良土壤、提高土壤肥力、减少化肥使用量，以及对环
境保护起到一定的作用，也是很好的蜜源植物和饲
料。日本、越南、朝鲜半岛等国家和地区也有种植。
部分品种可以入药，对急性结膜炎、神经痛、带状疱
DOI:10.13430/j.cnki.jpgr.2012.05.025
5 期 孙清信等:紫云英 ISSR引物的筛选及 PCR反应体系的优化
疹、疮疖痈肿、痔疮有一定的疗效［1-6］。但是到目前
为止国内外学者主要是在其固氮机理方面做了大量
研究。陈坚等［7］开发了 SSR 分子标记用于紫云英
品种的指纹鉴别。但用 ISSR 分子标记技术对紫云
英品种的多态性和品种保护鉴定研究尚未见报
道 ［8-9］。
分子标记(molecular marker)是以生物大分子
的多态性为基础的一种遗传标记，广义的分子标记
是指可遗传的并可以检测的 DNA 序列和蛋白
质［10-12］。DNA 分子标记技术在分子生物学的发展
过程中诞生和发展，1974 年，Grozdiccker 等［13］在鉴
定温度敏感表型的腺病毒 DNA 突变体时利用经限
制性内切酶解后得到的 DNA片段的差异，开创了第
1 代 DNA分子标记限制性片段长度多态性标记(re-
striction fragment length polymorphism，RLFP)。1980
年，Bostein等［14］发现 RFLP标记技术是构建遗传图
谱的好方法。从此以后，RLFP 技术应用于品种的
鉴定和品系纯度的鉴定。1982 年，Hamada［15］发现
了第 2 代 DNA分子标记技术简单重复序列(simple
sequence repeat，SSR)。1994 年，加拿大蒙特利尔大
学建立了 ISSR(inter-simple sequence repeats)分子
标记技术，与 RFLP 和 RAPD 技术相比有更高的重
复性和稳定性［16］。另一方面，ISSR 分子标技术具
有操作简单、快捷、DNA 用量少、技术要求低、成本
低等特点，引物设计无需知道基因组序列，只要目标
区域的长度在可扩增范围内，就能扩增出微卫星重
复间的 DNA片段。因此，当前 ISSR 分子标记技术
广泛用于遗传多样性的分析、遗传作图、系统进化、
系统进化关系等领域。但是 ISSR 这种技术也存在
缺陷，稳定性易受到 Taq 酶、Mg2 +、引物、退火温度、
dNTP等条件的影响，扩增出来的条带随机性较大。
因此，在利用 ISSR 技术进行遗传性分析时，为保证
结果的清晰、可靠和准确，必须对反应体系进行优
化，另外 ISSR 具有不能区分纯合子和杂合子的弊
端［17-23］。因此，本研究进一步设计了一种从 ISSR
开发紫云英 SSR 引物进行分子标记的试验方法。
这种方法需要开发 SSR 正向引物和反向引物。正
向引物的开发是从 ISSR扩增片段中的特异性高，亮
度较强的条带回收测序来进行设计的，反向引物的
开发稍微复杂，它是在一定的测序基础上，设计正向
引物(引物 1)和正向巢式引物(引物 2)进行染色体
步移，回收目的条带测序分析完成的［24-27］。对于
开发紫云英 SSR 引物，用 ISSR 引物扩增出条带亮
度较强的特异性条带是重要的一步，因此，本试验对
紫云 ISSR引物进行筛选和 ISSR-PCR反应体系进行
优化。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
参试的紫云英品种有:余江大叶、841044、
8487771、闽紫 7 号、闽紫 6 号、宁波大桥、信阳种、弋
江籽、闽紫 1 号、闽紫 2 号、皖江大叶青共 11 个品
种，编号分别为 1 ～ 11。
Tans DNA Marker 2 由全式金公司提供;核酸染
料购自 TaKaRa;Taq DNA Polymerase Mg2 +和 dNTP
购于北京艾德莱生物科技有限公司;PCR 仪由 Bi-
ometra 公司生产;电泳仪 Bio-rad;凝胶成像系统
Tannon1600;Eppendorf 离心机;UNIC VN-2012 PC
型紫外可见光分光光度计。
本试验 100 条 ISSR 引物是参照加拿大哥伦比
亚大学(UBC)［19］所设计的引物序列，并交由上海
生工合成，引物序列如表 1。
