全 文 ：收稿日期:2013 － 01 － 16
作者单位:镇江市第一人民医院药剂科，江苏 镇江 212004
响应面法优化凤尾草总黄酮提取工艺
朱红红，盛玉青
［摘 要］ 目的 优化凤尾草总黄酮的最佳超声提取工艺。方法 以总黄酮得率为指标，采用响应面设计
方法对乙醇浓度、超声时间及料液比进行优化。结果 各因素对总黄酮提取率的影响大小依次为:液料比 ＞乙醇
浓度 ＞超声时间。最佳工艺条件为: 采用 65%乙醇，液料比 35∶ 1，超声时间 34 min，在此最佳提取条件下，凤尾草
总黄酮提取率为 9. 55%，试验结果与模型预测值相符。结论 超声提取方法简单，提取效率高、时间短、无需加
热，是一种较理想的提取凤尾草总黄酮的方法。
［关键词］ 凤尾草;总黄酮;超声提取;响应面设计
Optimization of ultrasound-assisted extraction of total flavonoids from Pteris mul-
tifida by response surface methodology ZHU Hong-hong，SHENG Yu-qing(The Pharmacy Depart-
ment，Zhenjiang First Peoples Hospital，Zhenjiang 212004，China)
［Abstract］ Objective To optimize the ultrasound-assisted extraction of total flavonoids from Pteris multifida．
Methods With the extraction rate of total flavonoids as response value，the ethanol concentration，extraction time and
liquid-material ratio were optimized by response surface methodology(ＲSM)． Ｒesults The effect of factors on the ex-
traction was in the order as follows:liquid-material ratio ＞ ethanol concentration ＞ extraction time． The optimal extrac-
tion conditions:ethanol concentration of 65%，liquid-material ratio of 35∶ 1，extraction time of 34 min． Under these con-
ditions the maximal yield of total flavonoids reached 9. 55%，which was agreed with model predictions． Conclusion
The ultrasound-assisted method can be used for extracting total flavonoids from Pteris multifida．
Key words:Pteris multifida;Total flavonoids;Ultrasonic-assisted extraction;Ｒesponse surface methodology
凤尾草为凤尾蕨科植物凤尾草(Pteris multifi-
da Poir．)的全草或根，具有清热解毒、凉血止血、
消肿解毒等功效，民间用于治疗肝炎、菌痢、淋浊、
便血、扁桃体炎、痈肿疮毒、湿疹等［1］。现代药理
研究表明，凤尾草含黄酮类、萜类化合物、甾醇类、
挥发油、苯丙素类等成分，具有广谱抗菌、抗肿瘤、
抗病毒、抗氧自由基作用［2-3］。
响应面优化法，即响应曲面法(Ｒesponse sur-
face methodology，ＲSM) ，是一种试验条件寻优的
方法，适宜于解决非线性数据处理的相关问题。
响应面法的基本思想是通过近似构造一个具有明
确表达形式的多项式来表达隐式功能函数。本质
上来说，响应面法是一套统计方法，用这种方法来
寻找考虑了输入变量值的变异或不确定性之后的
最佳响应值。本文利用响应面法，对超声提取凤
尾草总黄酮的条件进行优化。
1 试验仪器和试剂
1. 1 仪器 KQ-250B 型超声波清洗器(昆山市超
声仪器有限公司) ，UV-2401 型紫外可见分光光度
计(日本岛津公司) ，BP221S 型电子天平(德国赛
多利斯公司)。
1. 2 试药 凤尾草(江苏九泰医药集团) ，95%分
析纯乙醇(上海试剂总厂工贸公司) ，芦丁对照品
(南京泽朗植提有限公司)。
2 试验方法和结果
2. 1 溶液的配制 对照溶液:精确称取芦丁对照
品 25 mg，以 70% 乙醇定容至 50 mL。得到
0. 5 mg /mL的芦丁对照溶液;AlCl3 溶液:称取
1. 809 g AlCl3 用 70%乙醇定容至 100 mL。
