全 文 ：印楝叶总黄酮的提取工艺研究
王有琼， 马李一， 张重权， 段琼芬
（中国林业科学研究院资源昆虫研究所，云南 昆明 650224）
摘 要：为优选印楝叶总黄酮的提取方法和最佳提取工艺，通过单因素和正交试验设计，研究提取温度、乙醇浓度、提取时间
对提取效果的影响，确定最佳提取工艺。 结果显示，微波法提取印楝叶总黄酮的较佳工艺条件为提取温度 70℃、乙醇浓度 70%、提
取时间 30 min，经验证显示该提取工艺结果稳定。 微波萃取法提取印楝叶总黄酮时间短，生产成本低，提取效率高。
关键词：印楝叶； 总黄酮； 微波法； 提取工艺
中图分类号：TQ91；R284.2 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2013）17-0087-04
Extraction technique of total flavonoids from
leaves of Azadirachta indica
WANG You-qiong, MA Li-yi, ZHANG Zhong-quan, DUAN Qiong-fen
（Research Institute of Resources Insects, Chinese Academy of Forestry, Kunming 650224, China）
Abstract: To optimize extraction method and extraction technique of total flavonoids from neem leaves, effects of different conditions
including extraction temperature, ethanol concentration and extraction time on extraction efficiency were studied by using single factor and
orthogonal experimental design. Results showed that the optimum extraction conditions were extraction temperature of 70℃, 70% ethanol
and extraction time of 30 min. The extraction process was stable. Thus, the optimum extraction technology is stable, the extraction method
requires short time, low production cost and has high extraction efficiency.
Key words: neem leaves; total flavonoids; microwave extraction; extraction technique
印楝（Azadirachta indica A.Juss.）为楝科楝属常绿乔木，
含有大量以印楝素为主的杀虫、拒食、抑制害虫生长等生理
活性物质[1-2]。最近的研究表明，印楝还可以作为肉鸡的抗生
素生长促进剂替代品， 对肉鸡的免疫反应产生有利的影
响[3]。 印楝叶中印楝素的含量相对较少，却含有黄酮类等多
种植物次生代谢产物，具有多种生物活性，如诱导肿瘤细胞
凋亡[4]、抑菌[5]。 印楝叶甲醇提取物对胃肠道线虫有较高的驱
虫活性[6]，叶和树皮的水提取物对多种植物有强烈的化感作
用[7]。 黄酮是一大类以苯色酮环为基础的酚类化合物，广泛
存在于自然界中。黄酮类化合物具有广泛的生物活性, 包括
抗心脑血管疾病[8]、抗氧化[9-10]、抗突变抗肿瘤[11-12]、抗菌[13]等。
印楝叶含有大量的黄酮类化合物， 尹峰等从印楝叶中分离
和鉴定出山奈酚、槲皮素、柽柳素、异杨梅树皮苷等几个黄
酮类化合物[14-15]，它们常以游离态或与糖结合成甙的形式存
在。 印楝叶中含有的黄酮类化合物具有降血压和降血脂的
作用[16]，具有很好的应用前景。 范刚等[17]比较了超声法、回流
法、索氏提取法和冷浸法提取印楝叶总黄酮的工艺条件，并
用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定提取物中总黄酮的含量，最
终选定水浴法为印楝叶黄酮的提取方法。
本研究采用超声微波组合、 热回流及微波萃取法对
印楝叶总黄酮的提取工艺进行研究， 选出不同萃取方法
下印楝叶黄酮提取的最优工艺条件， 为印楝叶总黄酮的
工业化提取提供部分数据参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
印楝叶精粉：2011 年 2 月于云南元江采集印楝鲜叶，
风干后粉碎过 0.42 mm 筛备用。
试验试剂：卢丁（瑞士 damas-beta）；AlCl3、无水乙醇、
石油醚（60~90℃），均为分析纯；去离子水（实验室自制，
18.2 MΩ）。
试验仪器：分析天平（AB204-S，Mettler Toledo）；超声
