全 文 ：华中农业大学学报 8 ( 4) .2 8 5一2 9 0, 1 8 9
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z h o gn 月盯 i e u l t u ,· a l U n i。 。 sr i t夕
刊 . . . . 电闷 . . . . . . . . 目 . . . . . ` .曰 . . . .门 . . . . . . 口
,
紫云英根瘤菌寄主专性结瘤基因
和固氮基因的鉴定
张 』忠明 周俊初 陈华癸
( 华中农业 大学生物技术中心 , 43 。。 7 0 )
,
摘 要
用植物筛选法从紫云英根瘤菌 7 6 5 3 R基因文库中分离到能互补 7 6 5 3 R+ l (原菌株 7 6 5 3 R消除
共生质粒的突变株 )共生缺陷功能的重组质粒 p Ra Z 1 5 . p Ra Z 15质粒克隆有紫云英根瘤菌共同结瘤
基因簇 . 采用三亲交配一植物试验法 , 将 p Ra Z 15 质粒转移到碗豆根瘤菌菌株T 83 K 3和菜豆根瘤 菌
菌株3 6 2 2一 1 5中 , 用以回接紫云英植株 , 并在紫云英上结瘤 , 证实了 p Ra Z 15 质粒上克隆有紫云英
根瘤菌寄主专性结瘤基因 . 将 p R a Z 15 质粒再次转移到紫云英根瘤菌不结瘤突变株 765 3R十 l 中 ,
回接紫云英植株 , 用乙炔还原法测定出所结根瘤的固氮酶活性 . 用 a 一 , ’ p 一 d C T P 标记克隆右肺
炎克氏杆菌 in f H D K基因的 p S A 3。 , 以此作为探针 , 与 p R a Z 15 负粒的E co R盆片段杂交 , 证实了紫
云英根瘤菌in f H D K基因也存在于 p l扭2 15 质粒上 .
关 扭 词
紫云英根瘤菌 , 寄主专性结瘤基因 : 固氮酶基因 : p R a Z 15质粒 : 三亲交配
O 引言
紫云英 ( A st ar g al u : : 栩 f佣: L . ) 是中国南方水稻田 中广泛种 植的 一神上安 绿肥植 物 .
从 4 0年代以来 , 我国广泛开展了对紫云英根瘤菌的研究 〔` 1 . 众多的研究结果表 `· ) J , 紫 云 英
根瘤菌属于 独立的互接种族 [ 2 1 , 是种级水平上的一个独立聚类群 ( 陈文新 , 私人通讯 ) .
然而对于紫云英根瘤菌分子遗传学的研究则起步不久 。 几年来 , 继证实了紫云英 眼瘤菌广泛
存在大质粒 [ 3 1和共生墓 因存在于大质粒上 4[ 1后 , 又构建了紫云英根瘤菌基内文库 〔 ` 1 , 随
后我们首次从基因文库 中分离到克隆有完整功 能的紫云英根瘤菌结瘤 荃因 簇 的 重 组 质 粒
PR aZ 15 [
, ]
.
本文进 ` 步证实了 PR aZ 15 质粒上不仅克隆有共同结瘤荃因 ( on d D AB C ) , 而 lJ .也 含 有
紫云英根瘤菌寄主专性结瘤基 因 ( h胡 ) 和固氮酶结构基因 ( ln’ f H D K ) .
本 丈 1 9 8 9一 0 9一 10收 J嗯
网牢自林科学基全资助的课砚
2 8 6 华 中 农 业 大 学 学 报 8卷
1 材料和方法
1
.
1 扭 , . 株与质桩
见表 1 .