2. 2 标准曲线的制作 分别精确吸取对照溶液
0. 0、0. 8、1. 6、2. 4、3. 2、4. 0 mL 于 50 mL 量瓶，各
加入 AlCl3 溶液 4. 0 mL，水 15 mL，用 70%乙醇定
容。30 ℃水浴 10 min，放置 20 min 后在 408 nm
处测吸光度。以芦丁浓度为横坐标、吸光度为纵
坐标绘制标准曲线，得回归方程:A = 26. 25C +
0. 009 7，r = 0. 999 7，其中 A 为吸光度，C 为提取液
中黄酮类物质的浓度(mg /mL) ，在 8 ～ 40 μg /mL
之间线性良好。
2. 3 凤尾草总黄酮提取液含量测定方法 将提
取液定容至 100 mL，吸取 1 ～ 50 mL 容量瓶，按
“2. 2”项下操作，测定黄酮含量。按下式计算提取
率:Y =(100 mL × 10 －3 × C /1 g)× 100%，其中 C
是提取液总黄酮含量(mg /mL)。
2. 4 单因素试验 采用单因素试验考察乙醇浓
度、液料比、超声时间对凤尾草总黄酮提取效果的
影响。
2. 4. 1 超声时间对提取液总黄酮含量的影响
精密称取 1 g 凤尾草粉末(过 40 目筛)5 份，分别
加 70%乙醇 30 mL，浸泡 12 h，分别超声 10、20、
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DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.2013.09.002
30、40、50 min，过滤，测定总黄酮含量，结果分别为
0. 78、0. 83、0. 91、0. 88、0. 86 mg /mL。当超声提取
时间为 30 min 时，总黄酮含量达到最大值。随着
时间的增加，总黄酮含量略有下降，可能有部分的
分解。
2. 4. 2 液料比对提取液总黄酮含量的影响 精
密称取 1 g 凤尾草粉末(过 40 目筛)5 份，分别加
入 10、20、30、40、50 mL 70%乙醇，浸泡 12 h，超声
30 min，过滤，测总黄酮含量，结果分别为 0. 62、
0. 83、0. 92、0. 92、0. 91 mg /mL。结果显示，液料比
为 30∶ 1 时，总黄酮含量最高，液料比再增加，总黄
酮含量没有明显提高。
2. 4. 3 乙醇浓度对提取液总黄酮含量的影响
精密称取 1 g 凤尾草粉末(过 40 目筛)5 份，分别
加入 45%、60%、70%、80%、90%的乙醇 30 mL，
浸泡 12 h，超声 30 min，过滤，测总黄酮含量，结果
分别为:0. 58、0. 79、0. 91、0. 80、0. 66 mg /mL，结果
显示，70%的乙醇浓度提取的总黄酮含量最高，而
乙醇浓度再升高，则总黄酮含量下降，可能是由于
乙醇体积分数过高时，沸点下降，导致挥发过大，
同时一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出
量增加，与黄酮类化合物竞争，从而导致黄酮类化
合物得率下降［4］。
2. 5 响应面设计 根据中心组合设计原理，依据
Design Expert(8. 0. 4)软件，结合响应面分析方法，
综合单因素预试验结果，以超声时间、液料比、乙
醇浓度 3 个因素为自变量，总黄酮含量为响应值，
设计 3 因素 3 水平共 17 个试验点的响应面分析试
验，各因素及编码水平见表 1，试验方案与结果见
表 2，其中 14 个为析因试验，3 个为中心试验。
表 1 响应面因素水平编码表
因素 代码
编码水平
－ 1 0 1
超声时间(min) A 20 30 40
液料比(mL /g) B 20∶ 1 30∶ 1 40∶ 1
乙醇浓度(%) C 60 70 80
该模型通过最小二乘法拟合的二次多项方
程:Y = b0 + b1A + b2B + b3C + b12 AB + b13 AC + b23
BC + b11A2 + b22 B2 + b33 C2。式中，Y-预测响应值，
即凤尾草总黄酮含量的预测值;bi-线性系数;bij-二
次项系数。
由表 3 可知，模型 P ＜ 0. 01，表明模型具有极
显著差异性，失拟项 P ＞ 0. 05，差异性不显著，说明
该模型拟合程度良好［5］，可以用此模型对凤尾草
黄酮超声提取效果进行分析和预测。
表 2 响应曲面设计及结果
试验号
编码水平
A B C
总黄酮含量
(mg /mL)
1 － 1 － 1 0 0. 796 0
2 1 0 1 0. 826 9
3 0 1 － 1 0. 929 5
4 0 1 1 0. 846 3
5 0 0 0 0. 950 8
6 0 0 0 0. 937 2
7 1 0 － 1 0. 898 5
8 0 － 1 － 1 0. 759 2
9 － 1 0 － 1 0. 877 2
10 0 － 1 1 0. 815 3
11 － 1 1 0 0. 815 3
12 1 － 1 0 0. 796 0
13 0 0 0 0. 923 7
14 － 1 0 1 0. 902 4
