全 文 ：应用与环境生物学报 2010，16 ( 3 ): 380~384
Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X
2010-06-25
DOI: 10.3724/SP.J.1145.2010.00380
紫云英（Astragalus sinicus L.）是能形成共生固氮体系
的豆科植物，在我国长江中下游和华南地区广泛种植，在日
本、越南、朝鲜半岛等国家和地区也有生长 . 紫云英主要用
作水 稻绿肥，对于提高中低产田土壤 有机 质含 量、改善土
壤的物理性状和增加土壤肥力具 有明显的效 果 . 20世纪40
年代，陈华癸院士首次从紫云英根瘤中分离发现根瘤菌，当
时根据与豆科植物互接种族关系将其定名为紫云英根瘤菌
（Rhizobium astragali）[1]；Chan等研究了从中国南京和日本
Otaki等地采集的11个菌株，将其归于Bradyrhizobium [2]；1991
年，陈文 新院士采用数值分类 法，重 新 命名为华癸根瘤菌
（R. huakuii） [3]；1997年又并入Mesorhizobium属，称为华癸中
生根瘤菌（Mesorhizobium huakuii）[4]. 随着现代分子生物技
术的应用和对紫云英根瘤菌分类研究的不断深入，发现其遗
传多样性较为丰富，除Mesorhizobium属的几个种外，紫云英
根瘤菌还分布在Agrobacterium、Mesorhizobium、Rhizobium和
Sinorhizobium属中[5].
在紫云英绿肥的培育过程中，接种与品种相匹配的根瘤
菌尤为重要. 本研究在筛选根瘤菌与不同品种紫云英高效结
瘤的基础上，通过16S rRNA基因序列分析，对部分结瘤效果
好的菌种进行了进一步鉴定和系统发育研究.
1 材料与方法
1.1 菌种来源
在筛选与不同品种紫云英高效结瘤的根瘤菌过程中，将
中国农业微生物菌种保藏中心库藏的60余株分离自紫云英的
根瘤菌与7个紫云英推广品种进行结瘤匹配试验，初步得到
13株结瘤固氮效果好的菌株. 对这13株菌进行了系统发育分
析，菌种的具体编号、来源等相关信息见表1.
1.2 供试菌种与紫云英的结瘤试验
采用试管 栽培的方法：将Jensen无氮植物培养基 分装
到试管（18 mm×210 mm）中，加入折叠好的滤纸条，以121 ℃
湿热灭菌30 min；选取籽粒饱满的紫云英种子经75%酒精和
0.1%酸性升汞各处理5 min，用无菌水洗涤10次，于28 ℃催芽.
将催芽成功的种子放入菌悬液中浸泡30 min，每管2粒播入
试管中，并设不接种对照. 光照培养箱内培养2 mo后记录结
瘤情况.
1.3 根瘤菌DNA模板制备
采用菌落裂解法提取菌体总DNA[6]：取适量菌体，煮沸
10 min，冷却裂解后，以10 000 r/min离心5 min，取上清3 µL作
紫云英根瘤菌的系统发育多样性*
张晓霞1 马晓彤1 曹卫东1 韦善君2 蔡建辉2 姜瑞波1**
（1中国农业科学院农业资源与农业区划研究所中国农业微生物菌种保藏中心 北京 100081）
（2中央民族大学生命与环境科学学院 北京 100081）
Phylogenetic Diversity of Rhizobial Bacteria Isolated from Astragalus sinicus*
ZHANG Xiaoxia1, MA Xiaotong1, CAO Weidong1, WEI Shanjun2, CAI Jianhui2 & JIANG Ruibo1**
(1Agricultural Culture Collection of China, Institute of Agricultural, Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)
(2College of Life and Environment Sciences, Central University for Nationalities, Beijing 100081, China)
Abstract Taxonomic and phylogenetic characteristics of 13 rhizobial strains were studied by 16S rRNA gene sequence
comparisons based on during a study of screening high symbiotic matching combinations of rhizobia and Astragalus sinicus
