全 文 ： 2008, Vol. 29, No. 04 食品科学 ※工艺技术214
淡豆豉、黄大豆及黑大豆中异黄酮苷元的
提取与含量比较
张 静1,2，田平芳1，葛喜珍2,*，胡静远2，李 申2，王 鑫1
(1.北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029；
2.北京联合大学生物化学工程学院，北京 100023)
摘 要：为探讨淡豆豉、黄大豆及黑大豆中异黄酮苷元的提取与含量，本研究采用超声提取，用β-葡萄糖苷酶
酶解大豆异黄酮中的糖苷键。以聚酰胺薄膜层析定性、HPLC定量检测不同原料中异黄酮苷元含量。实验结果表
明，HPLC最佳流动相为甲醇-乙酸-水(12:1:10)，染料木苷、大豆苷元和染料木素在20min内分离良好。大豆异
黄酮苷元含量依次为：淡豆豉＞黄大豆＞黑大豆。精密度实验RSD分别为1.45 %和1.6 %，平均加样回收率100.
93%，证明实验所建立的检测方法准确、可靠。
关键词：超声提取；聚酰胺；酶解；染料木素；大豆苷元；高效液相色谱
Extraction and Comparison of Isoflavone Aglycones in Seme Sojae Preparatum, Soybe n and Black soybean
ZHANG Jing1,2，TIAN Ping-fang1，GE Xi-zhen2,*，HU Jing-yuan2，LI Shen2，WANG Xin1
(1.College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China；
2.Biochemical Engineering College, Beijing Union University, Beijing 100023, China )
Abstract ：To explore the extraction and content of isoflavone aglycones in Seme Sojae Prepar tum, soybean a d black soybean,
ultrosonic wave was used in the experiments. Besides, soybean isoflavone glucosides were transformed to aglycones by β-
glucosidase. Soybean isoflavones in different materials were identified by the method of polyam ide TLC, while quantified by
HPLC. The experiments results indicated that genistin, daidzein and genistein could be separated perfectly within twenty minutes
under the mobile phase of methanol:aceticacid:water (12:1:10). The content of isoflavone aglycones was the most in Seme sojae
Preparatum, and black soybean had the lest content. The precision RSD were 1.45 % and 1.6 % respectively, and the average
recovery was 100.93 %, which proved that the method of experiments was both veracious and credible.
Key words：ultrosonic extraction；poly m de；hydrolyze；genistein；da dzein；HPLC
中图分类号：O623.54 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2008)04-0214-04
收稿日期：2007-03-23
基金项目：北京市教育委员会科技发展计划资助项目(KM200611417013)；
