全 文 ：第 ” 卷 第 14 期
科 学 通 报
C H IN E SE S C IE N C E B U L L E T IN 一 , , 3 年 , 月
微波处理在满江红鱼腥藻原位杂交中的作用 ’
刘祥林 吴晓强 印莉萍 汪洪杰 邱泽生
(首都师范大学生物系 ,北京 10 0 0 3 7 )
关镶词 徽波 、 原位杂农 、满江红鱼强燕
为快速简便地筛选转基 因光合丝状固氮蓝细菌满江红鱼腥藻 (蓝藻 ) , 我们使用了原位杂
、 、 , 交技术 . 本文对生长固着在硝酸纤维素膜 ( N C一膜 )上的满江红鱼腥藻 ( A o b。。 “ oz “ 。 。 ) 藻
群落裂解方法 、 原位杂交条件等进行了摸索 . 其中尝试了液氮冻融 、微波处理 、 高温高压处理 、
温育等物理条件 , 三乙醇胺月桂基硫酸盐 ( T L S ) 、 T E N S 试剂 、 S a r k o s y 】, N o 0 H 、 澳代十六
烷基三 甲基胺 ( C T A B ) 等化学试剂及其多种因素的联合使用 , 共同处理 . 经多次实验 , 初步
筛选出用 C T A B 浸泡温育后 ,再用微波处理的裂解细胞方法 , 使满江红鱼腥藻原位 杂交取得
较理想的效果 , 并用此方法筛选出转基因的藻群落 .
1 材 料 和 方 法
L l 藻种和培养
才。 a 占a e n a a z o l l a 。 A a c 由美国农业部 N e w t o n 博士惠赠 . 培养条件见文献 [ l ] .
.1 2 重组质粒构建
方法见文献 〔2 〕 .
, 书 L 3 满江红鱼腥藻电转化
方法见文献 〔3 ] . 电激仪 自行研制 ” .
L 4 探针制备
按 rP o m e ga 公司缺口标记试剂盒程序将质粒 P R 4L 4 7 41[ 进行标记 , ” P 一 d C T P 为北京福
瑞公司产品 .
1
.
5 N C
一膜上细胞裂解方法
原位杂交的细胞裂解方法参见文献 〔2 〕. 以 1务 C T A B 浸湿滤纸 , 置平皿中 , 将附着生长
有满江红鱼腥藻的 N C 一膜放在平皿上 , 使藻群落朝上 , 置 37 ℃ 水浴中温育 60 m in 或更长些时
间 . 将 N C 一膜移人直径 90 m m 平皿中 , 加人少许 T E 溶液 (以 N C 一膜不被浸没为宜 ) ,将平皿
(不加盖 )放人微波炉内间断通电处理 Zm in ( l o OK 挡 , 微波炉为上海飞跃牌 w L一 5 0 01 型 ) .
取出后转移到另一平皿中 , 放置在 0 . , m o l / L N a 0 H 溶液浸湿的双层滤纸上变性 2 0m in . 接着
转人 0 . 5m ol / L T r is 一 H CI 溶液 ( p H 一 7 , 4 ) 浸湿的滤纸上中和三次 , 每次 15 m in . 用滤纸吸
干 ,夹好 ,置 6 0 一 8 0℃ 烘箱干燥 60 m in .
盆 t
1 9 92
一 1 2一 14 收稿 , 19 9 3一 0 2一 2 7 收修改稿 .
国家及北京市自然科学基金资助项 目 .
冲 生物化学和生物物理进展 ( 待发表 ) .
1 3 t s 科 学 通 报 第 ” 卷
L 6 原位杂交方法
参见文献〔 2 ] .