varieties. The results showed that the 13 strains could be divided into 3 clusters, belonging to three genera Mesorhizobium,
Agrobacterium and Stenotrophomona, respectively. The results also indicated that rhizobia species diversity and phylogenetic
diversity were abundant in the A. sinicus nodules．The 16S rRNA gene sequence of strain ACCC13065 was 100% similar to
type strain of S. rhizophila, within γ-proteobacteria. It was the first time to report the legume-nodulating γ-proteobacteria
besides α- and β-rhizobia. Fig 4, Tab 3, ref 28
Keywords Astragalus sinicus rhizobia; 16S rRNA gene; phylogenetics; diversity; γ-proteobacteria
CLC Q939.114.03
摘 要 在筛选根瘤菌与不同紫云英品种高效结瘤的基础上，通过16S rRNA基因序列分析，对13株共生结瘤效果
好的菌种进行了系统发育研究. 结果表明，13株菌属于3个主要聚类群，分别与Mesorhizobium、Agrobacterium和
Stenotrophomonas亲缘关系最为接近，种类多样性较为丰富；其中编号为ACCC13065株的菌株与S. rhizophila 16S
rDNA序列相似性为100%，位于γ-变形菌纲，这是除α-变形亚纲、β-变形亚纲外所发现的一类新的根瘤菌类型. 图4 表3
参28
关键词 紫云英根瘤菌；16S rDNA；系统发育；多样性；γ-变形菌纲
CLC Q939.114.03
收稿日期：2009-06-30 接受日期：2009-09-30
∗公益性行业（农业）科研专项经费（No.200803029-01）、中央级公益性科
研院所基本科研业务费专项资金（No. 2009-10）和国家自然科学基金项目
（No. 30900001）资助 Supported by the Special Scientifi c Research Fund
for Commonweal Agricultural Industry of China (No. 200803029-01), the
Special Foundation for Central Academies of China (No. 2009-10) and the
National Natural Science Foundation of China (No. 30900001)
∗∗通讯作者 Corresponding author (E-mail: accc@caas.ac.cn)
3813 期 张晓霞等：紫云英根瘤菌的系统发育多样性
为模板.
1.4 16S rRNA基因序列扩增及测定
采用引物799f：5’-AACAGGATTAGATACCCTG-3’，
2 7 f：5’- AG AG T T T G AT C C T G G C T C AG -3’；14 9 2 r：
5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’[7]. 反应体系为50 µL，反应
条件如下：95 ℃，5 min；95 ℃，45 s，55 ℃，60 s，72 ℃，60 s，
30个循环；72 ℃，8 min；取PCR产物3 μL与适量的上样缓冲
液混合，1%琼脂糖凝胶电泳，100 V电压30 min，EB溶液染
色，凝胶成像仪观察拍照，PCR产物于-20 ℃保存. 测序工作
委托上海英骏生物工程技术服务有限公司用ABI3730型自动
测序仪完成.
1.5 序列分析
获得序列经校对后与GenBank数据作相似性分析，获得
同源性相近的菌种序列，通过CLUSTAL_X（Version 1.83）程
序多重比对[8]，采用Mega 4.0软件，分别用邻接法（Neighbor-
joining）、最小进化距离法（Minimum-evolution）及最大简约
法（Maximum-parsimony）3种方法进行聚类分析，构建进化
树，系统进化矩阵根据Kimura two-parameter模型估计. 采用
1 000次自展值（Bootstrap value）分析来评估系统进化树拓扑
结构的稳定性 [9].
