全 文 ：三波长-分光光度法测定黑沙蒿中的总黄酮
李明静1 , 张　卫1 , 赵东保1 , 2 , 刘绣华 1
(1.河南大学化学化工学院 , 开封 475001;2.济源职业技术学院 , 济源 454650)
摘　要:以野樱素为对照品 、AlCl3 作显色剂 , 建立了三波长-分光光度法测定
黑沙蒿中主要化学成分黄酮类化合物的方法。该方法可校正混浊背景倾斜度的
影响 , 并能消除重叠吸收曲线的干扰。方法的线性范围为 1.12 ～ 13.44 μg mL ,
相关系数 r=0.9999 , 适用于植物中总黄酮的测定 。
关键词:黑沙蒿;总黄酮;三波长-分光光度法
中图分类号:O657.3　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-0720(2007)03-099-04
　　黑沙蒿(Artemisia ordosica Kraschen)为菊科蒿属
植物 , 原产于内蒙古 、河北和山西的北部 , 现陕
西 、宁夏 、甘肃和新疆有引种。生于戈壁 、荒漠或
草原中 , 有较强固沙作用 , 是优良饲料。其全草可
入药 , 常用于消炎散肿 、宽胸利气 、杀虫和止血 ,
可治疗风湿性关节炎 、腮腺炎 、 疥疮红肿等疾
病[ 1] 。在黑沙蒿的化学成分中主要含黄酮类化合
物 , 其中以野樱素 、异野樱素 、圣草素-7-甲醚 、
5 , 7 , 2′, 4′-四羟基-6 ,5′-二甲氧基黄酮等[ 2] 为主 。
目前评价和监测天然药用植物中黄酮化合物 , 主
要是利用黄酮化合物与 Al3+形成络合物的性质 ,
采用分光光度法测定 , 且多以芦丁为对照品 , 采
用Al(NO3)3 -NaNO2-NaOH[ 3 , 4] 显色后在 500 nm
处测定 。鉴于有关黑沙蒿中总黄酮量的测定方法
尚未见报道 , 同时也为了更好地开发和利用其植
物资源 , 本文以野樱素为对照品 , 加入AlCl3 使黄
酮化合物与Al3+形成稳定络合物 , 采用三波长分
光光度法对其总黄酮进行测定。并采用制备薄层
将干扰组分分离 , 然后在紫外区扫描 , 根据总黄
酮和干扰组分的紫外吸收光谱 , 确定三波长 , 测
定黑沙蒿中总黄酮量。该方法可校正混浊背景倾
斜度的影响 , 简便 、准确 、灵敏 、可靠 。
1　三波长-分光光度法的基本原理
三波长-分光光度法的基本原理[ 5] 如图 1所
示。在一吸收光谱曲线上 , 可以适当选择 3个波
长 , 分别测定其吸光度值 , 计算 ΔA值
图 1　三波长-分光光度法基本原理
Fig.1　Principle of three wavelength spectrophotometry
ΔA=A2 -(N λ2 +MN)=A2 -(mA3 +nA1)/
(m +n)=A2 -[(λ2 -λ3)A1 +(λ1 -λ2)A3 ] /
(λ1-λ3)={ελ
2
-[ (λ2 -λ3)ελ
1
+(λ1 -λ2)ελ
3
] /
(λ1-λ3)}bc
式中:ε-待测组分在各波长处的摩尔吸光系数;
b-光程;c-待测组分的浓度。
由上式可知 , ΔA 值与待测组分的浓度成正
比 , 可以用于待测组分的测定。从图1又知 , 如果
在所选择的 3 个波长处 , 若其相应的吸收光谱曲
线上的三点在一条直线上 , 则测得的 ΔA 值为零 。
当干扰成分产生的吸收光谱为一条直线时 , 则按
上述方法选择 3个测定波长 , 得到的 ΔA值与干扰
—99—
第 26 卷第 3期
2007 年 3月 　　　　　　　　　　　　 分析试验室Chinese Journal of Analy sis Laboratory　　　　　　　　　　　　Vol.26.No.32007-3
收稿日期:2006-04-27;修订日期:2006-08-30
作者简介:李明静(1963-), 女 , 副教授
DOI :10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2007.0083
成分的浓度无关。因此 , 通过选择适当的测定波
长可以有效地消除干扰组分给定量分析造成的影
响 , 从而提高定量分析的准确度 。
2　实验部分
2.1　仪器和试剂
UV-250分光光度仪(日本岛津公司)。AlCl3 、
石油醚 、乙醇 、甲醇等均为 AR 级。野樱素对照
品:从黑沙蒿中分离得到 , 结构通过 UV 、IR 、NMR
谱学方法鉴定 , 纯度经HPLC 面积归一化法测定大
于99%, 可作定量之用。药材黑沙蒿(采自新疆沙
漠植物园):由中国科学院西北高原生物研究所索
有瑞研究员鉴定为 Artemisia ordosica Kraschen 全
草。
2.2　实验方法
2.2.1　样品处理　将清洗过的黑沙蒿晾干 , 粉碎