表 l 细 菌菌株与质拉
蔺林与质拉 有关性状
萦云英推 . 菌 :
7 6 5 3R
7 6 5 3 R+ l
7 e s 3 R+ l ( paR Z一 s )
碗豆帷 . 蔺 :
T 8 3K 3
T 8 3 K 3 ( PaR Z
一 5 )
策丘推 . 菌 :
3 62 2一 15
3 62 2一 15 ( PaR Z 15 )
质杜 :
p猫 2 1 5
PRK 2 0 13
PS A 30
玲生型 N o d+ Fi x +
7 6 5 3 R消除共生质拉突变株 N o d一 T。 『
N阅+ T。 r
本室收集
[ 7 ]
本工 作
在碗豆上能 结瘤圈 瓦 K m `
能在萦云英上结瘤 Km ` T。 `
[ 9 ]
本工作
在莱豆上能正常结瘤固反 k ln `
能在萦云英上 给瘤 k m ’ T。 r
〔 9 ]
本工作
,且Jó .月610二r
.L.J工es
PL A F R 一上 克隆有 2 5七b的萦云英根冶菌DN A 片段 (包括有。 do 、 h s n 、 。 i f等) T 。 ,
协助特移质拉 km `
pcA y
e 一s弓上 克隆肺炎氏杆菌的 n if H DK 基目
1
.
2 三泰本接合抽 . 方法
将根瘤菌受体接种于 s m l T Y培养液中 , 28 ℃振荡培养24 一36 小时 . 含 paR Z 15 质粒的 大
肠杆菌和含p RK ZO 13质粒的大肠杆菌分别接种于 s m l BL 中 ( 分别 含相应的四环素和卡 那 霉
素 ) , 3 7℃振荡培养 1 2小时 , 按 1/ 5的接种量转移到新鲜的BL 中 , 37 ℃继续振荡培养 2 一 3
小时 。 将三个培养好的菌株等比例混合后 , 用无菌 注射器注射到醋酸纤维素滤膜上 (小2 5m m ,
孔径为 。 . 45 卜m ) , 然后将膜置于已制备好的 T Y平皿上 , 28 ℃培养 16 一 24 小时 . 用无菌水洗下
菌苔 , 所 洗下 的菌悬液涂布到含四环素和卡那雄素 (需要时加 )的 SM 培养基上 , 。 . 2 m l/ 皿 ,
里 2 8℃培养 3一 5 天 . 供体和受体菌在该培养基上均不能生长 , 只有杂交子才能生 长 . 从平
皿上分别挑取 10 个单菌落 , 混合在一起接种紫云英植株 .
1
.
3 续云英结 . 试脸
按常规方法进行紫云英种子表面灭菌 、 催芽 , 并将种芽转移到含无氮植物营养液的砂土
管中 , 置光照室培养 3 一 4 天后接种根瘤菌菌悬液 , 继续培养 30 天左右观察结果 。 其培养基
配方和培养条件见文献 [ . J .
,
.
4 有关砚目的洲定方法和杂交方法
根瘤菌质粒检测按 H ir cs h法 [` “ ]进行 .
D N A操作及分子原位杂交 . 在大肠杆菌中质粒 DN A的制备按 iB r n卜io n法 t ’ 3 ]进行 . 限 制
性内切酶消化反应按 N e w E gn l a dn iB ol a玩所示条件进行 . 各种酶类均购良华美生物 工 程 公
司 。
D N Awe D N A膜杂交按 Sou t h e nr t“ J的方法 , 采用缺 口翻译法标记克隆有肺炎 克 氏 杆 菌
爪厂H D K 基因的 SP A ” o作为探针 . a 一 ’ ` P一dC T P为北京福瑞同位素公司的产品 .
4期 张忠明等 :紫云英根瘤菌寄主专性结瘤基因和固氮基因的鉴定
根瘤的固氮酶活测定 .剪取鲜瘤置于 15 m l小瓶中 , 加盖橡皮塞 , 注 入 2 m l 乙 炔 , 置
2 8 ℃下 2 小时 , 用气相色谱测定乙炔还原能力 .
2 结果
2
.
1 三亲交配及 pRa Z 15 质拉的转移
克隆有紫云英根瘤菌结瘤基因的 p R a Z 15 质粒 , 在协助转移质粒 p RK 20 1 3的作用下 , 分别
与豌豆根瘤菌T 83 K 3 、 菜豆根瘤菌 3 6 2 2一 1 5和不结瘤紫云英根瘤菌突变株 7 65 3R + 1 进行 三
亲交配 , 在含有四环素的SM培养基上选择杂交子并计算其转移频率 , 结果见表 2 .
表 2 p RaZ 1 5向不同根瘤菌中转移 的倾率
供 体 受 体
pR a Z 15 (H B一0 1 )
T 8 3K 3
3 6 2 2一 1 5
7 6 5 3 R+ l
转移 孩牟
3
.