15 0 0 0 0. 954 6
16 1 1 0 0. 900 5
17 0 0 0 0. 943 0
2. 6 响应曲面分析 根据回归方程，做响应面和
等高线，考察拟合响应面的形状，分析超声时间、
液料比、乙醇浓度对凤尾草总黄酮提取率的影响，
见图 1 ～图 3。
等高线的形状可反映交互效应的强弱，椭圆
形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。
从图 1 ～图 3 中可以看出，各因素间的交互作用显
著。从等高线图可以看出极值条件应在圆心处，
三因素对凤尾草总黄酮的提取率都有显著影响，
液料比的影响最为显著，表现为等高线更为陡峭;
乙醇浓度、超声时间次之，表现为等高线曲线较平
滑。各因素经回归拟合后，解得回归方程:Y =0. 94 +
(3. 875E-003)A + 0. 041B-(9. 187E-003)C +
0. 021AB-0. 024AC-0. 035BC-0. 038A2-0. 077B2-
0. 027C2。
2. 7 提取工艺条件的确定 为验证凤尾草总黄
酮超声提取模型方程的适用性，对回归方程求导，
令其等于零，可以得到曲面的最大点，即三个主要
因素的最佳水平值，转换后得到提取的最佳条件:
超声时间为 33. 77 min，液料比为 34. 58∶ 1，乙醇浓
度为 63. 77%，预测凤尾草总黄酮含量为 0. 954 8
mg /mL。调整试验方案，超声提取时间设为 34
min，液料比设为 35∶ 1，乙醇浓度设为 65%，重复试
验 3 次，计算凤尾草总黄酮含量，求其平均值为
0. 954 6 mg /mL，实际与预测的黄酮得率较为接
近，验证了所建模型的正确性，说明响应面分析方
法适用于凤尾草总黄酮的超声提取工艺的优化。
3 结论与讨论
3. 1 响应面优化法，将实验得出的数据结果进行
·138·实用药物与临床 2013 年第 16 卷第 9 期 Practical Pharmacy And Clinical Ｒemedies，2013，Vol． 16，No． 9
表 3 回归模型的方差分析
方差来源 平方和 自由度 均方和 F值 显著性水平 P
A 1. 201E-004 1 1. 201E-004 0. 22 0. 653 3
B 0. 013 1 0. 013 24. 20 0. 001 7
C 6. 753E-004 1 6. 753E-004 1. 24 0. 302 8
AB 1. 815E-003 1 1. 815E-003 3. 32 0. 111 0
AC 2. 343E-003 1 2. 343E-003 4. 29 0. 077 0
BC 4. 851E-003 1 4. 851E-003 8. 89 0. 020 5
A2 6. 118E-003 1 6. 118E-003 11. 21 0. 012 3
B2 0. 025 1 0. 025 45. 48 0. 000 3
C2 3. 182E-003 1 3. 182E-003 5. 83 0. 046 5
残差 3. 821E-003 7 5. 459E-004
失拟项 3. 226E-003 3 1. 075E-003 7. 23 0. 430
误差 5. 950E-004 4 1. 488E-004
总离差 0. 064 16
模型 0. 060 9 6. 690E-003 12. 25 0. 001 6
图 1 液料比与超声时间的等高线和响应面图
图 2 乙醇浓度与液料比的等高线和响应面图
图 3 乙醇浓度与超声时间的等高线和响应面图
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响应面分析，得到的预测模型一般是个曲面，即所
获得的预测模型是连续的。与正交实验相比，其
优势是:在实验条件寻优过程中，可以连续对实验
的各个水平进行分析，而正交实验只能对一个个
孤立的实验点进行分析。响应面优化法也有其局
限性，要求设计的试验点应包括最佳的试验条件，
如果试验点的选取不当，使用响应面优化法不能
得到很好的优化结果。因此，在使用响应面优化
法之前，应当确立合理的试验因素与水平。
3. 2 超声提取方法简单，具有提取效率高、时间
短、无需加热等优点，是一种较理想的提取凤尾草
总黄酮的方法。本试验将单因素试验和响应面分
析法结合能优化超声提取工艺条件，为获得最佳
的提取工艺条件提供了一种快速、简便的方法，具
有较好的应用前景。
3. 3 本试验取少量凤尾草药材进行提取，结果比
较直观和准确，放大提取过程中，最优提取条件下
总黄酮提取率高，但杂质含量也可能会增加，可能
会对进一步的分离纯化带来困难。
3. 4 在单因素试验的基础上，应用响应面法优化
凤尾草总黄酮的超声提取工艺条件，结果显示，最
佳提取工艺为 65%乙醇，液料比 35∶ 1，超声提取时
间 34 min，在此条件下，凤尾草总黄酮提取率为
9. 55%。
参考文献:
［1］ 江苏新医学院． 中药大辞典上册［M］． 上海:上海科学技术
出版社，1993:487．