过孔径为 0.246 mm 筛 , 干燥至恒重。准确称取
3.0000 g , 置于索氏提取器中 , 先用100 mL的石油
醚脱脂 (各自平行 5份), 在 80 ℃下回流 6 h。残
渣再加入 100 mL 95%的乙醇提取 8 h (温度维持
85 ℃), 过滤 , 滤液减压浓缩至干 。用甲醇溶解 ,
定容至100 mL 容量瓶中 , 为供试液。
2.2.2　样品测定　准确吸取样品供试液 1 mL , 稀
释至 10mL。再准确吸取0.5 mL , 加入10 g L AlCl3
0.5mL , 稀释至 10mL。摇匀 , 放置 30 min , 以甲醇
为参比 , 在波长 310 , 340 , 250 nm 处测量吸光度 。
3　结果与讨论
3.1　对照品选择
鉴于芦丁的紫外吸收光谱与供试品的紫外吸
收光谱差异较大 , 不能反映黑沙蒿总黄酮的量 。
根据供试品的紫外吸收光谱 , 选择 290 nm 为检测
波长 , 用HPLC测定 , 以乙腈∶1.2%冰乙酸为流动
相 , 梯度洗脱 。结果发现野樱素 、异野樱素和圣草
素-7-甲醚 3 种二氢黄酮为黑沙蒿的主要化学成
分。从图 2可知 , 3种二氢黄酮的紫外吸收光谱基
本相同 , 且与供试品的紫外吸收光谱相似 , 均可
作为对照品测定黑沙蒿总黄酮。实验选用野樱素
作为对照品。
3.2　测定波长的确定
由于黑沙蒿中的主要化学成分二氢黄酮类化
合物的最大紫外吸收波长为 290 nm , 而在此波长
处 , 提取液中的其他干扰组分也有一定的吸收
(图 3)。若直接采用单波长分光光度法测定总黄酮
的量 , 则所含干扰组分必定影响测定 , 造成测定
结果误差较大[ 6] 。
图 2　络合前对照品和供试品紫外吸收光谱
Fig.2　UV absorption spectra before complexing
1-野樱素;2-异野樱素;3-圣草素-7-甲醚;4-供试品
图 3　加入 10 g L AlCl3 络合后对照品和供试品紫外吸收
光谱
Fig.3　UV absorption spectra after complexing
1-野樱素对照品;2-供试品;3-干扰组分
根据HPLC分析结果并结合分离情况 , 将适量
供试品溶液点与硅胶薄层板上 , 以 CHCl3∶CH3OH∶
冰乙酸=8∶1∶0.1为展开剂展开 , 在紫外灯下观
察 , 刮下暗色带 , 用乙醇洗脱 , 蒸干 , 用甲醇溶
解 , 为干扰组分的储备液 。根据三波长分光光度
法原理 , 参照文献[ 7, 8] , 用作图法确定出 3个测定
波长 310 , 340 , 250 nm 。在这 3个波长处 , 野樱素
的 ΔA 值较大 , 而干扰组分在所选择的 3 个波长
处 , 其相应的吸收光谱上 3点近似在一条直线上 。
则此时测得的 ΔA 值与干扰组分的浓度无关。因
此 , 采用三波长分光光度法可有效消除干扰组分
对总黄酮测定的影响。
3.3　显色剂的用量
准确吸取对照品 1.00 mL 和供试品 1.00 mL ,—100—
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分别置于 10 mL 容量瓶中 , 各准确加入 10 g L
AlCl3(甲醇)0.10 , 0.20 , 0.50 , 1.00 , 2.00 mL , 分
别用甲醇定容 , 摇匀 , 室温放置 30 min , 在 310 nm
处测量吸光度。结果表明 , 10 g L AlCl3的用量在
0.10 ～ 2.00 mL 范围内不影响测定结果。故显色剂
的用量定为 1.0 mL。
3.4　显色稳定性
由图 4可知 , 显色后黄酮-铝复合物在 25 min
至2 h 内稳定 , 故测定时间选择在显色后 30 min
测定 。
图 4　络合物时间稳定曲线
Fig.4　ΔA-time relation curve
3.5　标准曲线的绘制
准确称取野樱素 11.2 mg , 溶于 100 mL 容量
瓶中 , 用甲醇定容 , 配成浓度 0.112 mg mL的溶液
为对照品溶液 , 待用。
准确吸取对照品溶液0.20 , 0.30 , 0.40 , 0.50 ,
0.60 , 0.80 mL , 加入 10 g L AlCl3溶液 , 定容至 10
mL 容量瓶中 , 分别在波长 250 , 310 , 340 nm 处测
量其吸光度并计算出 ΔA 值 。以(ρ)表示溶液质量
浓度 , 以(A)表示吸光度 , 得线性方程为:ρ=
-2.511×10-5+1.228×10-2 A , r=0.9999。
对照品浓度在 1.12 ～ 13.44μg mL 范围内符合
朗伯 —比耳定律 。
3.6　回收率试验
准确称取黑沙蒿样品5份 , 每份1.500 0 g , 分