微波组合反应系统（XO-SM50，南京先欧生物科技有限公
司）；电热恒温水浴锅（XMDT-4000，北京市永光明医疗仪
器厂）；微波系统（MAS-1，新仪微波化学科技有限公司）；分
光光度仪（BECKMAN COULTER DU 800，1 cm比色皿）。
1.2 试验方法
1.2.1 印楝叶总黄酮的提取 超声微波组合法：准确称取
0.5000 g 印楝叶精粉，加入 50 mL 80%乙醇，在设定温度
70℃、超声波功率 300 W、微波功率 350 W（脉冲时间 4 s，
间隙时间 4 s）下萃取 40 min，过滤，收集滤液，以石油醚萃
取 1次后，乙醇-水层用 80%乙醇定容至 100 mL备用。
热回流法： 准确称取 0.5000 g 印楝叶精粉， 加入 50
mL 80%乙醇，于水浴中 70℃回流提取 80 min，过滤，滤液
以石油醚萃取 1 次， 乙醇-水层于 100 mL 容量瓶中用
80%乙醇定容备用。
微波萃取法：准确称取 0.5000 g 印楝叶精粉，加入 50
mL 80%乙醇， 在微波功率 400 W、 萃取温度 70℃下提取
30 min，过滤，滤液以石油醚萃取 1 次，乙醇-水层于 100
mL容量瓶中用 80%乙醇定容备用。
收稿日期：2013-06-08
基金项目：“十二五”农村领域国家科技计划项目（2012BAD21B0
404）
作者简介：王有琼（1973-），女，硕士，助理研究员，E-mail：wang
keyi666@126.com
通讯作者：段琼芬（1954-），女，博士，研究员，E-mail：qiongfend@
163.com
广东农业科学 2013 年第 17 期 87
C M Y K
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2013.17.007
总黄酮含量
（mg/g）
25.85
25.12
25.23
耗能
（kW/h）
0.43
1.30
0.20
提取时间
（min）
40
80
30
提取方法
超声微波组合
热回流法
微波法
表 1 不同提取方法的比较
总黄酮含量
（mg/g）
21.30
22.10
22.95
24.99
25.22
23.61
吸光值
0.1554
0.1617
0.1687
0.1847
0.1866
0.1739
提取温度
（℃）
30
40
50
60
70
80
样品质量
（g）
0.5011
0.5014
0.5027
0.5032
0.5034
0.5030
表 2 提取温度对印楝叶总黄酮提取的影响
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
吸
光
值
波长（nm）
图 1 样品溶液全波长扫描曲线
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.005 0.010 0.015 0.020
浓度（mg/mL）
图 2 芦丁对照品工作曲线
吸
光
值
y=30.875x-0.0094
R2=0.9994
1.2.2 印楝叶总黄酮含量测定 采用 AlCl3-分光光度法
检测印楝叶总黄酮的含量。 准确吸取不同提取方法提取
得到的样品溶液 0.5 mL，分别置于 10 mL 容量瓶中，加入
0.5 mL质量分数为 2％的 AlCl3乙醇溶液， 并用 80%乙醇
定容，室温静置 1 h，在 410 nm 波长下测定吸光值。 同时，
以相应试剂做空白对照。 按回归方程计算样品溶液中总
黄酮浓度，并根据下式计算印楝叶样品中总黄酮含量：
M=cV×200/m
式中，M为印楝叶样品中总黄酮含量（mg/g）；c为样品溶液
中总黄酮质量分数， 由标准曲线线性方程计算得到（mg/
mL）；V为样品体积（10 mL）；m为印楝叶样品质量（g）。
1.2.3 芦丁标准溶液的制备 准确称取经 105℃干燥至
恒重的芦丁标准品 0.0200 g， 溶解后移入 100 mL容量瓶
中，加入 80％乙醇至刻度，摇匀，得质量浓度为 0.2 mg/mL
的标准储备液。 准确吸取芦丁标准储备液 10 mL 于 100
mL容量瓶中，加 80％乙醇定容，得质量浓度为 0.02 mg/mL
的标准溶液。
2 结果与分析
2.1 测定波长的选择
选取 AlCl3为显色剂显色后， 在 200~700 nm 波长范
围内扫描， 分别作供试样品溶液及芦丁对照品溶液的吸
收曲线。结果（图 1）显示，其均在 410 nm 波长处有最大吸
收，故选择 410 nm 作为检测波长。
2.2 标准曲线的绘制
准确吸取芦丁标准液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、
9.0 mL，分别置于 10 mL 容量瓶中，各加 0.5 mL 质量分数
为 2％的 AlCl3乙醇溶液， 并用 80％乙醇定容， 室温放置 1
h，同时以相应试剂为空白对照，在 410 nm波长下测定吸光
度。 以吸光度值为纵坐标， 样品浓度为横坐标绘制标准曲
线，如图 2所示，得芦丁质量浓度 C（mg/mL）与吸光度 A的