北京联合大学生化学院生物化工重点建设学科项目(0650411；0660415)
作者简介：张静(1982-)，女，硕士研究生，研究方向为天然药物化学。E-mail：jingbuct@sina.com
*通讯作者：葛喜珍(1968-)，女，副教授，博士，研究方向为中药药理。E-mail：gexizhen@163.com
大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的一类次生代谢
产物，主要分布于大豆种子的子叶和胚轴中。它具有
多种药理活性[1-2]，如防治糖尿病及减轻糖尿病并发症，
抗氧化作用，雌激素样作用，抗肿瘤作用，防治心血
管疾病以及预防骨质疏松症等。大豆异黄酮分为游离型
苷元(aglycone)和结合型糖苷(gluconside)两大类。苷元
由于脱去糖基，极性减小，脂溶性增加，因而在人体
内的吸收比糖苷快，摄入人体后能迅速通过小肠吸收，
进入血液循环，较快达到所需血药浓度，发挥药效作
用[3]。然而游离苷元仅占总异黄酮含量的2%～3%，大
量糖苷型大豆异黄酮需经水解转化为游离苷元，才能够
有效发挥药理活性作用。
大豆异黄酮存在于各色种皮大豆中，由大豆发酵而
来的中药淡豆豉也含有此成分。目前已有大量关于各色
种皮豆类异黄酮含量的相关研究[4-5]，但研究报道的含量
差异较大，且缺乏系统比较。本实验旨在通过比较黑
大豆和黄大豆中总异黄酮的含量差异，期望能对淡豆豉
炮制原理加以阐述。并利用β-葡萄糖苷酶水解大豆异
215※工艺技术 食品科学 2008, Vol. 29, No. 04
黄酮糖苷，比较三者异黄酮苷元含量差异。
1 材料与方法
1.1材料
黄大豆、黑大豆、淡豆豉均购自安国中药材市场，
经北京联合大学生化学院制药工程教研组鉴定为正品。
1.2试剂
胃蛋白酶(1:12000，20060602) 北京奥博星生物技
术有限公司；β-葡萄糖苷酶(50U，6017041104) Sigma
公司；染料木苷、大豆苷元、染料木素标准品 中国
药品生物制品检定所；色谱甲醇；乙醇、乙酸、醋酸
钠、石油醚、浓硫酸、苯酚等均为分析纯。
1.3仪器与设备
高效液相色谱仪(包括LC-10AT 泵、SPD-10A 检测
器、SCL-10A 控制器、CTO-10AS 柱温箱) 岛津公
司；0.45μm微孔滤膜；KQ-250B型超声波清洗器 昆
山市超声仪器有限公司；RE-3000旋转蒸发仪 上海亚荣
生化仪器厂；SHZ-95B型循环水式多用真空泵 河南巩
义市英峪予华仪器厂；6002型高速粉碎机；METTLER
AE100电子分析天平 梅持勒-托利多仪器有限公司；
聚酰胺薄膜(8×8cm) 浙江台州市；ZF7三用紫外分析仪
上海康华生化仪器制造厂；恒温水浴箱。
1.4方法
1.4.1总异黄酮提取
将淡豆豉、黄大豆、黑大豆粉碎，过4 0目筛，
石油醚脱脂，烘干。三种原料各称量20g，80%乙醇
温浸24h(料液比 1:10)，超声提取30min/次，3次，提
取温度6 0℃，过滤。弃去滤饼，合并滤液，挥发溶
剂，采用80%乙醇反复冷浸法除去少量杂蛋白，得总
异黄酮浓缩液。
1.4.2聚酰胺薄膜层析定性检测
分别配制染料木苷、大豆苷元、染料木素标准品
溶液以及混合标准品溶液，以甲醇-醋酸-水(18:1:1)为
展开剂系统，用1.5%的AlCl3乙醇溶液显色，吹干，
254nm紫外灯下观察，结果见表1。结果表明三种标准
品分离良好，混合标准品中三者的Rf值分别为：染料
木苷0.664，大豆苷元0.455，染料木素0.345。将提取
的异黄酮样品分别点样于聚酰胺薄膜，展开约30min，
有效成分分离良好。
标准品 未喷显色剂时 喷显色剂后 荧光斑点
大豆甙元 蓝紫色荧光 显蓝紫色荧光 明亮
染料木苷 不显荧光，为黑斑 亮绿色荧光 较明亮
染料木素 不显荧光，为黑斑 绿色荧光 较暗
表1 标准品显色反应
Table 1 Color reaction of standard substance
1.4.3β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮
将β-葡萄糖苷酶(50U)溶解于pH5.0的醋酸-醋酸钠
缓冲溶液，定容至30ml。依据β-葡萄糖苷酶的酶学性
质[6]，本实验酶解条件为：恒温水浴45℃，pH5.0，水