表 1 加拿大哥伦比亚学(UBC)提供的 100 个引物序列
Table 1 Sequences of 100 primers by UBC，Canada
引物序列(5-3) Sequences of primers
801(AT)8 T 802(AT)8G 803(AT)8 C 804(TA)8A 805(TA)8 C
806(TA)8A 807(AG)8 T 808(AG)8 C 809(AC)8G 810(GA)8 T
811(GA)8 C 812(GA)8A 813(CT)8 T 814(CT)8A 815(CT)8G
816(CA)8 T 817(CA)8A 818(CA)8G 819(GT)8A 820(GT)8 C
821(GT)8 T 822(TC)8A 823(TC)8 C 824(TC)8G 825(AC)8 T
826(AC)8 C 827(AC)8G 828(TG)8A 829(TG)8 C 830(TG)8G
831(AT)8YA 832(AT)8YC 833(AT)8YG 834(AG)8YT 835(AG)8YC
836(AG)8YA 837(TA)8RT 838(TA)8RC 839(TA)8RG 840(GA)8YT
178
植 物 遗 传 资 源 学 报 13 卷
续表
引物序列(5-3) Sequences of primers
841(GA)8YC 842(GA)8YG 843(CT)8RA 844(CT)8RC 845(CT)8RG
846(CA)8RT 847(CA)8RC 848(CA)8RG 849(GT)8YA 850(GT)8YC
851(GT)8YG 852(TC)8RA 853(TC)8RT 854(TC)8RG 855(AC)8YT
856(AC)8YA 857(AC)8YG 858(TG)8RT 859(TG)8RC 860(TG)8RA
861(ACC)6 862(AGC)6 863(AGT)6 864(ATG)6 865(CCG)6
866(CTC)6 867(GGC)6 868(GAA)6 869(AGT)6 870(TGC)6
871(TAT)6 872(GATA)4 873(GACA)4 874(CCCT)4 875(CTAG)4
876(GACA)2(GACA)2 877(TGCA)4 878(GGAT)6 879(CTTCA)3 880(GGAGA)3
881(GGGTG)3 882VBV(AT)7 883BVB(TA)7 884HBH(AG)7 885HBH(GA)7
886VDV(CT)7 887DVD(TC)7 888BDB(CA)7 889DBD(AC)7 890VHV(GT)7
891HVH(TG)7 892AGATCTGATATCTGAATTCCC 893NNNNNNNNNNNNNNN
894TGGTAGCTCTTGATCA(N)5 895AGAGTTGGTAGCTCTTGATC 896AGGTCGCGGCCGCNNNNNNATG
897CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG 898GATCAAGCTTNNNNNNATGTGG 899CATGGTGTTGGTCATTGTTCCA
900ACTTCCCCACAGGTTAACACA
N =(A，G，C，T) ，Y =(C，G，T) ，D =(A，G，T) ，H =(A，C，T) ，V =(A，C，G) ，K =(G，T) ，M =(A，C)
1． 2 紫云英基因组 DNA的提取与检测
采用改良的 CTAB 法［28 － 29］和用博迈德生物技
术公司生产的广谱植物基因组 DNA 快速提取试剂
盒两种方法提取紫云英幼苗的 DNA。用 1%的琼脂
糖凝胶电泳初步检测其质量，通过紫外线分光光度
计测定 OD260、OD280，检测 DNA 的质量和浓度。把
提取的紫云英 DNA原液放置在 － 20℃的冰箱保存。
用于梯度 PCR 和 ISSR-PCR 反应的工作液稀释至
25ng /μl备用。
1． 3 紫云英 ISSR引物筛选与梯度 PCR反应程序
梯度 PCR 扩增的程序为 94℃预变性 5min，
94℃变性 1min，40 ～ 62℃ 退火 1min，72℃ 延伸