14 X 10一 今
9
.
8 9 X 10一 3
4
.
8 7 x l 0一 3
2
.
2 搜云英结 . 试骏一一寄主专性结启基因 ( hs 。 ) 的鉴定
本试验从 3 个杂交组合中分别挑取 10 个杂交子混合接种紫云英植株 , 置光照室 ( 光照 12
小时 , 黑暗 12小时 ) 培养 1 个月后 , ’已们都能结瘤 , 结果见表 3 和图版 。
表 3 不 同杂交子在紫云英上的 结瘤试验
供试 菌林
T o
3K 3 ( P R
a Z一5 )
T
o 3K ,
3 6 2 2一 盆5 ( p R a Z 一5 )
3 6 2 2一 16
7 6 5 3 R+ l ( PR a Z 1 5 )
7 6 5 3 R+ 1
7 6 5 3 R
e
k (空白 )
培养基
S M + K m + T e
S M + K m
S M+ K m + T e
SM+ K m
SM + T e
SM
SM
结瘩状况 (荣云英 )
紫云 英植林均生长在砂培管中 .
由表 3 和图版可知 , 豌豆根瘤菌 、 菜豆根瘤菌与紫云英不属于同一互接种族 , 因此这两
种根瘤菌在紫云英上不能结瘤 , 而将 p R a Z 15 质粒转移到这两种根瘤菌后 , 它们在紫云英上表
现出结瘤能力 。 说明了重组质粒 p R aZ 15 上克隆有识别紫云英植株 的 寄 主 专 性 结 瘤 基 因
( h
s 。
)
.
2
.
3 pR a Z 15 质较上固氮醉基因的鉴 定
制备和纯化 p R a Z 15 质粒 D N A , 分别用限制性内切 酶 E co R I和 S al l消化 , 走琼脂糖凝 胶 电
泳 , 结果见图 1 ( 左 ) . 并将其转移到硝酸纤维膜上 , 用 a一 “ Z p一 dC I , P标记克隆有肺 炎 克
氏杆菌 :n’ f H D K基因的 p SA 3。 , 以此作为探针 D N A , 与 _ L述制备的膜作 D N A一D N A分子原位 杂
交 , 结果见图 l ( 右 ) . 除载休 p L A F R I带上有显影外 , 在另外的三条片段上 也有显 影 . 说
明耐 f H D K基因存在于该质粒上 。 同时将 p R a Z 15 质粒转移到 7 6 5 3 R+ l 菌株中 , 通过前述 的 植
枷 ` 华 中 农 业 大 学 学 报 白卷
, . . 曰甲 . . . . . . . ~ ~ . .
物试脸 , 取鲜瘤通过 乙炔还原法测定固氮酶活 , 结果表明 ( 表 4 ) , 供试菌株均具有乙炔还
派活性 。
图 1 S o ut h e rn 法分子滤膜杂交的放射
自显影图
用 3 2 P标记克隆有肺炙充氏杆蔺。 if HD K巷因
的 p SA 3 o D N A . 与经 5 0 江 th e r。 法特移周定在峭咬
纤 维素游膜上的 D N人进行杂交 , 得到的救针 白盆
影田 (右 )和用。 . 7肠球脂怡电泳 田语 (左 ) . 其中 :
A
,
P SA 3 o质杜D N A : B , PaR Z z s质杜D N A :
C
,
PaR Z一卜S a ll , D , PaR Z 一5一e OR I :
E
, 入DN人4阮OR I
表 4 紫云英一 7 6 5 sR + l ( pR a Z 1 5 ) 共生根瘤固氮酶活 浏定
0
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2013韶28功5/sR! l
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2 4
。
7
12
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. 获1 1… … , R I 1 0供试蔺均为 PRa Z l s朴移到消除共生质杜的 7 e s s R+ l 突究林中的杂文于 . 7 e 5 3 R为开生里菌林 。
. ’ 脚几峥活都很低是 因生长条件有限 , 植林生长在砂土甘中 , 根奋屯枉小 .
