全 文 ：成都中医药大学学报
JournalofChengduUniversityofTCM
2009年 9月第 32卷第 3期
Sep.2009, Vol.32, No.3
中药研究
印楝叶总黄酮的提取工艺研究及含量测定
范刚　杜娟　尹鸿翔　张艺
(成都中医药大学民族医药学院 , 四川 成都 611137)
　　摘　要:目的:优选印楝叶总黄酮的提取工艺条件 , 并建立总黄酮的含量测定方法 。方法:通过正交
试验 , 考察溶剂浓度 、回流时间和回流次数对提取工艺的影响。采用分光光度法 , 以芦丁为对照品 , 在波
长 500nm处测定药材总黄酮含量 。结果:最佳提取条件为 80 %的乙醇 , 回流提取 3次 , 每次 1 h。总黄
酮在 0.020 ～ 0.080mg/mL范围内线性关系良好 (R=0.9992), 平均加样回收率为 96.67%, RSD为 0.96
%。结论:优选出的最佳工艺条件经验证其结果稳定;总黄酮含量测定方法简便 、 快速 、稳定 , 可用于测
定印楝叶中总黄酮的含量 。
关键词:印楝叶;总黄酮;提取工艺;含量测定
中图分类号:R284.2　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1004-0668 (2009)03-0074-04
基金项目:四川省教育厅重大培育项目 (项目编号:07ZZ006)
作者简介:范刚 , 男 , 1983年生 , 硕士研究生;通讯作者:张艺 , 男 , 1963年生 , 教授 , 研究方向:中药及民族药药效物
质基础研究。
ExtractionTechniqueandContentDeterminationofTotalFlavonoids
FromtheLeavesofAzadirachtaindica
FANGang　DUJuan　YINHong-xiang　etal
(CollegeofEthnicMedicine, ChengduUniversityofTCM, Chengdu611137, China)
Abstract:Objective:Tooptimizeextractiontechniqueoftotalflavonoidsandestablishamethodformeasuringthecontentsof
totalflavonoidsintheleavesofAzadirachtaindica.Methods:TheoptimumprocesswasinvestigatedbyL9 (34)orthogonalde-
sign.ThecontentsoftotalflavonoidsintheleavesofAzadirachtaindicaweremeasuredusingspectrophotometrywithadetectionwave-
lengthof500nm, borrowingtheRutinasacontrast.Results:Theoptimumtechnicalcondition:80% ethanol, refluxingandextrac-
tingfor3times, onehoureachtime.Thelinearrangewasbetween0.020 ～ 0.080mg/mL(R=0.9992)andtheaveragerecoverywas
96.67% withcorrespondingRSDof0.96%.Conclusion:Theoptimumextractiontechnologyoftotalflavonoidsisstable.Themethod
fordeterminationissimple, rapidandissuitablefordeterminationoftotalflavonoidsintheleavesofAzadirachtaindicant.
Keywords:TheleavesofAzadirachtaindica;Totalflavonoids;Extractingtechnology;Contentdetermination
　　印楝 (AzadirachtaindicaA.Juss)为楝科楝属
植物 , 原产于印 -巴次大陆及南亚和东南亚的干旱
地区。印楝作为一种多用途的传统药用植物 , 已有
2000多年的使用历史 , 在印度阿育吠陀医学和尤
那尼医学中都有广泛的应用 , 有 “乡村药房 ” 、
“天然药库” 之美称。现代研究表明 , 印楝具有杀
虫 、 抗菌 、抗病毒 、抗生育 、 免疫调节 、 抗氧化 、
保肝和降血糖等多种药理活性 [ 1-2] 。