2min，72℃延伸 5min，10℃终止反应，30 个循环，
在退火梯度(40 ～ 62℃)有 12 个 PCR 槽;反应总
体积为 25μl(PCR 反应组成成份见表 2)。梯度
PCR产物在 1%的琼脂糖凝胶电泳分离，紫外光下
UV凝胶成像系统观察结果。筛选出最佳的退火
温度值。
1． 4 ISSR-PCR反应体系和条件
反应条件为:94℃ 预变性 5min;94℃ 变性
1min，50℃退火 1min，72℃延伸 1min，30 个循环;
72℃延伸 7min。
表 2 PCR反应组成成份
Table 2 Components of ISSR-PCR reaction
成分
Composition
终浓度
Final concentration
加入量
Addition
10 × PCR缓冲液
(含 Mg2 +)
1 × 2． 5μl
2． 5mmol /L dNTP 混
合液
0． 1mmol /L 1μl
引物 1(10 μmol /L) 0． 4μmol /L 1μl
引物 2(10 μmol /L) 0． 4μmol /L 1μl
模板 DNA 12． 5 ～ 100ng 适量
Taq DNA聚合酶 0． 5U 0． 2μl
ddH2O － 加至 25μl
1． 5 正交试验优化 PCR 反应体用 L16(4
5)正交
试验设计［30-31］
对影响紫云英 ISSR-PCR反应体系的 TaqDNA聚
合酶、引物、dNTP、Mg2 +、模板浓度进行优化筛选，选
出最佳的组合，本试验设计 16 个处理，每个处理 3 个
重复，用 quantity one 分析软件对实验结果按照特异
性条带强弱进行标记处理，特异最弱的记分为 1，其
他的与其相比取整数值。紫云英 ISSR-PCR各个反应
体系的成分组成及正交试验设计见表 3。
278
5 期 孙清信等:紫云英 ISSR引物的筛选及 PCR反应体系的优化
表 3 ISSR-PCR反应 5 因素 4 水平 L16(4
5)正交设计
Table 3 L16(4
5)orthogonal design for the factors and levels of ISSR-PCR reaction
序号 No． dNTP(mmol /L) 引物(μmol /L)Primer
DNA模板(ng /25μl)
DNA template
Mg2 +(mmol /L) Taq酶(U /25μl)
1 0． 10 0． 20 12． 50 1． 50 0． 5
2 0． 10 0． 30 25． 00 2． 50 1． 0
3 0． 10 0． 40 37． 50 3． 50 1． 5
4 0． 10 0． 50 50． 00 4． 50 2． 0
5 0． 15 0． 20 25． 00 3． 50 2． 0
6 0． 15 0． 30 12． 50 4． 50 1． 5
7 0． 15 0． 40 50． 00 1． 50 1． 0
8 0． 15 0． 50 37． 50 2． 50 0． 5
9 0． 20 0． 20 37． 50 4． 50 1． 0
10 0． 20 0． 30 50． 00 3． 50 0． 5
11 0． 20 0． 40 12． 50 2． 50 2． 0
12 0． 20 0． 50 25． 00 1． 50 1． 5
13 0． 25 0． 20 50． 00 2． 50 1． 5
14 0． 25 0． 30 37． 50 1． 50 2． 0
15 0． 25 0． 40 25． 00 4． 50 0． 5
16 0． 25 0． 50 12． 50 3． 50 1． 0
根据以上的正交试验选出最佳的反应体系，在
其他因子保持不变的情况下，参照以前的试验结果，
按照一定梯度适当变化单因子的浓度，逐个筛选单
个因子最佳的扩增条件，找出适合紫云英的 ISSR-
PCR反应体系。5 因子，每个因子设 4 个浓度梯度，
处理见表 4。
表 4 细调性 ISSR-PCR反应体系的因素与水平
Table 4 Optimization of factors and levels for ISSR-
PCR reaction
影响因素
Influencing factors
