全 文 ：第 f l期
12 月
首都师范大学学报 (自然科学版 )
J。川 r n a l。 〕f 〔` 。 I )i r o lN (〕r ma lU ni v e r 、 i t y
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N P lT l 基因在满江红鱼腥藻染色体
D N A g ln A 位点的定点整合及对泌氨和
细胞形态结构的影响 ` )
吴晓强 施定基扮 刘祥林 汪洪杰 邱泽生 张承谦 印莉萍 赵微平
( 首都师范大学生物系 )
摘 要
本研究构建了 含 月n 八 基 因片段和 N P T u 基因的单交换整合型重组质粒 阿 ; N I 一 1 , 并通 过
电激法 , 三亲接合转移 和二亲接合转移法导 入到满江红鱼腥藻细 饱中 . 用蓝细菌原位杂交法筛
选出转化细胞菌落 . 再经 (S 川 t h 。 r n 杂交方法进一步证实 了转化结果 . 化学测氨法表 明 , 培养 后
7一 川 d 泌氨达到高峰 , 转化细胞泌氨比对照高 1() 万 . 光镜观察表明 , 转化细胞藻丝变短 , 易断
成单个细胞 , 异形饱颇率降低 ; 扫描电镜观察抬出 , 转化细胞外壁有鳞片状鞘层 , 而对照较光
滑 .
关键词 : 满江红鱼腥藻 , N P lT l 基因 , 川。 A , 定点整合 , 泌氨 , 细胞形态结构 .
中图分类号 : Q 3 12
具异形胞的丝状体蓝细菌是研究光合固氮机理及细胞发育模式的理想材料「’ · “ , . 由于转
化技术尚不成熟 , 这类蓝细菌的基因工程操作仅限干 A n : l b: 、 e n a 7 l 2() 等少数材料川 . 这种转
化方法是通过三亲接合转移 , 将穿梭质粒导入蓝细菌细胞 . 穿梭质粒带有从蓝细菌分离的质
粒 p t) U I 的复制起点及 p B R 3 2 2质粒 , 所以可以在 E . 0 2 ; 及蓝细菌复制 . 我们曾把这种方法
应用于满江红鱼腥藻 , 但尚未成功
满江红鱼腥藻是一种从满江红鱼腥藻共生系统 中分离的蓝细菌 l[ 万〕 . 由于分离后许 乞特
性与原来共生的蓝细菌不同 . 也取 名为 A n a l。。 e二 s t r 。 in Z砰阅 , 这种蓝细菌受环境调节的可
塑性强 , 在生物工程上有应用的潜力厂 J. 在聚乙醇胺泡沫中满江红鱼腥藻经 固定化培 养后可
分泌微量的氨川 , 并且泌氨的量 与谷氨酸胺 合成酶 ( (粥 ) 的活性成正相关 . 我们的 _E作证明
G S 酶活性是受转录水平调节的冲亏. 为此 , 这里选择 了另 一条基因导入途径 , 即染色体定点整
合法 . 利用外源基因在 g ln A 位点的定点插入 , 来达到调控 g ln A 或使 g l n A 失活 , 经验证明 .
蓝细菌中所使用的抗 菌素选择 标记 以 新霉 素抗 性基 ifl[ N P T I 效 果最 佳 ( w ol k 。 ;l 二
收稿 日期 : 19 9 3一 0 4一 ( ) 8
1) 国家自然科学基金和北 京自然科学基金资助项 目
2) 中国科学院植物研究所
首都师范大学学报( 自然科学版 )19 9 3 年
18 9 4 )
, 因此本文选择了 N P T 亚作为插入基因 . N P T I 利用相邻的宿主基因 g ln A 片段在满
江红鱼腥藻细胞 内进行同源重组 , 可以通过单交换或双交换整合在染色体上 , 从而得到 -
定的保护 . 该方法 目前 仅在单胞藻有成功的报导 , 尚未见有丝状体的工作 ( W ol k 1 9 9 2 ) ·
1 材料和方法
1
.
1 菌株和质粒
大肠杆菌 JM 1 03 为转化受体菌 , 满江红鱼腥藻 ( 八an ab 阴 a az ,l zae ) 为美国 N e w t (。 n 博
士所赠 , 质粒 p A n 50 3为美国 P . C . W ol k 教授所赠 , 质粒 p R I、 4 47 为美国 E I泌 h a i 博士所赠 .
p R I 4 7含有 P 哪、 A 一 N P T H 基因 ,具有很强的新霉素抗 性 . E . co “ 及 A . o z lt) l、 培养条件及培
养基分另lj按标准条件操作仁9 , `。」 , A . az ,)l al 。 用平板法进行纯化 .
