全 文 ：收稿日期:2005-02-23
作者简介:代西梅(1974-),女 ,河南郑州人 , 讲师 ,在读博士 , 主要从事生物技术及植物遗传育种研究。
山药零余子组织培养及培养过程中
过氧化物酶活性研究
代西梅 ,焦　浈
(郑州大学离子束生物工程省重点实验室 ,河南 郑州 450052)
摘要:对铁棍山药零余子进行离体培养 ,研究其在脱分化和再分化过程中过氧化物酶活性的变化。
结果表明 ,铁棍山药零余子形成愈伤组织的条件以暗培养 ,MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 2.0mg/L
培养基的效果较好;愈伤组织再分化成苗的条件以光培养 ,MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.5mg/L
培养基的效果为佳。铁棍山药零余子分化过程中过氧化物酶活性的变化与外部形态变化相关性较
强 ,可以作为分化过程中的标志酶 。
关键词:铁棍山药;零余子;组织培养;过氧化物酶
中图分类号:S632.1　Q943.1　文献标识码:A　文章编号:1004-3268(2005)07-0069-04
Studies on the Tissue Culture of Yams Bubil and the Peroxidase
Activity during Culture Process
DAI Xi-mei , JIAO Zhen
(Henan Provincial Key Laboratory of Ion Beam Bioengineering , Zhengzhou University , Zhengzhou 450052 , China)
Abstract:Studies on the tissue culture of bubil explants of iron stick yams and the changes of the per-
oxidase activity were during differentiat ion show ed that the eff iciency of forming calli w as better w ith
the hormone combination of MS+6-BA 2.0mg/L +NAA 2.0mg/L in dark conditions.The redif fer-
entiation efficiency of calli was better with hormone combination of 6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/ L in
light conditions.The changes of peroxidase activity during dif ferentiation of iron stick yams w ere inter-
ralated w ith outer morpholog ical changes.It can be regard as symbol enzyme during differentiation.
Key words:Iron stick yam;Bubil;Tissue culture;Peroxidase
　　薯蓣通称山药 ,是薯蓣科薯蓣属植物。薯蓣属
(Dioscorea L.)是广布于热带 、亚热带和温带的攀缘
性草本植物 ,全世界约 600种 。该属许多种类的地
下块茎在非洲 、大洋洲以至东南亚一些国家是重要
的粮食作物 。由于该属植物含有薯蓣皂甙元 ,可以
合成类固醇药物 、可的松类激素 、性激素 、口服避孕
药等 ,因此 ,又具有重要的药用价值与商业价值。由
于野生资源不能满足对其日益增长的需要 ,大规模
的人工培养势在必行 ,因此 ,该属植物的组织培养和
原生质体培养的研究工作越来越受到国内外学者的
关注。在山药的组织培养过程中 ,植物过氧化物酶
以其广泛存在和特殊的生物学意义而引起日益深入
的研究 。过氧化物酶的生物学功能十分广泛。有报
道指出:过氧化物酶系统在木质素与乙烯的生物合
成 、过氧化氢的形成 、类黄酮代谢 、生长素的氧化降
解 ,以及在抵抗微生物及其有毒物质等方面可能均
有重要作用[ 1 ～ 3] 。过氧化物酶的数量和相对浓度