2 结果与分析
用1492r为引物测定了l3株紫云英根瘤菌的的16S rRNA
基因部分序列（约700 bp左右），并用Mega 4.0软件进行聚类
分析，构建 进化树并计 算各菌株间的进化 距离，所构建的
进化树和试 验菌株间的进化 距离分别见图1（N-J法）和表
2. 从图1可以看出，13个试验菌种分为3个类群，ACCC13004
和ACCC13065各形成一 个类 群，其他11株菌聚为一类 . 从
表2可知，ACCC13004与其他菌种的相似性最高为93.4%，
ACCC13065与其他试验菌株的相似性最高仅为82.8%，因此
对这两株菌进行单独分析，并对ACCC13004和ACCC13065
的16S rDNA全序列进行了测定. 所有获得序列用Blast搜索软
件从GenBank公共数据库中进行相似性搜索，调出相似性最
高的相关菌株的16S rRNA基因序列，再次用Mega 4.0软件进
行序列比对、相似性计算、进化距离矩阵计算、聚类分析和
系统进化树构建等系统发育分析，结果表明，这13个菌株分
别与3个不同的属聚为一类，其中11株菌与Mesorhizobium属
的多个种位于同一进化分支， 其他两株菌中ACCC13004与
Agrobacterium属的菌株亲缘关系最为接近，ACCC13065与
Stenotrophomonas属聚为一类，所构建的进化树（N-J法）分
别见图2、图3和图4.
从图2可以看出，位于中慢生根瘤菌（Mesorhizobium）
分支 的11株菌分 别 属于两个不同的 类 群，其中8株菌与 华
癸中慢生根瘤菌（M. huakuii）聚为一类，与华癸中慢生根
瘤菌模式菌株 IAM 14158T的相似性为99.7%~100%；其他3
株与M. mediterraneum及 M. temperatum聚为一类，与两个
种的 模 式菌 UPM-Ca36T、SDW 018T16S rDNA的序列相似
性均为99.5%~100%. M. huakuii是 最初分离自紫云英并命
名的根 瘤 菌类 群，后来又 陆 续报 道了M. septentrionale、
M. temperatum中慢生根瘤菌类型 [10]以及 Agrobacterium、
Rhizobium和Sinorhizobium属可与紫云英结瘤的根瘤菌菌株 [5].
ACCC13161、ACCC13162和ACCC13061与M. temperatum、M.
mediterraneum均有较高的相似性，其中M. mediterraneum为
已报道可与紫云英共生结瘤的根瘤菌类型，而M. temperatum
表1 菌种来源
Table 1 Sources of the tested strains
ACCC编号
ACCC number
原始编号
Origin number
菌种来源
Sources
分离地
Locality
13004 38D ← ISF ← IM
13036 F6/WIV ← ISF ← WIV
13040 紫81 Zi 81 ← ISF ← NAU
13052 14 ← ISF 广西玉林石南镇 Shinan Town, Yulin City, Guangxi Province
13057 22 ← ISF 广西玉林雅桥 Yaqiao Town, Yulin City, Guangxi Province
13058 24 ← ISF 广西玉林宁明 Ningming Town, Yulin City, Guangxi Province
13059 26 ← ISF 广西玉林宁明 Ningming Town, Yulin City, Guangxi Province
13060 33 ← ISF 广西玉林宁明 Ningming Town, Yulin City, Guangxi Province
13061 48 ← ISF 广东梅县 Mei County, Guangdong Province
13069 49 ← ISF 广东梅县 Mei County, Guangdong Province
13065 C14 ← ISF 安徽宣州 Xuanzhou County, Anhui Province
13161 F4 ← ISF 安徽宣州 Xuanzhou County, Anhui Province
13162 F8 ← ISF 安徽宣州 Xuanzhou County, Anhui Province
ISF：中国农业科学院土壤肥料研究所；IM：浙江农业科学院微生物研究所；WIV：中国科学院武汉病毒研究所；NAU：南京农业大学
ISF: Institute of Soil Fertilizers, Chinese Academy of Agricultural Sciences; IM: Institute of Microbiology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences; WIV:
Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences; NAU: Nanjing Agricultural University
图1 供试菌株16S rDNA部分序列聚类图（Neighbor joining法）
Fig. 1 Phylogenetic tree of 13 tested strain based on comparison of the 16S
rRNA gene partial sequences (Neighbor joining method)
382 16 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol
与鹰嘴豆共生结瘤的根瘤菌类群，未见到与紫云英共生结
瘤的报道；另一方面，在早期的根瘤菌分类系统中，紫云英
根瘤菌在互接种族中独属一族，综合以上两个因素考虑，这
3株菌可能与M. mediterraneum亲缘关系更为接近，但确切的
分类地位还需对菌种进行进一步的多相分类研究.