1 2 3 4
dNTP(mmol /L) 0． 15 0． 25 0． 35 0． 45
引物(μmol /L) 0． 20 0． 40 0． 60 0． 80
Mg2 +(mmol /L) 2． 00 3． 00 4． 00 5． 00
Taq酶(U /25μl) 0． 5 0． 7 0． 9 1． 1
模板(mmol /L) 25． 00 45． 00 65． 00 85． 00
2 结果与分析
2． 1 基因组提取与检测
检测了同一批提取的 DNA样品(图 1) ，结果表
明条带清晰，无降解和拖尾现象，说明提取的紫云英
DNA 样品纯度较高，杂质含量较少，用紫外分光光
度计检测并把样品 DNA 稀释到 25ng /μl 进行下游
的 ISSR-PCR试验。
2． 2 ISSR-PCR引物的筛选
用弋江籽基因组 DNA 为模板分别对加拿大
哥伦比亚大学(UBC)所设计的 100 条引物按照
上述的反应条件和体系进行 PCR 扩增，筛选出有
条带的引物如下:805(TA)8 C;807(AG)8 T;808
(AG)8 C;810(GA)8 T;811(GA)8 C;812(GA)8
A;813(CT)8 T;817(CA)8 A;818(CA)8 G;819
(GT)8A;821(GT)8 T;822(TC)8 A;825(AC)8 T;
826(AC)8 C;827 (AC)8 G;828 (TG)8 A;829
(TG)8 C;830(TG)8 G;831(AT)8 YA;834(AG)8
YT;835(AG)8YC;836(AG)8 YA;840(GA)8 YT;
842(GA)8YG;849(GT)8 YA;851(GT)8 YG;855
(AC)8 YT;856 (AC)8 YA;857 (AC)8 YG;862
(AGC)6;864 (ATG)6;869 (GTT)6;884HBH
(AG)7。试验表明上述筛选出的引物，在紫云英
的 PCR 扩增中有很好的效果。
图 1 紫云英 11 个品种的 DNA质量检测
Fig． 1 Quality detection of Astragalus sinicusl DNA template
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植 物 遗 传 资 源 学 报 13 卷
2． 3 引物退火温度的确定
ISSR-PCR反应中的退火温度与合成报告单上
的 Tm有关，但不一致。本研究对引物退火温度设了
12 个温度梯度，筛选引物用以 840(GA)8YT;以弋江
籽基因组 DNA 为模板，在 25μl 反应体系里进行
PCR扩增，然后用 1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测
(图 2)。从温度梯度来看低的退火温度产生的条带
较多，产生的非特异性条带较多，高的退火温度产生
的条带较少，非特异性条带明显减少。从图 2 中可
以清晰地看到随着退火温度的提高，1000bp 处的条
带有减弱的趋势，800bp处的条带逐渐增强，当退火
温度在 56℃时，对应的 9 泳道条带数目和亮度合
适，弱带较少，较为适合结果分析。
图 2 退火温度对 PCR扩增结果的影响［840(GA)8YT)］
Fig． 2 Optimizing the annealing temperature of primer［840(GA)8YT)］
M:Marker;1 ～ 12 对应的退火温度依次为 40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62℃
M:Marker，The annealing temperature is 40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62℃
2． 4 正交结果直观分析
参照何正文等［33］方法，选用弋江籽为模板，
［840(GA)8YT) ］为引物;按照正交试验表进行扩增
处理，L16(4
5)正交试验 PCR 产物电泳结果(图 3 ～
图 6) ，按照遗传多样性分析的要求，将 16 个处理，
根据特异性条带强弱，从高到低依次记分，分数越