从印楝叶中分离和鉴定出来的黄酮类化合物主
要有芦丁 (rutin)、 山奈酚 (kaempferol)、 槲皮素
(quercetin)、槲皮苷 (quercitrin)、金丝桃苷 (hy-
peroside)等 [ 1-5] 。国外研究表明 , 这些黄酮类成分
·74·
DOI :10.13593/j.cnki.51-1501/r.2009.03.026
第 3期 范刚等　印楝叶总黄酮的提取工艺研究及含量测定　
具有明显的免疫调节 、降低血糖 、抗菌和抗病毒等
作用[ 6-9] 。目前 , 国内还没有关于印楝黄酮类成分
提取工艺及含量测定研究的相关报道 。我们通过正
交试验 , 对提取工艺的主要影响因素: “溶剂浓
度 、提取时间 、 提取次数 ” 进行系统的考察 , 优
选出最佳提取条件。并根据所优选的条件 , 采用分
光光度法测定印楝叶中总黄酮的含量 , 为印楝叶药
材提供一种质量控制方法 , 也为今后印楝资源的开
发利用提供科学依据 。
1　仪器与材料
Spectrumlab22PC分光光度计 (上海棱光技术
有限公司);AS10200超声波清洗器 (天津奥特赛
斯仪器有限公司);Sartorius电子天平 (北京赛多
利斯仪器系统有限公司);W201恒温水浴锅 (上
海申顺生物科技有限公司)。芦丁对照品 (中国药
品生物制品检定所 , 批号为 100080-200707 ), 其
他试剂均为分析纯。印楝叶均采自四川省攀枝花市
拉鲊村印楝种植基地 , 经攀枝花市干热河谷应用生
态研究中心解培惠教授鉴定均为印楝 Azadirachta
indicaA.Juss的叶子。
2　实验方法与结果
2.1　对照品溶液的制备
精密称取芦丁对照品 10mg, 置于 50 mL量瓶
中 , 用甲醇溶解 , 定容 , 摇匀 , 即得 (每 1mL中
含芦丁 0.2mg)。
2.2　测定波长的选择
以 5 %亚硝酸钠 、 10 %硝酸铝和 4 %氢氧化
钠为显色剂 , 分别作各供试品溶液及芦丁对照品溶
液的吸收曲线 , 其均在 500nm波长处有最大吸收 ,
故选择 500nm为测定波长。
2.3　标准曲线的绘制
精密量取芦丁标准溶液 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、
3.0、 4.0 mL于 6只 10 mL容量瓶中 , 分别加入甲
醇溶液至 5.0mL, 加入 5%亚硝酸钠溶液 0.3mL,
摇匀 , 放置 6 min, 再加入 10 %硝酸铝溶液 0.3
mL, 摇匀 , 放置 6 min, 最后加入 4 %氢氧化钠溶
液 3.0 mL, 用甲醇定容至 10.0 mL, 摇匀 , 放置
15 min。以相应试剂为空白 , 在 500 nm波长处测
定吸光度。以吸光度 A为纵坐标 , 浓度 C为横坐
标 , 进行线性回归 , 得芦丁线性回归方程为:A=
9.9586C+0.0456 (r=0.9992), 线性范围为
0.020 ～ 0.080 mg/mL。
2.4　印楝叶总黄酮提取工艺研究
2.4.1　提取方法考察
称取印楝叶药材粉末 5.0 g, 置 150mL圆底烧
瓶中 , 加 95 %乙醇 100 mL, 分别以不同的提取方
法提取 (回流提取两次 , 每次 1 h;超声提取 40
min;冷浸法提取浸泡 24 h;索氏提取至提取液无
色), 提取液滤过 , 蒸干 , 残渣用 50mL热水溶解 ,
用等量的石油醚溶液萃取 3次 , 弃去石油醚液 , 水
溶液至蒸发皿中蒸干 , 残渣用甲醇溶解并转移至
100 mL容量瓶中 , 甲醇定容至刻度 , 摇匀 , 作为供
试品溶液。精密吸取供试品溶液 1.0mL于 10 mL量
瓶中 , 再按 “2.3” 项下方法操作 , 显色后测定含
量 , 每种提取方法各重复一次 , 结果见表 1。
表 1　不同提取方法的比较 (n=2)
提取方法 超声法 回流法 索氏提取 冷浸法
总黄酮含量 (%) 0.677 1.231 1.157 0.416
　　结果表明 , 回流法提取总黄酮含量最高 , 故确
定提取方法为水浴回流提取。
2.4.2　正交设计优化提取工艺
2.4.2.1　因素与水平
为优化回流提取工艺 , 选择乙醇浓度 、 提取时
间和提取次数 3个因素 , 每个因素选择 3个水平 ,
编制因素水平表 , 见表 2。
表 2　因素水平表
水平 乙醇浓度 (%)A
提取时间 (h)
B
提取次数 (次)
C
1 65 1 1
2 80 1.5 2
3 95 2 3
　　回流提取温度均为 80℃, 料液比均为 1∶ 20
2.4.2.2　实验与结果