别加入准确称取的野樱素 30 mg 。按“2.2.1样品处
理”方法制备 , 计算回收率。结果见表1。
表 1　回收率实验
Tab.1　Recovery test(n=5)
No
已知量
m mg
加入量
m mg
实测量
m mg
回收率
%
平均
回收率 %
RSD
%
1 27.4 30.0 28.4 94.7
2 27.4 30.0 28.6 95.3
3 27.4 30.0 29.0 96.7 97.3 3.1
4 27.4 30.0 29.5 98.3
5 27.4 30.0 30.7 102.3
3.7　精密度
取供试品溶液 1.0 mL , 置于 10 mL 容量瓶中 ,
对同一供试品溶液重复测定 5 次 , 结果吸光度
RSD=0.35%。
3.8　样品测定
取5 批黑沙蒿供试品按“2.2.1样品处理”方
法制备供试品溶液 , 在波长 310 , 340 , 250 nm测定
吸收度 , 按三波长分光光度法计算 ΔA , 依标准曲
线方程计算总黄酮质量分数为:1.89%, 1.84%,
1.87%, 1.80%, 1.77%。平均值为1.83%, RSD=
2.4%。
3.9　讨论
采用三波长分光光度法测得黑沙蒿的总黄酮
量为 1.83%, 若加入 Al3+络合后直接在 310 nm处
采用单波长分光光度法测定 , 总黄酮量为 4.89%。
通过文献对比[ 9] , 我们认为是干扰组分的背景吸
收导致了测定结果偏大 , 三波长分光光度法测定
的结果较为准确可靠。
在黑沙蒿中也同时分离得到了黄酮化合物 ,
但其不是主要成分 , 如 5 , 7 , 2′, 4′-四羟基-6 , 5′-
二甲氧基黄酮 、蓟黄素等 。该类黄酮化合物的紫
外吸收光谱图中包括 220 ～ 280 nm的吸收带 Ⅱ和
300 ～ 400 nm的吸收带 Ⅰ 。加入 AlCl3 后吸收带 Ⅱ
红移后 , 也位于所选的三波长内 , 且波形也大致
相似 , 这是由于它们的生色团都是苯甲酰基的缘
故。故三波长分光光度法在所选择的波长范围内 ,
能够准确测定黄酮类化合物的量 。
因此 , 三波长分光光度法可校正混浊背景倾
斜度的影响 , 并能消除重叠吸收曲线的干扰 , 可
用于植物中总黄酮量测定。
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Determination of the contents of total flavonoids in Artemisia ordosica by three wavelength spectrophotometry
LI Ming-jing1 , ZHANG Wei 1 , ZHAO Dong-bao1 , 2 and LIU Xiu-hua＊1(1.College of Chemistry and Chemical Engi-
neer , Henan University , Kaifeng 475001;2.Jiyuan Vocational and Technical College , Jiyuan 454650), Fenxi Shiy-
anshi , 2007 , 26(3):99 ～ 102
Abstract:A three wavelength spectrophotometry for the determination of the contents of total flavonoids in Artemisia
ordosica Kraschen was studied by using sakuranetin as standard and aluminum trichloride as colorimetric reagent.By
selecting the three wavelengths appropriately , the absorbance of interferent components can be corrected efficiently.Its
linear range was 1.12 ～ 13.44μg mL and the recovery was 97.3%(RSD=3.1%).The method is feasible for the
determination of the contents of total flavonoids in plants.
Keywords:Artemisia ordosica Kraschen;Total flavonoids;Three wavelength spectrophotometry
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