解时间2.5h。
1.4.4HPLC检测大豆异黄酮含量
1.4.4.1色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18(250×4.6mm，5μm)；流
动相：甲醇-乙酸-水(12:1:10)；流速：1.0ml/min；柱
温：25℃；进样量：20μl；检测波长：260nm。
1.4.4.2标准储备液的配制
将三种标准品减压干燥12h。准确称量染料木苷2.5mg、
大豆苷元2.5mg、染料木素1mg，分别用色谱甲醇定
容，得三种不同浓度标准储备液：0.1mg/ml染料木苷，
0.05mg/ml大豆苷元、0.01mg/ml染料木素。
1.4.4.3标准方程
按照表2配制混合标准浓度梯度溶液，分别用色谱
甲醇定容至10ml。0.45μm微孔滤膜过滤，HPLC检测，
三者保留时间分别为：染料木苷约4.6min、大豆苷元约
10.5min、染料木素约16min(图1)，可见此色谱条件下
三种有效成分分离较好。得到以下三条标准曲线方程
(横坐标x：浓度μg/ml，纵坐标y：峰面积×10-5)。
染料木苷：y=2.8856x+4.3912 R2=0. 993(线性范围
10～35μg/ml) (1)
大豆苷元：y=2.6713x+0.0955 R2=0. 997(线性范围
0.5～10μg/ml) (2)
染料木素：y=5.3054x+0.28 R2=0.9994(线性范围
0.1～6.0μg/ml) (3)
标准储备液
浓度 浓度 浓度 浓度 浓度 浓度 浓度
梯度1 梯度2 梯度3 梯度4 梯度5 梯度6 梯度7
染料木苷(ml)1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 ×
大豆苷元(ml)0.1 0.5 1.0 1.5 2.0 × ×
染料木素(ml)0.1 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0
表2 混合标准浓度梯度溶液的配制方法
Table 2 Preparation method of mixed gradient concentration -
standard solution
注：“×”表示该浓度梯度混合溶液不含有相对应的标准物质。
2 结果与分析
2.1水解前后样品色谱图对照
2.2水解前总异黄酮含量
将提取所得总异黄酮用色谱甲醇溶解并定容至一定
体积，0.45μm微孔滤膜过滤，HPLC进行检测，换算
得异黄酮含量(表3)。
2.3水解后异黄酮苷元含量
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大豆苷元 RSD(%)染料木素 RSD(%)
精密度1 2105094 1683421
精密度2 2122474 1714545
精密度3 2132163 1.45 1645376 1.6
精密度4 2185244 1696460
精密度5 2155177 1665201
表5 精密度实验结果
Table 5 Results of precision experiments
图1 混合标准品的色谱图
Fig.1 Chromatogram of mix-standard substance
染料木苷
大豆苷元
染料木素
将水解后的大豆异黄酮在相同色谱条件下进行检
测，由检测结果换算得到异黄酮苷元在三种不同原料中
的含量(表4)。
2.4水解转化率
依据水解前后染料木素的含量变化计算三种不同原
料的水解转化率，计算结果表明三者的水解转化率分别
为：淡豆豉 19.27%，黄大豆 28.58%，黑大豆 21.20%。
水解后染料木素的转化量
水解转化率(%)=—————————————×100
水解前染料木苷含量
2.5精密度实验
精密移取淡豆豉样品溶液1ml，分别置于五支10ml
样品含量(μg/g) 染料木苷 大豆苷元 染料木素
淡豆豉 1076.8 310.48 141.93
黄大豆 580.23 27.43 14.99
黑大豆 603.42 13.48 5.26
表3 总异黄酮含量
Table 3 Content of total isoflavones
样品含量(μg/g) 大豆苷元 染料木素
淡豆豉 878.6 349.47
黄大豆 292.15 180.83