1
.
2 试剂和酶
限制性 内切酶及其它工具酶购自中国医学科学院基础所 , 缺 口 翻译试剂盒为 rP o m o ga
公司产品 , a 一 3 2 P 一d( 二T P 为福瑞公司产品 .
1
.
3 分子克隆技术
分子克隆的常规技术均按文献 [ 9〕方法进行 .
1
.
4 蓝细菌电激转化
利用本室参考文献 ( C a vl in 吕. H a n a w al t , 1 9 8 8) 自行研制的 s D 一 9 2一 工型电激仪 〔 ’ 艺 . 叁
照文献 [ 13 ] 方法进行电激转化 .
1
.
5 蓝细菌原位杂交
参照菌落原位杂交方法并作了修改刚 , 即将硝酸纤维素膜上的 A . “ z lt) zae 进行菌裂解
及杂交 , 菌裂解分别用十六烷基三甲基澳化氨 ( c T A )B 和微波处理 10 m i n `了二.
1
.
6 蓝细菌 D N A 提取及分子杂交
A
.
az 耐 la 己 染色体 D N A 提取方法按文献 [ 1 5 ] 方法进行 . 分子杂交按文献方法 [ 1川 进行·
.J 7 扫描及透射电镜观察
按文献 [ 7 ]方法进行制样 · 扫描及透射 电镜是 H I T A c H I一 60 。和 H 一 6 o l o A sc a n in n g s ys -
t e m
, 相机是 M a m i y a ( 6 x 7 ) .
1
.
8 泌按水平测定
按文献 [ 7 j方法进行 .
2 结果和讨论
2
·
l 重组质粒构建
根 据单交换原理 (图 1) 构建单交换型质粒 p G NI 一 4 ( 图 2 ) . 该质粒由 g如 A 基因片段
( E e o R I 切割 ) 与 p R I一 4 4 7重组得到 (图 3 ) . 而构建双交换的载体为 p ( ; E M 一 1 3 z f ( P r o m e g a
公司产品 ) , 特点是不含 E co R 】切点 . 当 7 . 5 k b 的 g ln A 一 iH dn 世 片段 与 p G E M 一 1 3 fz 连接
后 , 就较容易地在 g ln A 中任一 E co R 工位点插入 p R I J 4 47 质粒 , 得到双交换质粒 . 我们曾试
图利用部分酶解法在 p A n 50 3质粒 g ln A 中 E c >(r l 位点插入 p R I 2 4 4 7 . 但效果较差 ·
2
·
2 电激转化
将质粒 p G N I 一 4经电激转化 A . 二耐 z、 , 得到转化菌落 . 同样用三亲接合或二亲接合方
法也得到了转化菌落 . 接着用我们最近发展的蓝细菌原位杂交方法进一步筛选得到四 株含
第4 期 吴晓强等:N PTl l 基因在满江红鱼腥藻染色体N A D g lnA 位点的定点整合及对泌氨和细胞形态结构的影响 2 9
e hro n lo s o m e
P la s n ti d
hy b ri de ho rm
o s o m e
图 l 单 交换 原理
g lnA
N P T I的 转 化 蓝细 菌A . a zt, “ a 。 (探 针 为
p R L 4 4 7 )
, 命名为 p G N I 一 VI . 用 p R L 4 4 7作
探 针进行 原 位 杂 交时 对 照 为阴性 , 而 用
p A n5 03 中 g ln A 片段作探针杂交时 , 对照与
转化蓝细菌皆为阳性 (图4) . 将转化菌提取
染色 体 D N A 并 用 E co R I 酶切 后 , 再 用
p R I
J
4 4 7作探针进行 S o u t h r n 杂交 , 发现仅转
化菌出现一条杂区带 . 说明外源 N P T 亚基因
确实整合进转 化蓝细菌的染色体上了 .
2
.
3 形态观察
将转化蓝细菌 A . a oz “ “ 印G N 工 一 W及对
照 I 在含卡那霉素 (5 拌g / m l , ) 的 B G l ol 无氮
培养液中 , 置标准条件下培养 3周 , 对照。不
加抗菌素在 同样条件下培养 . 接着进行形态
学观察 , 发现转化细胞一般菌丝较短 (很少
出现像对照 。那样的 多于 10 个以 上细胞的长
菌丝 ) , 细胞间连间较脆弱 , 很容易断裂成单
细胞或 2一 5个寡聚细胞短丝 (图 5 ) . 转化细胞
壁结构明显不如对照坚实 ,在作原位杂交时 、
多种理化因素处理转化菌有很好的作用 , 而
③
P R L 4 4 7
( 2
.