线性关系：A=30.875C-0.0094，相关系数 r=0.9994，在 0.002~
0.02 mg/mL范围内，吸光度与浓度线性关系良好。
2.3 提取方法确定
按照 1.2.1 及 1.2.2 的方法分别用超声微波组合法、热
回流法及微波法萃取印楝叶总黄酮，经检测，各种提取方
法的结果见表 1。表 1表明，3种提取方法提取印楝叶总黄
酮的含量相差不大，但微波法的提取时间最短，耗能最低。
从控制生产成本的角度考虑，选择微波法作为印楝叶总黄
酮的提取方法较适宜。
2.4 微波法单因素试验
2.4.1 提取温度对印楝叶总黄酮提取的影响 准确称取
0.5 g 印楝叶精粉，在微波功率 400 W、固液比 1∶100 的条
件下，加入 70%乙醇，分别在 30、40、50、60、70、80℃下萃
取 20 min，得印楝叶总黄酮的含量如表 2所示。 由表 2 可
知，随着提取温度的上升，印楝叶总黄酮含量升高，在 60~
70℃达到峰值。
2.4.2 乙醇浓度对印楝叶总黄酮提取的影响 准确称取
0.5 g 印楝叶精粉，在微波功率 400 W、固液比 1∶100、提取
温度 50℃的条件下， 分别加入 50%、60%、70%、80%、90%
的乙醇提取 20 min，得印楝叶总黄酮的含量结果如表 3 所
示。从表 3可以看出，随着乙醇浓度的增加，总黄酮的含量
增加，当乙醇浓度为 70%时总黄酮含量达到峰值。
2.4.3 提取时间对印楝叶总黄酮提取的影响 准确称取
0.5 g 印楝叶精粉，在微波功率 400 W、固液比 1∶100、提取
温度 50℃、乙醇浓度 70%的条件下，分别提取 10、15、20、
25、30、40、50 min，按 1.2.2 中方法检测印楝叶总黄酮的含
量，结果如表 4所示。 由表 4 可知，随着提取时间的延长，
88
C M Y K
总黄酮含量
（mg/g）
15.79
19.96
22.95
22.51
22.10
吸光值
0.1130
0.1456
0.1687
0.1659
0.1617
乙醇浓度
（%）
50
60
70
80
90
样品质量
（g）
0.5020
0.5031
0.5027
0.5045
0.5014
表 3 乙醇浓度对印楝叶总黄酮提取的影响
总黄酮含量
（mg/g）
21.23
22.95
23.02
23.25
22.92
22.73
吸光值
0.1563
0.1687
0.1686
0.1703
0.1679
0.1671
提取时间
（min）
10
20
25
30
40
50
样品质量
（g）
0.5056
0.5027
0.5008
0.5007
0.5010
0.5029
表 4 提取时间对印楝叶总黄酮提取的影响
C提取时间（min）
20
30
40
B乙醇浓度（%）
60
70
80
A提取温度（℃）
60
70
80
水平
1
2
3
表 5 印楝叶总黄酮超声微波提取的正交试验因素及水平
因素
总黄酮含量
（mg/g）
14.96
23.25
19.76
19.59
25.97
24.37
15.46
25.23
24.89
T=193.48
C提取时间
（min）
1
2
3
2
3
1
3
1
2
21.52
22.58
20.40
2.18
B乙醇浓度
（%）
1
2
3
1
2
3
1
2
3
16.67
24.82
23.01
8.15
A提取温度
（℃）
1
1
1
2
2
2
3
3
3
19.32
23.31
21.86
3.99
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
k1
k2
k3
R
表 6 微波法提取印楝叶总黄酮的正交试验结果
因素
Fa
F0.05＝19.0
F0.01=99.01
F
19.55
87.84
5.71
方差（MS）
12.22
54.9
3.57
0.625
SS
24.43
109.80
7.13
1.25
142.61
自由度
2
2
2
2
8
变异来源
提取温度
乙醇浓度
提取时间
误差
总计
表 7 方差分析结果
印楝叶总黄酮含量呈上升趋势， 当时间为 30 min 时总黄
酮含量达到最高， 之后随提取时间的增加黄酮含量不断
降低，这是因为黄酮遭到了破坏。
2.5 正交设计优化微波法提取工艺
2.5.1 因素与水平 根据单因素试验结果， 在固液比均
为 1∶100，提取次数均为 1 次的条件下，选取提取温度、乙
醇浓度、提取时间 3 个因素，每个因素选取 3 个水平，设
计因素水平，如表 5所示。
2.5.2 正交试验结果 运用 L9（34）正交表进行试验，以印楝
叶总黄酮含量为考察指标， 运用统计学的方法处理试验结
果，如表 6所示，方差分析结果如表 7所示。由表 6 和表 7 可
知，因素 A、B、C对印楝叶总黄酮提取的影响大小依次为 B>
A>C，乙醇浓度间的差异和影响达极显著水平，提取温度间
的差异和影响也达显著水平，提取时间的影响不显著。 在试
验设计范围内， 微波法提取印楝叶总黄酮的最优方案为
A2B2C2，即提取温度 70℃、乙醇浓度 70%、提取时间 30 min。
2.6 验证试验