黑大豆 279.61 133.19
表4 水解后样品的苷元含量
Table 4 Aglycones contents of hydrolyzed sample
刻度试管中定容至相同体积，微孔滤膜过滤，HPLC检
测结果见表5。
以上精密度实验结果表明，本实验仪器及检测方法
重现性和稳定性好，检测结果准确性高。
1 2
1.大豆苷元；2.染料木素。
图3 黄大豆水解前后苷元含量的变化
Fig.3 Changes of aglycones contents in hydrolyzed soybean
1
2
图2 淡豆豉水解前后苷元含量的变化
Fig.2 Changes of aglycones contents in hydrolyzed seme sojae
preparatum
1.大豆苷元；2.染料木素。
1
2
1
2
图4 黑大豆水解前后苷元含量的变化
Fig.4 Changes of aglycones contents in hydrolyzed black
soybean
1 2
1
2
1.大豆苷元；2.染料木素。
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2.6加样回收实验
精密移取九份已知含量的淡豆豉样品溶液，分别置
于10ml刻度试管中，准确添加染料木素标准溶液适量，
配成高、中、低三组不同浓度，定容混匀，检测结
果见表6。平均加样回收率分别为：102.6%、99.6%、
100.6%(n=3)。
3 讨 论
3.1本实验首先尝试采用硅胶板分离异黄酮，使用多
种展开剂系统，均未得到理想的分离效果。用聚酰胺
薄膜分离大豆异黄酮的效果明显优于硅胶板，经筛选得
到两种最优展开系统：甲醇-醋酸-水(18:1:1)和丙酮-乙
酸-水(4:2:4)。然而丙酮系统展开时间较长且毒性较大，
故选用甲醇-醋酸-水(18:1:1)为最佳展开系统，用于异
黄酮的定性分析。结果表明，聚酰胺薄膜更适用于分
离大豆异黄酮。曾有相关文献报道薄层层析法分离大豆
异黄酮[7-8]，但普遍存在展开剂系统毒性较大(如苯系
统，氯仿系统等)或选用硅胶板分离效果差、灵敏度低
样 品 峰面积 加样回收率(%)RSD(%)平均加样回收率(%)
低剂量组 2245085 106
2207388 98.8 0.85 102.6
2229838 103
2441186 95.5
丰剂量组 2472392 99.1 1.50 99.6
2515007104.5
2757540101.2
高剂量组 2729578 98.6 0.71 100.6
2767078102.1
表6 加样回收实验结果
Table 6 Results of recovery experiment
大豆异黄酮苷元和葡萄糖配基。本实验采用β-葡萄糖
苷酶水解异黄酮，操作条件温和，且不会减少高效液
相柱的使用寿命。估计由于β-葡萄糖苷酶添加量不
足，造成水解效率不高。
3.3本研究结果表明，异黄酮苷元在三种不同原料中
的含量为：淡豆豉＞黄大豆＞黑大豆，证明了大豆发酵
过程中生物转化所起的重要作用，可能是发酵微生物产
生了β-葡萄糖苷酶，此酶使异黄酮糖苷转化为游离苷
元，从而使淡豆豉中苷元的含量远远高于黄、黑大豆。
同时，本实验结果表明，黄大豆中大豆异黄酮含量略
高于黑大豆。此结果与笔者的预想不一致，推测可能
与实验原料的选择有关。
本实验以表面光滑无皱缩的黑色表皮大豆为原料，
全国中药炮制规范及药典中记载淡豆豉的炮制原料为表
面皱缩不平的黑大豆[10]，故推测此种黑大豆异黄酮含量
可能高于黄大豆和表面光滑的黑大豆，此推测有待进一
步研究和证明。从古至今多以黑大豆为原料炮制淡豆
豉，也可能并不是由于黑大豆与其它种皮大豆中异黄酮
含量的差异，而与黑大豆的特殊药用功效有关[11]，详
尽的化学成分和炮制原理有待于进一步研究。
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等问题。
考虑到样品中大豆异黄酮为多种成分的混合物，实
验配制了混合标准溶液点样。结果表明，本展开剂系
统下混合标准样中三种标准物质分离良好，但Rf值均小
于其单独点样时的Rf值，推测与混合物中各组分间相互
作用有关。
3.2大豆异黄酮糖苷属于氧苷类，是酚羟基与糖缩合
而成的β-Ｄ葡萄糖苷。通过水解反应使苷键裂解得到