3 讨论
PR aZ 15 质粒进入豌豆和菜豆根瘤菌能够使它们在紫云英植株上结瘤 . 这 一 结 果 说 明
了 皿召 15 上 含有识别紫云英植物的寄主专性结 瘤基 因 ( hs n ) ; 同时说明了克隆的紫 云 英
脚 荃因能够在豌豆和菜豆根瘤菌中表达 , 从而增加 了它们的寄主范 围 . 关 于 这 一 点 ,
L加扩 ’ . 注曾提出不是所有的根瘤菌获得另一种根瘤菌的共生质粒或克隆的共生基因后都能在
4期 张忠明等 :紫云英根瘤菌寄主专性结瘤基因和固氮基因的鉴定 2恋白
勿 新的寄主上结瘤 。 如首着根瘤菌在接受了三叶草根瘤菌的共生质粒或共生基因后 , 仍只能在
首蓓上结瘤 , 而不能在三叶草上结瘤 。 p aR Z 1 5能在其它根瘤菌中表达 , 为我们利用紫云英根
瘤菌共生基因来改造其它根瘤菌的寄主范围 、 结瘤和固氮效应提供了可能 .
p R a Z 15 质粒能够恢复消除了共生质粒而不能在紫云英上结瘤的突变株 7 6 5 3 R+ l 的结 瘤
和固氮 的能力 。 本文通过分子杂交试验也证明了 in f H D K基 因存在于这个克隆质粒上 , 这一结
果表明紫云英根瘤菌的结瘤基因和固氮酶结构基因是紧密连锁的 . 同时根瘤的固氮酶活测定
表明 , 该质粒上也可能含有与固氮有关的 ij x 基 因 。 在其它快生型根瘤 菌 中 , 有 许 多 报
道 [ ` 。 一 ’ 。 ] 虽都指出克隆的根瘤 结瘤基 因簇能恢复消除共生质 粒突变株的结瘤功能 , 并含有
in f 基 因 , 但没有说明有固氮酶活性 . 而 紫云英根瘤菌共生基因 ( 包括 hs n 、 n od 、 瓜 f 、 il 二 )
聚在一条 25 kb 片段上 , 它具有决定紫云英根瘤菌寄主专性 、 结瘤和固氮的功能 . 这样 , 为我
们在整休功能上对紫云英根瘤菌共生基因分析和进一步的遗传操作提供了极大的方便 .
参考文献
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a g e n e b a n k o f Rh i z o b i . 口 m e l il o t i . p r oc . o a t l . A ca d . cS i . U S A , 一。5 0 ; 7 7 : 7 3 4 7一 7 3 5 -
。 门 以 n o n , F . C . e t 争1 . 0 ; e r la p p i n g eS q u e n e e s o f K l e b s ie l la p n e u m o n ia e u i f DN A e lo n e d a n b C h a r a e t e r i , e d .
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[ 一2 ] H ir cs h , P
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[ 1一] S o u th e r n , E
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[ 一5 ] L o n g , 5 . R . , G e n e t i。 A d v a n e e , s n T li e S t u d y o f Rh i z o bi u m N o d u l a t so n . eG n e t i o E n g i n e r i n g
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: 13 5一 1 5 0
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[ 16 ] L肠 , n i e , J . A . e t a l . C 一o o i n ` 。 f th e s y m b io t i c r e g i o 。 o f Rh i z o b i u m le g u m i n o s a r u m : t h e n o d u la t i o n g e n e ,
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￡ i n i c u s
.
B o t h t r a n s e o n j u g a n t s w e r e f o u n d t o n o d u l a t e 理 , s i n i c u s . T h e e x p e r im e n t s
p r o v e t h a t t h e PR a Z 1 5 e o n t a i n s t h e h s n g e n e s s p e e i f i e t o A
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s i n i c u s n o du l a t i o n
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7 6 5 3R + 1 a n d u s e d t o i n o e u la t e A
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s i n i e u s
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N o du l e s w e r e f o r m e d a n d i t s n i t r o g e n a s e
a e t i v i t i e s w e r e d e t e e t e d b y t h e a e e t y l e n e 一 r e d u e t i o n m e t h o d
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张忠明子 :紫云英恨瘤菌寄主专性结 瘤基 因和固氮基因的鉴定
日版
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