按最佳工艺条件，提取 5 份样品的总黄酮含量，结果
显示 ，5 份样品总黄酮含量分别为 25.21、25.31、25.24、
25.28、25.27 mg/g，平均含量为 25.26 mg/g，RSD 为 0.59%，
表明优选的工艺条件具有较好的重现性。
3 结语
超声微波组合法和微波辅助萃取法均是利用现代新
兴技术的提取方法，在生物活性物质提取方面具有巨大的
发展潜力，热回流法是一种较传统的提取方法，并因其成
熟的设备和工艺在工业生产中被普遍应用。印楝叶中黄酮
类化合物含量高，具有极大的开发利用价值。 本研究对超
声微波组合法、热回流法和微波萃取法对印楝叶总黄酮的
提取效果进行了综合比较，证明微波萃取法在提取率和能
耗方面较其他两种方法有优势，具有独特的发展前景。
通过单因素试验获取微波法提取印楝叶总黄酮的各
影响因素的较佳取值范围，进而确定了正交试验的因素水
平。 正交试验结果表明，微波法提取印楝叶总黄酮的较佳
工艺条件为提取温度 70℃、 乙醇浓度 70%、 提取时间 30
min， 其中乙醇浓度对提取率的影响最显著， 提取温度次
之，最后是提取时间。在优选的工艺条件下，印楝叶总黄酮
的含量为 25.26 mg/g，验证试验 RSD 为 0.59%，表明该工
艺提取效果稳定可靠。
参考文献：
[1] Jadeja G C, Maheshwari R C, Naik S N. Extraction of natural
insecticide azadirachtin from neem (Azadirachta indica A. Juss)
seed kernels using pressurized hot solvent [J]. J Supercrit Fluid,
2011,56(3):253-258.
[2] Kebede Y, Gebre -Michael T, Balkew M. Laboratory and field
evaluation of neem (Azadirachta indica A. Juss) and Chinaberry
(Melia azedarach L.)oils as repellents against Phlebotomus
orientalis and P. bergeroti (Diptera:Psychodidae) in Ethiopia[J].
Acta Trop, 2009,113(2):145-150.
[3] Landy N, Ghalamkari G, Toghyani M. Performance, carcass
characteristics, and immunity in broiler chickens fed dietary
neem (Azadirachta indica) as alternative for an antibiotic growth
89
C M Y K
A 青脊竹蝗成虫 B 青脊竹蝗危害状
图 5 青脊竹蝗危害症状
活动猖獗，极易诱发煤烟病。 秋季还会较集中发生 1 次，
但没有春季严重。蚜虫在通风不良，阴湿的竹林中发生较
为严重，可导致竹笋产量下降，造成严重经济损失。
4.3 防治对策
冬季清园或早春培土前剪除销毁受害枝条， 减少虫
源； 大量发生时可用毛笔蘸取乐果或敌百虫原液涂抹竹
秆中下部节间，使竹蚜虫吸食汁液而中毒死亡，此方法简
便易行， 效果佳； 也可用 5％蚜虱净乳油 1 000 倍液或
2.5％功夫乳油 2 000倍液喷雾竹冠。
5 青脊竹蝗
青脊竹蝗（Ceracris nigricornis Walker）主要取食竹叶，
影响麻竹正常生长，但该害虫无群聚习性，危害较小[4]。
5.1 危害症状
成虫、若虫均取食麻竹叶片，竹叶被啃食成纯齿状缺
刻，甚至整张叶片被吃光，危害严重时可吃光小面积竹园
的竹叶（图 5）。
5.2 发生规律
1 年发生 1 代，以卵越冬，越冬卵于 4 月上旬开始孵
化，孵化期约 35 d。 5月中旬若虫开始取食竹叶，7月中旬
开始羽化成虫， 成虫活动期为 7 月中旬至 11 月中旬；10
月上旬开始产卵于 1～2 cm 深的土中，10 月中旬至 11 月
上旬为产卵盛期，11月中旬后成虫活动明显减少。青脊竹
蝗喜光，多栖息于路旁或竹园边缘的竹丛上；嗜好人粪尿
及其他带腐臭咸味的东西， 故也多见于施用人粪尿等有
机肥料的竹园。
5.3 防治对策
竹蝗产卵集中，可于 11月份到产卵集中地挖除卵块；
若虫盛期，可在露水未干前用高效阿维菌素喷雾防治；人
尿 100 kg 加入敌百虫 2～3 kg 拌匀，再用稻草浸透，在竹
园中放数堆诱杀，效果好。
麻竹虫害的防治应坚持“预防为主，综合防治”的基本
原则，根据虫害的发生规律，及早做好监测预报和防控工
作。 防治措施应以营林技术为基础，科学施肥，适时排灌，
冬季清园复垦，夏季松土除草，铲除有害生物的越冬、过夏
场所，必要时使用化学农药防治，但生产过程中禁止使用
高毒、高残留农药。
参考文献:
[1] 罗集丰,郑奕雄,黄菊珊,等.麻竹病害发生规律及防治对策[J].广
东农业科学,2011,38(9):63-64,71.