高，表示敏感性及特异性较好。16 个处理 3 次重复
的分数分别记为:3，2，4，12，6，5，7，9，11，3，4，8，9，
3，16，12;2，2，3，13，4，3，8，7，12，3，5，9，11，5，14，
13;1，4，2，11，5，7，8，10，10，2，6，7，10，4，15，11。
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5 期 孙清信等:紫云英 ISSR引物的筛选及 PCR反应体系的优化
图 6 ISSR-PCR正交试验结果
Fig． 6 Result of ISSR-PCR orthogonal design
图(3 ～ 6)中 1 ～ 16 指正交试验的处理代号，参照表 3;M:Marker
Fig．(3-6) :Result of orthogonal design，1-16:deal with cod，refer to table 3;M:Marker
2． 5 正交结果方差分析
利用 SPSS19． 0 将上述记分结果进行方差分析
(表 6) ，由 F值可知，在本试验设置的因素水平范围
内，Mg2 +对反应的结果影响最大，模板影响最小，5
个因子影响大小的顺序依次是 Mg2 +，dNTP，引物，
Taq聚合酶，模板。由 F 值可知，5 个因素的观察效
能较高，各水平间的差异显著，可以进行下游试验，
进一步细调各因素内水平。
表 6 紫云英 ISSR-PCR各因素间的方差分析
Table 6 Analysis of Astragalus sinicus L． ISSR-PCR
变异来源
Source of variation
III型平方和
Type sum of
squares
df
均方
Mean square
F Sig
偏 Eta 方
Partial
Eta square
非中心参数
Non-centrality
parameter
观测到的幂b
Observed a
power of b
校正模型
Correction model
727． 813a 15 48． 521 40． 155 0 0． 950 602． 328 1． 000
截距 Intercept 2422． 521 1 2422． 521 2004． 845 0 0． 984 2004． 845 1． 000
模板 Template 32． 229 3 10． 743 0． 891 1． 563 0． 455 26． 672 0． 990
引物 Primer 265． 229 3 88． 410 43． 167 0． 041 0． 873 219． 500 1． 000
dNTP 181． 729 3 60． 576 50． 132 0． 034 0． 825 150． 397 1． 000
Taq酶 Taq enzyme 26． 896 3 8． 965 7． 420 0． 001 0． 410 22． 259 0． 973
镁离子 Mg2 + 221． 729 3 73． 910 61． 167 0． 000 0． 852 183． 500 1． 000
误差 Inaccuracy 38． 667 32 1． 208
总计 Total 3189． 000 48
校正的总计
Corrected total
766． 479 47
a:R2 = 0． 950(调整 R2 = 0． 926) ;b:使用 alpha 的计算结果(R = 0． 05)
a:R2 = 0． 950(Adjusted R2 = 0． 926) ;b:Calculations using alpha(R = 0． 05)
2． 6 单因素水平对 ISSR-PCR的影响
2． 6． 1 Taq酶浓度对 ISSR-PCR结果的影响 Taq
酶是 ISSR-PCR 反应中的一个重要的因素，从图 7
中可以清晰地看出随着 Taq酶浓度的提高条带的亮
度有低到高，Taq 酶 0． 5U 条带相对较暗，0． 7U 与
0． 9U差异不是很显著，1． 1U时条带开始弥散，亮度
降低。总之酶量过低 PCR反应敏感性较差，所能提
供的信息少，酶量过高非特异性条带会出现，结合上
述正交试验和经济角度用 1U /25μl 为适宜 TaqDNA