称取印楝叶药材粉末 5.0g, 以 L9 (34)正交表
设计方案进行实验 , 按 “2.3” 项下显色方法操作 ,
以总黄酮含量为指标进行分析 , 结果见表 3, 方差分
析见表 4。由表 3和表 4可知 , 因素 A、 B、 C对印楝
叶中总黄酮提取的影响程度不同 , 各因素的影响程度
依次为 A>C>B, 其中乙醇浓度对提取工艺有显著的
影响 , 而提取时间和提取次数影响不大。本实验所得
印楝叶中总黄酮回流提取的最佳工艺条件为 A2B1C3 ,
即 80%乙醇回流提取 3次 , 每次 1h。
表 3　正交试验结果
试验号 A B C D 总黄酮含量 (%)
1 1 1 1 1 0.876
2 1 2 2 2 0.977
3 1 3 3 3 0.954
4 2 1 2 3 1.421
5 2 2 3 1 1.499
6 2 3 1 2 1.243
7 3 1 3 2 1.262
8 3 2 1 3 1.065
9 3 3 2 1 1.219
K1 0.936 1.186 1.061 1.198
K2 1.388 1.180 1.206 1.161
K3 1.182 1.139 1.238 1.147
R 0.452 0.047 0.177 0.051
·75·
成都中医药大学学报 2009年第 32卷
2.4.2.3　验证实验
按优选的最佳工艺条件制备 3份样品 , 按
“ 2.3” 和 “2.5” 项下方法操作 , 显色后测定总黄
酮含量 , 结果 3 份样品 总黄酮平均含量为
1.415%, RSD为 2.34%, 表明优选的提取工艺条
件有较好的重复性。
表 4　方差分析结果
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F值 P值
A 0.307 2 0.154 72.732 <0.05
B 0.004 2 0.002 0.957
C 0.053 2 0.027 12.599
D(误差) 0.004 2 0.002
　　F0.05 (2, 2)=19.00
2.5　供试品溶液的制备
称取印楝叶药材粉末 5.0 g, 水浴条件下
(80℃)以 100 mL80%乙醇为溶剂回流提取 3次 ,
每次 1 h, 合并滤液 , 蒸干 , 残渣用 50 mL热水溶
解 , 用等量的石油醚溶液萃取 3次 , 弃去石油醚液 ,
水溶液至蒸发皿中蒸干 , 残渣用甲醇溶解并转移至
100mL容量瓶中 , 甲醇定容 , 摇匀 , 作为供试品溶
液。
2.6　方法学考察
2.6.1　精密度试验
精密吸取对照品溶液 2.0 mL及同一份供试品
溶液 1.0 mL于 2只 10 mL容量瓶中 , 再按 “2.3”
项下方法操作 , 显色后测定吸光度 , 分别重复测定
6次 , 结果供试品溶液和对照品溶液的 RSD分别为
0.35%和 0.47 %, 表明精密度良好。
2.6.2　稳定性试验
精密吸取 1.0mL供试品溶液于 10mL量瓶中 ,
再按 “2.3” 项下方法操作 , 分别于显色后 0、 10、
20、 30、 40、 50min在 500nm波长处测定吸光度 ,
结果 50min内测得吸光度的 RSD为 1.65%, 表明
供试品溶液与显色剂形成的络合物在 50 min内相
对稳定 , 故应在显色后 50min内进行测定。
2.6.3　重复性试验
取印楝叶药材 6份 , 每份 5.0g, 精密称定 , 按
供试品溶液制备方法制得供试品溶液 , 再按 “2.3”
项下方法操作 , 显色后测定吸光度 , 计算含量 , 结
果其 RSD为 1.79 %, 表明本方法重现性较好。
2.6.4　回收率试验
采用加样回收试验 , 取已知含量的印楝叶药材
粉末 6份 , 每份 1.0g, 精密称定 , 按对照品加入量
与供试品含量之比近似为 1∶1的比例加入对照品 ,
按供试品溶液制备方法制备成供试品溶液 , 再按
“2.3” 项下方法操作 , 分别显色后测定吸光度值 ,
计算回收率 , 结果见表 5。
表 5　回收率试验结果
称样
量 (g)
样品中总黄
酮含量 (mg)
芦丁加入
量 (mg)
测得量
(mg)
回收率
(%)
平均回
收率 (%)
RSD
(%)
1.0012 7.8795 7.8 15.3487 95.76
1.0043 7.9031 7.8 15.4371 96.59
1.0017 7.8832 7.8 15.5404 98.17 96.67 0.96
1.0023 7.8881 7.8 15.4837 97.38
1.0028 7.8924 7.8 15.3718 95.89