因组织和发育阶段的差异而不同 。它在细胞生长的
不同时期以及在组织器官分化过程中也都表现出某
些特异性变化 。因此 ,尽管目前对过氧化物酶的生
理功能还认识不够 ,但根据其与植物生长发育及组
织分化之间所表现的比较稳定的关系 ,可以用它作
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2005年第 7期
DOI :10.15933/j.cnki.1004-3268.2005.07.024
为器官分化的指标之一。
1　材料与方法
1.1　试验材料
选用怀山药优良品种铁棍山药的零余子(株芽)
作试材。
1.2　试验设计
1.2.1　材料的消毒与接种　将零余子洗净 ,去皮 ,
自来水冲洗 10min ,然后再用蒸馏水清洗 3 ～ 5次 ,
转移到超净工作台上 ,用 70%乙醇消毒 30 s , 再用
0.1%HgCl2 浸泡 10min ,随后立即用无菌蒸馏水冲
洗 7 ～ 10次 ,彻底洗去附着在零余子上的消毒液 ,然
后用解剖刀将零余子外周接触消毒液的部分切去 ,
将剩下的部分切成长宽为 0.5 cm×0.5 cm ,厚 0.3
cm 左右的小块 ,分别接种在含有不同诱导培养基的
三角瓶内 ,诱导其脱分化形成愈伤组织 。
1.2.2　培养基及培养条件　基本培养基采用 MS
培养基 ,另外附加 2 ,4-D 、6-BA 、NAA等不同浓
度的植物激素。蔗糖浓度为 3%,琼脂为 7.5%,pH
值为 5.8 ,并在 121 ℃,1.1 kg/cm2的压力下灭菌 20
min。接种后 ,分光 、暗培养。光培养条件为(25±
1)℃,光强 2 000 lx ,光照时间为 14h/d;暗培养条件
为(25±1)℃。
1.3　结果测定
按下列公式计算出愈率 、分化率。
出愈率=形成愈伤组织的切块数接种的总切块数 ×100%
分化率=分化出苗的愈伤组织切块数接种的愈伤组织切块数 ×100%
过氧化物酶活力的测定按常规方法进行[ 4] 。
2　结果与分析
2.1　铁棍山药零余子的脱分化与再分化
2.1.1　脱分化诱导形成愈伤组织
2.1.1.1　光培养下不同激素配比对愈伤组织的诱
导　以 MS 培养基为基本培养基 ,设置 6种不同的
激素组合以观察不同激素配比对愈伤组织的诱导效
果(表 1)。光培养 7 ～ 8 d 后 ,首先在附加 6-BA
2.0mg/L+NAA 4.0mg/L 的激素组合的培养基上 ,
部分切块的边缘有膨大现象 。9 d 时 ,附加 6-BA
2.0mg/L +NAA 4.0mg/L 与 6 -BA 2.0mg/ L +
NAA 2.0mg/L 的培养基中 ,均形成少量愈伤组织。
随后 ,各培养基中愈伤组织陆续形成 ,以附加6-BA
2.0mg/L +NAA 2.0mg/L 的培养基的愈伤组织长
势最好。愈伤组织的发生部位多数在切块边缘 ,白
色或淡黄色。培养至 30 d ,愈伤组织趋于老化 , 35 d
时愈伤组织形成情况见表 1。
表 1　光培养下铁棍山药余零子愈伤组织的诱导
激素组合及浓度
(mg/ L)
接种切块数
(块)
愈伤组织
形成质量
出愈数
(块)
出愈率
(%)
6-BA 2.0+NAA 0.2 17 疏松 9 53
6-BA 2.0+NAA 1.0 17 疏松 15 88
6-BA 2.0+NAA 2.0 17 疏松 18 95
6-BA 2.0+NAA 4.0 17 疏松 14 82
2 , 4-D 1.0 17 较致密 14 82
2 , 4-D 2.0 16 较致密 13 31
　　由表 1可知 ,在培养基中加入不同的激素或激
素浓度不同 ,诱导效果差异显著 。2 , 4-D的诱导效
果较差 ,虽然也有愈伤组织形成 ,但形成的愈伤组织
质地较致密 , 不利于进行再分化。对于 6 -BA 与
NAA的组合 ,当 6-BA 浓度一定时 , NAA 浓度的
升高 ,出愈率明显提高 ,至 NAA 浓度达到 2.0mg/L
时 ,出愈率达到最高值(95%)。随着 NAA 浓度的
继续升高 ,出愈率反而下降 ,说明 NAA 在一定浓度
范围内随着浓度的升高 ,可以促进诱导愈伤组织的
形成。超过某一范围 ,反而会抑制愈伤组织的形成。
2.1.1.2　暗培养下不同激素配比对愈伤组织的诱
导　基本培养基及激素配比均与光培养相同。愈伤
组织生长情况如下:暗培养 5 d 时 ,在 6-BA 2.0