SK b )
( 2
.
9一 1 0 K b
图 2 单交换质粒的构建
R l
:
E e o R I ; N m
: n e o m y e in
对照则被壁程度较差 . 用扫描电镜观察发现一般转 化菌 )(I 、N 卜 !、 外壁结构较粗糙 , 而对照
O壁较光滑 (图 6) . 经透射电镜观察也发现了一致的结果 (未发表 ) .
2
.
4 泌氨活性测定
用化学测氨法测定发现转化细胞泌氨量与对照有明显的差异 . 其中7号转化菌株泌氨比
对照高出 4 。% (图 7 ) . 另外 , 泌氨量随培养时间而变化 , 一般培养成 1至 2周泌氨达高峰 .
本工作利用同源定点整合方法将外源基因引进 A . az 耐 zae 细胞染色体上 , 高效可靠 , 避
免了蓝细菌分子遗传学工作中的 一个主要障碍 , 即较强的细胞 内核酸酶作用 . 通过整合位点
的控制来引入不同的外源基因 , 不仅可达到调控细胞代谢的 目的 , 而且可以使转化蓝细菌
获得一系列特殊的有益生物学性状并适用于不同的应用领域 . 比如本工作发现的泌氨特性 ,
经过进一步优化筛选培育优质菌株 , 作为氮肥资源将有可能应用于农业生产实践中 .

第4期 昊晓强等 :N P l T基因在满江 {,I 鱼腥藻染色体 ON八妇l叭 位点的定点整合及对泌氨和细胞形态结构的影响 3 1
-
图 6 扫描电镜 一曰蒲江红 鱼腥藻转 化细胞 外被的细微结构
A
: 具有光滑外被 的对照细 胞
I二: 具平几糙 外被的转 化细 目包
、一#
K、一!、U、一6 0 0 C K I
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夭数 d/ 天数 /,d
引了 满江夕 1_鱼腥 藻转 化细胞的 泌氨 水
平测量 (培养条件 见材料和方决 )
首都师范大学学报( 自然科学版 ) 9 1车) 3年淞
参 考 文 献
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王3 0 5 一 土3 〔) 7
阵 吴晓强 、 邱泽生 , 祁岩等 . 三甲基月桂基硫酸钠 ( T L S ) 在蓝细菌核酸提取中的作用 . 水生生物学
报 , 1 9 9 2 , 1 6 : 15 9一 1 6 1
S i t e D i r e c t e d I n t e g r a t i o n o f N P T 五 G e n e I n t o G l n A
o f t h e C h r o m o S 0 m e s i n A n a b a e l a A z o l l a e a n d i t s
E f f e c t s o n M o r P h o l o g y
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第4期 吴晓强等: N PT n 基因在满江红鱼腥藻染色体D N A gl A 位点的定点整合及对泌氨和细胞形态结构的影响 3 3
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b r id i z a t i o n
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B y o p t i e a l m i e r o s e o p e
, s e a n n i n g a n d t r a n s m i
s s i o n e l e e t r i e a l m i e r o s e o p e i t w a
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s h o w n a n d o b o v i o u s v a r i a n e e
s u e h a s t h e f i l a m e n t
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s m o o t h s h a P e o f e o n t r o l e e l l s i t w a s a l s o o b
s e r v e d t h a t t h e r e
s o m e r e d u d a n t e x e r e t i v e
s u b
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s t a n e e a t t a e h e d o n t h e e n v e lo p e o f t r a n s f o r m e d e e l l s
.
B y e h e m ie a l m e h t o d o f a m m o n i a
m e a s u r e m e n t
,
i t w a s f o u n d t h a t t h e a m o u n t o f a m m o n i a s e e r e t i o n f r o m t r a n s f o r m e d e e l l
s
w a s 4 0% h i g h e r t h a n t h o s e f r o m e o n t r o l e e l l s
·
K e y w o r d s
: a n a b a e n a a z o l l a e
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N P T 1 g e n e
,
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, s i t e d i r e t e d i n t e g r a t io n
, a m m o n ia
s e e r e t i o n
, e e l l m o r p h o lo g y a n d s t r u e t u r e
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