菌株ACCC13004与A. vitis LMG8750T的16S rDNA同源性
分别为99.3%，利用Mega软件提供的3种不同方法聚类分析，
不同聚类的方法与A. vitis菌株聚为一类，且有较高的自展值
（Bootstrap value）作为支持.
菌株ACCC13065与S. rhizophila e-p10T的16S rDNA的同
源性为99.2%，利用Mega 4.0软件，采用3种不同的计算方法，
均与S. rhizophila e-p10T稳定地聚为一类. S. rhizophila为2002
年发现的一类菌 种，分离自植物（土豆、油菜）的根际及根
内 [11]，迄今未在豆科植物内发现，其分类地位为γ-变形亚纲
（Gamma-proteobacteria）黄单胞菌目（Xanthomonadales）黄
单胞菌科（Xanthomonadaceae）. 通过与不同品种的紫云英结
瘤试验结果表明，ACCC 13065具有较强的结瘤固氮能力.
通过滤纸桥法，对供试菌种与紫云英的共生性状 进行
了研究. 结果表明，供试菌株可与不同品种的紫云英共生结瘤
表2 试验菌株间的进化距离（Mega 4.0软件计算，Kimura模型）
Table 2 Pairwise distances of the tested strains computed by Mega 4.0 based on Kimura model
编号 Number 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
1 13037
2 13069 0.000
3 13036 0.000 0.000
4 13058 0.000 0.000 0.000
5 13067 0.003 0.003 0.003 0.003
6 13052 0.000 0.000 0.000 0.000 0.003
7 13040 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002
8 13059 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.002
9 13161 0.002 0.002 0.002 0.002 0.005 0.002 0.003 0.002
10 13061 0.002 0.002 0.002 0.002 0.005 0.002 0.003 0.002 0.000
11 13162 0.002 0.002 0.002 0.002 0.005 0.002 0.003 0.002 0.000 0.000
12 13004 0.066 0.066 0.066 0.066 0.066 0.066 0.067 0.066 0.067 0.067 0.067
13 13065 0.172 0.172 0.172 0.172 0.170 0.172 0.174 0.174 0.174 0.174 0.174 0.174
图2 11株位于Mesorhizobium属分支的根瘤菌与相近属根据16S rRNA基因构
建的系统进化树（Neighbor joining法）
Fig. 2 Phylogenic relationship of 11 strains

and related genus of
Mesorhizobium based on 16S rRNA gene sequences (Neighbor joining
method)
图3 ACCC13004与相近属根据16S rRNA基因构建的系统进化树（Neighbor
joining法）
Fig. 3 Phylogenetic relationship of ACCC13004 and species of related genera
based on comparison of the 16S rRNA gene sequences (Neighbor joining
method)
图4 ACCC13065与相近属根据16S rRNA基因构建的系统进化树（Neighbor
joining法）
Fig. 4 Phylogenetic relationship of 13065 and species of related genera
based on comparison of the 16S rRNA gene sequences (Neighbor joining
method)
3833 期 张晓霞等：紫云英根瘤菌的系统发育多样性
（表3），为筛选不同品种紫云英高效共生及广谱共生的根瘤
菌提供了菌种资源及科学依据.
3 讨 论
通 过 16Sr R NA 基 因 序 列 分 析 发 现，所 研 究 的 13株
分 离自紫 云 英 根 瘤 的 菌 株 属 于 3 个不 同 的 类 群，分 别 为
Mesorhizobium、Agrobacterium和Stenotrophomonas. 这类菌株
在以传统的互接种族为分类的系统中，统一为紫云英根瘤菌
且独属一族. 随着多相分类系统在细菌分类中的应用，新种
不断被发现，根瘤菌的多样性得以丰富，根瘤菌的分类系统
也不断地被修改和完善 [12]. Gao等对95株紫云英根瘤菌多样
性进行了系统分析，发现这些菌株分别归为Mesorhizobium、
Agrobacterium、Rhizobium和Sinorhizobium属 [5]，在此基础
上，报道了两个紫云英根瘤菌的新种M. septentrionale和M.