mg/L+NAA 2.0 mg/L 与 6-BA 2.0 mg/L+NAA
4.0mg/L 的培养基上 ,少数切块出现脱分化迹象 ,
6 d时 ,有少量愈伤组织生成;8 d时 ,各培养基均有
愈伤组织出现 。其中 ,在附加 6-BA 2.0 mg/L +
NAA 2.0 ～ 4.0 mg/L 的培养基上 ,脱分化效果最
好 。愈伤组织发生部位也在切块边缘。35 d 时脱
分化情况见表 2。
表 2　黑暗条件下铁棍山药余零子愈伤组织的诱导
激素组合及浓度(mg/ L) 接种切块数(块) 愈伤组织形成质量 出愈量 出愈数(块) 出愈率(%)
6-BA 2.0+NAA 0.2 12 疏松 少 8 67
6-BA 2.0+NAA 1.0 12 疏松 较多 9 75
6-BA 2.0+NAA 2.0 11 疏松 多 11 100
6-BA 2.0+NAA 4.0 11 疏松 多 11 100
2 , 4-D 1.0 12 较致密 少 12 92
2 , 4-D 2.0 17 较致密 少 17 100
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河南农业科学
　　由表 2可知 ,在诱导愈伤组织形成的过程中 ,暗
培养的诱导效果优于光培养。暗培养下 ,最佳的激
素组合为 6-BA 2.0 mg/L +NAA 2.0 ～ 4.0 mg/ L ,
出愈率可达到 100%,且出愈量大 。在含有 2 , 4-D
的培养基上诱导愈伤 ,虽然出愈率也较高 ,但愈伤组
织量较少 ,且质地致密 ,不适合用于再分化。
2.1.2　再分化成芽
2.1.2.1　不定芽的诱导发生过程　分别以光 、暗条
件下 ,激素组合 6-BA 2.0 mg/ L+NAA 2.0 mg/L
形成的愈伤组织(培养 25 d时)作为再分化的材料 。
在培养过程中 ,起初愈伤组织均有不同程度的增加 ,
随后 ,原光培养形成的愈伤组织在第 8天 、原暗培养
形成的愈伤组织在第 13 天开始有芽状体的出现 。
之后 ,不定芽慢慢形成 ,分别至第 30天 、第 45天成
为株高 1 cm 以上的单个植株或丛生苗 。
2.1.2.2　不同激素组合对光培养形成愈伤组织再
分化的影响　以 MS为基本培养基 ,培养 35 d ,结果
见表 3。
表 3　不同激素组合对光培养形成愈伤组织再分化的影响
激素组合及浓度
(mg/ L)
接种
切块数
(块)
出苗
切块数
(块)
平均
芽数
(块)
分化率
(%)
6-BA 1.0+NAA 0.5 18 3 2.0 17
6-BA 1.0+NAA 1.0 15 9 1.5 60
6-BA 2.0+NAA 0.5 21 15 3.0 71
6-BA 2.0+NAA 1.0 18 6 1.0 33
　　由表 3可以看出 ,不同的激素浓度组合 ,对愈伤
组织再分化影响很大 。其中 ,以 6-BA 2.0 mg/L +
NAA 0.5 mg/ L 组合的诱导效果最好 ,在该激素浓
度组合的培养基中 ,愈伤分化率最高 ,形成的多芽体
较多 ,且苗生长比较健壮 。
2.1.2.3　不同激素组合对暗培养形成愈伤组织再
分化的影响　以 MS为基本培养基 ,加入不同浓度
的激素 ,培养 45 d后 ,其再分化情况见表 4。
由表 4可知 ,不同激素组合对暗培养形成愈伤
组织再分化的影响 ,也以 6-BA 2.0 mg/L +NAA
0.5 mg/ L 效果较好。可见 ,铁棍山药零余子愈伤诱
导再分化的最佳培养基为:MS+6-BA 2.0 mg/L
+NAA 0.5 mg/L 。
表 4　不同激素组合对暗培养形成愈伤组织再分化的影响
激素组合及浓度
(mg/ L)
接种
切块数
(块)
出苗
切块数
(块)
平均
芽数
(块)
分化率
(%)
6-BA 1.0+NAA 0.5 14 6 2.5 43
6-BA 1.0+NAA 1.0 12 3 1.0 25
6-BA2.0+NAA0.5 15 9 2.3 60
6-BA 2.0+NAA 1.0 15 6 2.0 40
　　比较 2.1.2.2 与 2.1.2.3的结果可知 ,由暗培
养生成的愈伤组织起始脱分化需要的时间较长 ,分
化率较低 ,多芽体的形成 、苗的生长情况及生根情况
均不及光培养产生的愈伤组织。但由于光培养下的
出愈率没有暗培养下的出愈率高 ,且愈伤组织在暗