1.0031 7.8943 7.8 15.4033 96.27
2.7　不同种源印楝叶药材中总黄酮的含量测定
称取不同种源的印楝叶药材粉末 5.0 g, 按
“2.5” 项下方法制备供试品溶液 , 精密吸取供试
品溶液 1.0 mL于 10 mL量瓶中 , 再按 “ 2.3” 项
下方法操作 , 显色后在 500 nm处测定吸光度 , 根
据回归方程计算样品中总黄酮含量 , 结果见表 6。
表 6　不同种源印楝叶药材中总黄酮含量 (n=3)
No. 种源号 平均含量 (%) RSD(%)
1 缅甸 P11 1.259 2.58
2 缅甸 P10 0.934 1.71
3 缅甸 P12 0.848 2.25
4 缅甸 P1 0.814 2.49
5 缅甸 P2 0.653 1.99
6 缅甸 P3 0.779 2.17
7 缅甸 D6 1.415 1.06
8 缅甸 1014 1.073 1.44
9 缅甸 1015 1.187 0.93
10 缅甸 GM 0.628 2.12
11 缅甸 ML 1.044 1.53
12 1-11 0.938 1.60
13 澳大利亚 0.637 1.74
14 双胞 0.886 1.25
15 印度 0.658 2.82
3　讨论
印楝叶中含有较多的脂溶性杂质如叶绿素等 ,
使得供试品溶液颜色偏深并在 500 nm波长处有紫
外吸收 , 导致总黄酮含量测定结果偏高 。因此 , 本
实验在供试品溶液制备时用石油醚溶液多次萃取除
去脂溶性杂质 , 并在样品测定时以试样溶液为空
白 , 消除背景干扰 , 减少测定误差 。
正交试验结果表明 , 水浴回流提取对印楝叶总
黄酮提取的主要影响因素为乙醇浓度 , 其次是提取
次数 。当乙醇浓度为 80 %时 , 提取率最高;而提
取次数越多 , 提取越完全。另外研究发现 , 提取时
间以 1 h为最佳 , 提取时间越长 , 提取率反而有所
下降 , 这可能与长时间加热提取破坏了印楝叶中部
分黄酮类成分有关 。
实验结果表明 , 不同种源印楝叶药材中总黄酮
含量相差较大 , 其中缅甸 D6含量最高 , 达到
1.415 %;缅甸 GM含量最低 , 为 0.628 %。并且
来自缅甸的大部分种源 (特别是缅甸 D6和 P11种
源)总黄酮含量都高于澳大利亚和印度种源 , 这
(下转第 80页)　　
·76·
成都中医药大学学报 2009年第 32卷
依据。又如搜索蔷薇科蛇莓属植物蛇莓 (Duch-
esneaindica(Andr.)Focke), 可查询到由 5个学
校录入的 6份蛇莓标本的资料。这 6份标本中 , 有
的体现蛇莓花期的情况 , 有的体现果期的情况 , 还
有的花果同时存在 , 从而从各生长时期及各个不同
生长环境更好地体现蛇莓的生长发育情况 。
地理信息系统 (GIS)体系是一项综合和集成
的信息工程 [ 5] , 是由生物学家与信息和计算机科
学家将信息科学与计算科学相融会的合作结果 。通
过 GIS分布系统查询某植物的地理分布 , 足不离馆
即可迅速查询该植物在国内乃至国外的分布情况 ,
为植物资源考察提供了方便 、 快捷的查询方式 。
该系统的腊叶标本数据库目前已收录了来自全
国各参与高校的腊叶标本约 150万份 , 随着以后工
作的继续 , 数量仍会增加 。除了可以在线腊叶标本
的性状信息等资料外 , 还可实时显示所查标本的位
置与分布。
动物标本查询系统可以查询鸟类 、鱼类 、 哺乳
类 、两栖类和爬行类等动物的标本信息。
植物精细解剖在线查询分别对苔藓植物 、 蕨类
植物 、 裸子植物和被子植物进行查询 。在查询系统
中 , 可以观看植物精细解剖的图片 , 从而直观 、形
象地了解植物结构 , 领略植物微观世界的魅力 [ 2] 。
5　讨论
自 2006年 1月到 2008年 6月为止 , 我校已完
成近千种植物活体标本的采集 、 拍摄 、 分类鉴定 、
整理编号 、数字化录入等工序 , 这不仅大大丰富了
标本共享资源 , 同时也提高了参与人员植物分类鉴
定的能力 , 扩大了我校标本馆藏量 。
成都中医药大学植物活体标本数据库的建设有
利于长久的保存中药标本资源及信息 , 进一步提高
了标本馆的管理水平和提供社会共享的能力 , 加强
了标本馆在中医药的教学 、科研 、 科普宣传等各方
面的积极作用 , 有利于宣传四川省中草药资源优
势[ 5] , 为推动中医药行业的数值化和远程服务也
提供了良好的交流平台 。
参考文献
[ 1] 马波 , 陈放 .四川大学植物标本馆馆藏标本网络数据
库的构建 [ J] .四川大学学报 (自然科学版), 2001,
38 (6):839-843.