聚合酶浓度。
图 7 Taq酶浓度对 ISSR-PCR扩增效果的影响［引物 840(GA)8YT，模板弋江籽］
Fig． 7 Optimizing the concentration of Taq polymerase［primer 840(GA)8YT，template Yijiangzi］
1:0． 5 U /25μl，2:0． 7 U /25μl，3:0． 9 U /25μl，4:1． 1U /25μl
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植 物 遗 传 资 源 学 报 13 卷
2． 6． 2 引物对 ISSR-PCR 结果的影响 从图 8 中
可以看出引物 0． 20μlmol /L，0. 40μlmol /L，0. 60 μlmol /L
条带亮度和条带的多态性差异不大，但是到
0. 80μlmol /L条带亮度减弱，有可能是引物的加入
形成引物二聚体，影响了 PCR的扩增。综合以上的
正交试验选 0. 20μlmol /L浓度为引物浓度。
图 8 引物浓度对 ISSR-PCR扩增效果的影响［引物 840(GA)8YT，模板弋江籽］
Fig． 8 Optimizing the concentration of template［primer 840(GA)8YT，template Yijiangzi］
1:0． 20μlmol /L，2:0． 40μlmol /L，3:0． 60μlmol /L，4:0． 80μlmol /L
2． 6． 3 dNTP浓度对 ISSR-PCR 的影响 dNTP 是
ISSR-PCR反应中扩增合成新核苷酸的原料和提供
能量的来源，因此 dNTP浓度对 ISSR-PCR 反应结果
影响很大。浓度过低则产率下降，浓度过高错配的
概率加大，并与 Mg2 +竞争酶的活性中心。从图 9 中
可以看出 dNTP浓度为 0． 45mmol /L时，条带逐渐变
暗。结合正交试验的结果，dNTP浓度为 0． 25mmol /
L时较为合适。
图 9 dNTP浓度对 ISSR-PCR扩增效果的影响［引物 840(GA)8YT，模板弋江籽］
Fig． 9 Optimizing the concentration of dNTP［primer 840(GA)8YT，template Yijiangzi］
1:0． 15mmol /L，2:0． 25mmol /L，3:0． 35mmol /L，4:0． 45mmol /L
2． 6． 4 Mg2 +浓度对 ISSR-PCR 的影响 Mg2 +的
浓度不仅影响酶的活性，还能与反应中的 dNTP、引
物、模板结合，影响模板与引物的结合率，产生非特异
性［32］。从图 10可以看出，Mg2 +浓度为2． 00mmol /L时，
条带亮度较好，特异性较强。在 3. 00mmol /L，
4. 00mmol /L，5． 00mmol /L泳道中出现弥散现象，甚
至扩增产物消失。结合正交试验的结论确定 Mg2 +
浓度为 2． 00mmol /L 时能保证 Taq 酶的适当活力，
条带特异性较好。
图 10 Mg2 +浓度对 ISSR-PCR扩增效果的影响［引物 840(GA)8YT，模板弋江籽］
Fig． 10 Optimizing the concentration of Mg2 +［primer 840(GA)8YT，template Yijiangzi］
1:2． 00mmol /L，2:3． 00mmol /L，3:4． 00mmol /L，4:5． 00mmol /L
2． 6． 5 模板浓度对 ISSR-PCR 的影响 模板 DNA
量对 ISSR-PCR反应影响不大，从图 11 中可知模板
DNA浓度为 25. 00ng /25μl，45. 00ng /25μl，65. 00ng /
25μl，85． 00ng /25μl 时条带亮度和多态性差异不
大。因此，可以得出在紫云英 ISSR-PCR 反应体系
中模板对其影响不大，结合上述正交试验模板量
50. 00ng较为合适。
678
5 期 孙清信等:紫云英 ISSR引物的筛选及 PCR反应体系的优化
图 11 模板浓度对 ISSR-PCR扩增效果的影响［引物 840(GA)8YT，模板弋江籽］