处长势较好 。因此 ,诱导愈伤可在暗培养下进行 ,需
再分化时 ,先转移到光培养下培养几天后 ,再转到分
化培养基上让其再分化 ,效果较好。
2.2　分化过程中过氧化物酶活性的变化
2.2.1　脱分化过程中过氧化物酶活性的变化　由
图 1可知 ,从培养之日起 ,过氧化物酶(POD)活性不
断上升 , 至第 9 天时达到第 1 个活性高峰 , 随后
POD活性有一下降趋势 ,但至第 21 天时又出现了
第 2个活性高峰 。由于初始接种时 ,零余子被切成
一定大小的切块 ,而造成一定程度的机械损伤 ,组织
结构的破坏易导致膜脂发生过氧化作用而抑制脱分
化过程的进行 。POD 活性的上升正可以解除由膜
脂过氧化而导致的生长抑制 ,使脱分化过程顺利进
行 。第 9天以后 ,愈伤组织进入旺盛生长阶段 ,细胞
内各种生理代谢过程顺利进行 , POD活性亦呈下降
趋势。第 21天的第 2 个活性高峰的出现与过氧化
物酶的另一个生理功能密切相关 ,即作为吲哚乙酸
氧化酶来发生作用 ,分解生长素从而抑制细胞生长 ,
使愈伤组织由快速生长期进入到生长停滞期。
图 1　脱分化过程中过氧化物酶活性变化
2.2.2　再分化过程中过氧化物酶活性的变化　由
图 2可知 ,再分化过程中 , POD 也存在 2 个活性高
峰 ,分别出现在第 6天和第 21 天 ,与芽状体的出现
及小植株的生长相符合 。细胞内这种生物大分子活
性物质的变化与形态发生相一致的关系 ,暗示了在
发育过程中 ,相应的基因在时间和空间上的顺序表
达 ,从而导致细胞内进行着旺盛的代谢活动 ,最终体
现在外部的形态变化上 。同时也暗示了 POD作为
再分化过程中标志酶的可能性。
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2005年第 7期
图 2　再分化过程中过氧化物酶活性变化
3　结论与讨论
3.1　光照对铁棍山药零余子脱分化和再分化的影
响
在山药的组织培养中 ,光是影响愈伤组织生长
发育和生理变化的因素之一[ 5 , 6] 。在我们试验中 ,
光照对愈伤组织的出现及生长量均有重要作用。光
照培养的愈伤组织发生时间比暗培养要晚 2 ～ 3 d ,
且生长量要小一些 ,说明光对愈伤组织的发生起抑
制作用 。周立刚[ 7]等曾在细毛樟的培养中发现 ,光
强 1 000 lx 就明显的影响愈伤组织的生长 ,使其生
长缓慢 ,并发生褐化 。在再分化过程中 ,不同来源的
愈伤组织起始分化时间与分化率均有较大差异。由
光培养形成的愈伤组织 ,其芽状体出现时间要比暗
培养形成的早 5 d ,分化率高 11 个百分点 。这说明
适当光照对愈伤组织的再分化是有利的 。因此 ,诱
导愈伤可在暗培养下进行 ,需再分化时 ,先转移到光
培养下培养几天后 ,再转到分化培养基上让其再分
化 ,效果较好。
3.2　激素对铁棍山药零余子脱分化与再分化的影
响
在植物组织培养理论的发展过程中 ,植物激素
始终占据着重要的地位 。许多研究工作已证明 ,在
调节控制脱分化和再分化的过程中 ,植物激素起着
十分重要的作用[ 8] 。脱分化时需要较高浓度的生
长素 ,而再分化出芽状体时则需要相对较高浓度的
细胞分裂素 。在我们试验中 ,诱导铁棍山药零余子
脱分化的最佳的激素组合为 6 -BA 2.0 mg/L +
NAA 2.0 ～ 4.0 mg/ L;诱导愈伤再分化的最佳激素
组合为 6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.5 mg/L 。
3.3　过氧化物酶与铁棍山药零余子分化的关系
过氧化物酶是植物组织中广泛存在的一种酶 ,
在代谢中起着重要的作用 ,而且与高等植物的发育
密切相关 。试验发现 ,在铁棍山药零余子中所测定
的过氧化物酶活性变化与前人所报道的基本一
致[ 9] 。但对于脱分化时期过氧化物酶活性的升高 ,
不一定是脱分化过程自身的反应 ,有可能是由于损
伤使合成该酶的基因去抑制的结果 ,或者机械切割
使过氧化物酶合成抑制物渗漏 ,使酶活性增强。根
据我们试验结果 ,过氧化物酶在愈伤组织发生 、芽状
体发生及苗形成过程中均有峰值存在 ,可见过氧化
物酶活性的变化与形态发生是有一定相关性的 ,但
其内在联系尚需进一步研究 。
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河南农业科学