2 结 果 和 讨 论
转基因满江红鱼腥藻的重组质粒 PG N 按图 1进行构建 . g ln A 基因片段用 L M P 回收
后与载体 P R L 4 47 连接 . 含 g ln A 片段 A , B , C , D 的重组质粒分别命名为 P G N I一 4 . 用重
组质粒 P G N 进行电激转化满江红鱼腥藻 , 得到的转化子可在抗性 平 板 ( N m 5 0拌 g /m l) 和
B G l 液体 ( N m , 产 g /m l) 中扩大生长 . 为了快速简便地筛选出转基因满江红鱼腥藻 , 我 {1r
进行了蓝藻原位杂交试验 . 根据文献 〔1 ] , 满江红鱼腥藻具有较稠厚的粘胶鞘 , 使细胞在原位
杂交实验中难以裂解 . 我们进行原位杂交时曾试用了不同的物理和化学方法 . 经多次试验 ,
发现用 C T A B 浸泡 , 温育后 ,再用微波处理来裂解细胞效果最佳 . 利用该方法和 P R L 4 47 作
探针 , 对转基因满江红鱼腥藻进行原位杂交检测 ,成功地筛选出四种转基因藻群落 , 分别为 , , .
6 , 7 , 8 号藻 , 而对照藻为阴性 (图 2b 左 ) 利用 g ln A 作探针 , 则全部呈现阳性 (图 2b 右 ) . 这些
结果和 so ut he r n 杂交检验结果是一致的 (未发表 ) , 证明我们发展的蓝藻原位杂交方法是较
灵敏可靠的 .
图 l 重组质拉 P G N 的构建 图 2 转基因藻的原位杂交结果
二 N C一膜上的满江红鱼握旅 . 1为 , 号藻 , 2 为 6 号藻 , 3 为对
照旅 , 呼为 , 号藻 , 5 为 8 号藻 , ` , 7 , 8 为对照藻 ; b . l一 5 为
A 中样品 l一弓, 用 P R L 4盯 作探针的杂交结果 . `一8 为 A 中
样品 6一 8 , 用 gl n A 作探针的杂交结果
我们进行原位杂交时曾试用了不同的物理和化学方法 , 如液氮多次冻融 、 微波处理 、 高温
高压处理 、温育等物理条件及三乙醇胺月桂基硫酸盐 ( T L s ) 、 T E N s 试剂 、 s 。 r k o s刃 , aN 0 H 、
嗅代十六烷基三甲基胺 ( C T A B ) 等化学方法 . 经实验发现 , 虽然 C T A B 经常用于提取植物
D N A
, 且效果很好 , 但若单独使用 C T A B 处理 , 进行满江红鱼腥藻原位杂交并不成功 . 把满
江红鱼腥藻置 C T A B 液中温育 , 利用微波辐射热穿透力强的特点 , 在含水量很高的藻群落细 .
胞环境 中进行短时间微波辐射 , 使藻群落处于欲干而未干的状态 , 经几次辐射处理 , 细胞壁结
第 “ 期 科 学 通 报 1 39 1
图 3满江红鱼腥藻细胞经不同处理的光镜照片
a
.对照( 未经处理的转基因 7 号藻 ) ;
c
.
1% C TA B 温育 6 0 m i n + 微波 Zm i n ; d .
b
.
l% C A B T温育 6 0 m in , 3 7℃ ;
1% C T A B 温育 6 0 m i n + 微波 , m i n
久节 构即如图 3所示受到破坏 . 通过该方法及原位杂交 ,成功地检测出转基因满江红鱼腥藻 .
在多次实验过程中 , 发现转基因蓝藻和对照蓝藻的微波辐射耐受力是不同的 ”` . 用基本相
同的条件处理 , 转基因藻裂解程度要比对照藻大些 . 这一现象可能是转基因所致 ,扫描电镜的
结果 (待发表 )发现 , 转基因蓝藻和对照蓝藻的细胞表面有较大差异 . 目前我们仅见有利用微
波处理细胞分析微量元素的文献 6t, ” ,还未见其应用于提取 D N A 等方面的报道 , 本工作首次
将微波辐射处理应用于蓝藻的细胞裂解 , D N A 提取及原位杂交方法 . 使蓝藻分子生物学实
验技术迈进了关键的一步 , 以往筛选转基因藻群落要通过抗菌素平板反复筛选 , 以避免出现假
阳性藻群落 ,所以时间长工作量大 . 现在应用本技术将可以较快地筛选出阳性藻群落 , 在这方
面更广泛和更有效的应用 , 还有待于进一步摸索提高 。
致谢 本工作得到施定基先生的热情指导 , 特此致谢 .
饭 令 参 考 文 献
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