Temperatum [10]. 结合本研究结果，可以确定紫云英根瘤菌具
有丰富的种类多样性.
本 研 究中发 现了与 A. v i t i s缘 关 系 相 近 的 一 株菌 . 对
于Agrobacter ium属的 分 类 地位，一直以 来 存 在争 议 . 依
据16S rDNA序列分析，Young等 建 议将Agrobacterium、
Allorhizobium两个属统一归为Rhizobium属[13~14]；但以Farrand
为代表的一部分科学家则强烈反对上述意见，希望保留原
来的命名系统 [15]. 国际系统细菌学委员会根瘤菌分类委员
会分 会则采 取了折衷的办 法，同时 承认两个分类系统，研
究者可以根据自己的喜好和习惯判断并选择相应的分类系
统 [16~17]. Agrobacterium属与豆科植物的共 生固氮能力至今
存在争议，已有报道 Agrobacterium属的一些菌株可与豆科
植物结瘤，如A. radiobacter与菜豆（Phaseolus vulgaris）、杭
子梢属（Campylotropis spp.）、决明属（Cassia spp.）[19]、紫藤
（Wisteria sinensis）[20]结瘤，但目前尚未得到直接的证据，
有观点认为Agrobacterium是作为伴生菌进入根瘤中[21~22]. 具
有Sym质粒的A. rhizogenes菌株可与P. vulgaris形成根瘤和
瘤组织 [23]. 本研究通过与不同紫云英品种的回接试验，证实
ACCC13004具有结瘤固氮功能，如需进一步证实，需采用基
因标记等方法检测与紫云英结瘤状况，并检测其结瘤及固氮
基因是否存在.
在目前 已发 现 的 根 瘤 菌 中，绝 大 部 分 种 类 分布 在α -
变 形亚 纲，近 年 来 报 道了在 β -变 形亚 纲中的 一 些 类 群 如
Burkholderia [24]、Cupriavidus [25]、Herbaspirillum [26] 3个属中的
部分种类也具有结瘤固氮功能 [27~28]. 截止目前，尚未发现在γ-
变形亚纲发现能与豆科植物结瘤的菌株，因而对ACCC13065
固氮结瘤功能特性及其分类地位的进一步研究将具有十分
重要的意义.
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表3 试验菌株在不同品种紫云英根部形成的根瘤状况
Table 3 Formation of root nodules by the tested strains in different varieties of A. sinicus
ACCC编号
ACCC
number
宁波大桥种
Ningbodaqiao
variety
丰城青杆种
Fengchengqinggan
variety
奉化大桥
Fenghuadaqiao
variety
闽紫6
Minzi 6
variety
弋江籽
Yijiaozi variety
余江大叶
Yujiangdaye
variety
新特早
Xintezao
variety
13004 + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + +
13036 + + + + + + + + + + + + + + + + + + / / /
13040 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
13052 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
13057 + + + + + + + + + + + + + + + + + + / / /
13058 + + + + + + + + + + + + + + + + + + / / /
13059 + + + - + + + + + + + + + + + + + + / / /
13060 + + + + + + + + + + + + + + + + + + / / /
13061 + + + + + + + + + + + + + + + + + + / / /
13069 + + / + + + + + + + + + + + / + + + / / /
13065 + + + + + + + + + + + + + + + + + + / / /
13161 + + + + + + + + + + + + + + + + + + / / /
13162 + + + + + + + + + + + / + + + + + + / / /
+：结瘤；-：未结瘤；/：无数据 +: Nodulation; -: Non- nodulation; /: Absent
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