［2］ 余有贵，赵良忠，段林东，等．凤尾草抗菌药物的提取与开发
研究［J］．邵阳高等专科学校学报，2001，14(3) :199-203．
［3］ Wang TC，Ti MC，Lo SC，et al． Free radical-scavenging activity
of aqueous extract of Pteris multifida Poiret［J］． Fitoterapia，
2007，78(3) :248-249．
［4］ 阮征，胡筱波，赖富饶．油菜花粉中黄酮类物质提取工艺的优
化研究［J］．食品科学，2007，28(7) :133-137．
［5］ 甘露菁，邓泽元．响应曲面法优化醇提荷叶复方物超临界萃
取残渣中黄酮的工艺［J］．食品科学，2010，31(18) :26-30．
收稿日期:2013 － 03 － 15
作者单位:1. 辽宁中医药大学大连校区药学院，大连 116600;2. 抚
顺市食品药品检验所，辽宁抚顺 113000
* 通信作者
高效液相色谱法测定硝酸咪康唑栓的含量
王一淞1，杨松涛2，吕 佳1* ，赵 琳1
［摘 要］ 目的 建立 HPLC 法测定硝酸咪康唑栓中硝酸咪康唑含量。方法 采用 Diamonsil C18色谱柱
( 200 mm ×4. 6 mm，5 μm) ;以甲醇-乙腈-1. 5%醋酸铵溶液( 40∶ 40∶ 20) 为流动相;流速为 1. 0 mL /min; 检测波长为
230 nm。结果 硝酸咪康唑进样量在 0. 502 5 ～ 8. 04 μg 范围内呈良好的线形关系，r = 0. 999 9。回收率为
99. 46%，ＲSD为 0. 72%。结论 本法准确可靠、灵敏度高、重现性好，可用于硝酸咪康唑含量的测定。
［关键词］ 硝酸咪康唑栓;含量测定;高效液相色谱法
Quantitative determination of miconazole nitrate in miconazole nitrate suppository
by HPLC WANG Yi-song1，YANG Song-tao2，L Jia1* ，ZHAO Lin1(1. College of Pharmacy，Liaoning Univer-
sity of Traditional Chinese Medicine，Dalian Campus，Dalian 116600，China;2. Fushun Institute for Food and Drug Con-
trol，Fushun 113000，China)
［Abstract］ Objective To establish a method for the determination of miconazole nitrate in miconazole nitrate
suppository with HPLC．Methods The HPLC conditions were as follow:Diamonsil C18 column(200 mm ×4. 6 mm，5
μm)． Mobile phase:Mixture of merhanol，acetonitrile and 1. 5% solution of ammonium acetate(40∶ 40∶ 20) ，the flow
rate was 1. 0 mL /min，detective wavelength:230 nm． Ｒesults The linear range was good in the range of 0. 502 5 ～
8. 04 μg，the average recovery rate was 99. 46% and ＲSD was 0. 72% ． Conclusion The HPLC method is accurate and
reliable，sensitive，reproducible． It fits the content determination of miconazole nitrate suppository．
Key words:Miconazole nitrite suppository;Content determination;HPLC
硝酸咪康唑栓为咪唑类广谱抗真菌药，是由
硝酸咪康唑加适宜基质制成的栓剂，其对多种真
菌，尤其是念珠菌有抗菌作用，对某些革兰阳性菌
和球菌也有抗菌作用［1-3］。《中国药典》2010 年版
(二部)中硝酸咪康唑原料药采用电位滴定法［4］，
此方法操作复杂，重现性差，结果误差也较大，该
方法不适应于硝酸咪康唑栓的含量测定。目前有
文献报道采用高效液相色谱法测定硝酸咪康唑栓
中硝酸咪康唑的含量［5-7］，本文采用高效液相色谱
法测定硝酸咪康唑栓中硝酸咪康唑的含量，结果
显示该方法简便、准确且重现性良好，可用于硝酸
咪康唑栓的含量测定。
1 仪器与试药
1. 1 仪器 Agilent 1100 型高效液相色谱仪(美
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