Fig． 11 Optimizing the concentration of template［primer 840(GA)8YT，template Yijiangzi］
1:25． 00mmol /L，2:45． 00mmol /L，3:65． 00mmol /L，4:85． 00mmol /L
2． 6． 6 紫云英 ISSR-PCR 反应体系稳定性的验证
通过对以上 ISSR-PCR反应体系各因素的优化，确
定了紫云英 ISSR-PCR 25μl 的反应体系:模板 DNA
50ng，Mg2 + 2． 00mmol /L，Taq 聚合酶 1． 0U，dNTP
0． 25mmol /L，引物 0． 20μmol /L，加 ddH2 O 至 25μl。
扩增程序:94℃预变性 5min;94℃变性 1min，56℃退
火 1min，72℃延伸 1min，进行 30 个循环，72℃延伸
7min。扩增后 PCR产物在 4℃保存。图 12 是同一引
物［primer U840(GA)8 YT］对不同材料在该条件体系
下的扩增结果。从电泳图谱可以看出，11 个样品的
紫云英模板都能扩增出清晰，重复性好的图谱，表明
优化的紫云英 ISSR-PCR体系是稳定、可靠的。
图 12 引物 840(GA)8YT的扩增电泳图谱
Fig． 12 The ISSR amplified diagram by using primer 840(GA)8YT
1 ～ 11:8410441;余江大叶;8487771;闽紫 7 号;宁波大桥;信阳种;弋江籽;
闽紫 6 号;闽紫 1 号;闽紫 2 号;皖江大叶青
1-11:8410441，Yujiangdaye，8487771，Minzi No． 7，Ningbodaqiao，Xinyangzhong，
Yijiangzi，Minzi No. 6;Minzi No. 1;Minzi No． 2，Wanjiangdayeqing
3 讨论
紫云英 ISSR分子标记受多种因素的影响，虽然
ISSR较 RAPD标记稳定，但是试验的可靠性和稳定
性与 PCR反应条件有很大关系［34］。不同样本的最
佳 ISSR反应体系的条件是不同的，同时由于每个人
的设计的因素水平和方法的不同，使各水平因素影
响也有差异。因此，优化 ISSR-PCR 的反应条件是
下游试验成败的关键。正交试验能快速得到 ISSR-
PCR反应的最佳条件的组合，但是对试验优劣的判
断有很大的主观性，对试验可能造成误差，单因子试
验可较为直观地看出单因子对试验的影响，但忽视
了各因子间的互作效应，很难找到合适的反应体系。
因此，本试验结合正交和单因子两种试验的优缺点
和试验中实际筛选出的最佳反应体系，最终试验结
果表明，这两种试验方法相结合有效地减少了试验
误差，保证了试验的稳定性和可靠性。
本研究筛选了加拿大哥伦比亚大学(UBC)公
布的 100 条引物，从中筛出了 33 条能扩增出较亮条
带的引物。以引物 840(GA)8YT 为例，用梯度 PCR
对引物退火温度设计了 12 个温度梯度进行筛选;以
弋江籽为模板，引物 840(GA)8YT在 25μl反应体系
中进行 PCR扩增，筛选出其最佳退火温度为 56℃，
随后对其他能扩增出条带的引物进行了退火温度的
筛选，得出以下结论。一般它们的退火温度要比
Tm值高 2 ～ 5℃。利用正交试验 L16(4
5)和单因子
试验相结合的方法，对影响 ISSR-PCR 反应的主要
因素进行优化。紫云英 ISSR-PCR 扩增引物 840
(GA)8YT优化后理想的反应体系为:25μl 反应体
系中，模板 DNA 50． 00ng、Mg2 + 2． 00mmol /L、Taq
聚合酶 1． 0U、dNTP 0． 25mmol /L、引物 0． 20μmol /
L、2． 5μl 10 × buffer。试验表明优化后的反应体系
778
植 物 遗 传 资 源 学 报 13 卷
适用于不同品种的紫云英 ISSR-PCR 扩增，本试验
为开发 SSR引物和遗传分析提供了技术条件和理
论基础。
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