[ 2] 刘英楠 .我国科学数据库资源现状堪忧 [ J] .科学时
报 , 2005, (7):62.
[ 3] 国家自然科技资源平台———教学标本资源共享平台网
[ EB/OL] .htp://mnh.scu.edu.cn/main.asp, 2008-
06-02.
[ 4] 徐作英 , 戴佳朋 , 李维 .构建网络化植物标本管理系
统的研究 [ J] .生物学教学 , 2005, 30 (7):40-42.
[ 5] 况颐 , 周巍 , 马柯.GIS在药用植物资源调查中的应用
[ J] .信阳师范学院学报:自然科学版 , 2003, 16
(4).457-460.
[ 6] 素云 , 张训 , 张迎春 .四川省及重庆市药用植物标本
资源数据库简介 [ J] .重庆中草药研究 , 2005, (1):
41. (收稿日期: 2009-06-24)
　　 (上接第 76页)
可能是因为不同种源印楝自身遗传信息不同 , 遗传
分化和适应环境能力有所区别 , 从而影响黄酮类成
分在植物体内的合成 、转化 、 代谢等环节 。现代研
究表明 , 黄酮类化合物具有明显的抗溃疡 、 抗菌 、
抗肿瘤 、抗炎和降血脂等生物活性 , 印楝叶药材中
的总黄酮含量较高 , 具有一定的开发利用价值 。
参考文献
[ 1] R.Subapriya, S.Nagini.MedicinalPropertiesofNeem
Leaves:AReview[ J] .CurrMedChemAnti-CancerA-
gents, 2005, 5 (2):149-151.
[ 2] K.Biswas, I.Chatopadhyay, R.K.Banerjee, etal.Bio-
logicalactivitiesandmedicinalpropertiesofneem(Aza-
dirachtaindica) [ J] .CurrentScience, 2002, 82
(11):1337-1345.
[ 3] 尹锋 , 雷心心 , 楼凤昌 .印楝化学成分研究 [ J] .中
草药 , 2003, 34 (8):687-688.
[ 4] 尹锋, 雷心心, 成 亮 , 等 .印楝种子及叶的化学成分研
究 [ J] .中国药科大学学报 , 2005, 36 (1):10-12.
[ 5] 谭卫红 , 宋湛谦.印楝的化学成分及其生物活性 [ J] .
东北林业大学学报 , 2005, 33 (6):76-78.
[ 6] BaralR., ChatopadhyayU.Neem(Azadirachtaindica)leaf
mediatedimmuneactivationcausesprophylacticgrowthinhi-
bitionofmurineEhrlichcarcinomaandB16melanoma[ J]
.Immunopharmacol, 2004, 4:355-366.
[ 7] ChatopadhyayR.R., PoddarG.Phytochemicalscreeningof
Azadirachtaindicaleafextractasbloodsugarloweringagent
[ J] .PhytotherapyResearch, 1998, 67:373-376.
[ 8 ] Thakurta P, Bhowmik P, Mukherjee S, et
al.Antibacterial, antisecretoryandantihemorrhagicactiv-
ityofAzadirachtaindicausedtotreatcholeraanddiarrhea
inIndia[ J] .JournalofEthnopharmacology, 2007,
111:607-612.
[ 9] ParidaM.M, UpadhyayC, PandyaG, etal.Inhibitory
potentialofneem(AzadirachtaindicaJuss)leaveson
Denguevirustype-2 replication[ J] .JournalofEthno-
pharmacology, 2002, 79:273-278.
(收稿日期: 2009-06-28)
·80·