[2] 黄喜文,侯平扬,李育斌,等.竹弧蠹蛾的形态特征及生物学特性
研究初报[J].广东农业科学,2005(5):56-57.
[3] 李瑞军,周平阳,陆志国,等.陇川县麻竹病虫害调查及防治建议[J].
林业调查规划,2009,34(3):95-97.
[4] 赵仁友.竹子病虫害防治彩色图鉴[M].北京 :中国农业科学技术
出版社,2006.
promoter[J]. Livest Sci, 2011, 142(1):305-309.
[4] Bose A, Haque E, Baral R. Neem leaf preparation induces
apoptosis of tumor cells by releasing cytotoxic cytokines from
Human peripheral blood mononuclear cells [J].Phytother Res,
2007, 21(10):914-920.
[5] Ghorbanian M, Razzaghi-Abyaneh M, Allameh A, et al. Study
on the effect of neem (Azadirachta indica A. juss) leaf extract
on the growth of Aspergillus parasiticus and production of
aflatoxin by it at different incubation times [J].Mycoses,2008,51
(1):35-39.
[6] Al -Rofaai A, Rahman W A, Sulaiman S F, et al. In vitro
activity of neem (Azadirachta indica) and cassava (Manihot
esculenta) on three pre -parasitic stages of susceptible and
resistant strains of Teladorsagia (Ostertagia) circumcincta[J]. Vet
Parasitol, 2012,188(1-2):85-92.
[7] Xuan T D, Tsuzuki E, Hiroyuki T, et al. Evaluation on
phytotoxicity of neem (Azadirachta indica. A. Juss) to crops and
weeds[J]. Crop Prot, 2003, 23(4):335-345.
[8] 延玺,刘会青,邹永青,等.黄酮类化合物生理活性及合成研究进
展[J].有机化学,2008,28(9):1534-1544.
[9] Negi P S, Chauhan A S, Sadia G A, et al. Antioxidant and
antibacterial activities of various seabuckthorn (Hippophae
rhamnoides L.)seed extracts[J]. Food Chem, 2005,92(1):119-124.
[10] Zhang G W, He L, Hu M M. Optimized ultrasonic -assisted
extraction of flavonoids from Prunella vulgaris L. and evaluation
of antioxidant activities in vitro [J]. Innov Food Sci Emerg,
2011, 12(1):18-25.
[11] Chung H S, Chang L C, Lee S K, et al. Flavonoid constituents
of chorizonthe diffuse with potential cancer chemopreventive
acticity[J]. J Agric Food Chem, 1999,47(1):36-41.
[12] Ranelletti F O, Maggiano N, Serra F G, et al. Quercetin
inhibits p21-RAS expression in human colon cancer cell lines
and in primary colorectal tumors [J]. Int J Cancer, 2000, 85(3):
438-445.
[13] Sathiamoorthy B, Gupta P, Kumar M, et al. New antifungal
flavonoid glycoside from Vitex negundo [J].Bioorg Med Chem
Lett, 2007,17(1):239-242.
[14] 尹锋 ,雷心心 ,楼凤昌 .印楝化学成分研究 [J].中草药 ,2003,34(8):
687-688.
[15] 尹锋,雷心心,成亮,等.印楝种子及叶的化学成分研究[J].中国药
科大学学报,2005,36(1):10-12.
[16] 谭卫红,宋湛谦.印楝的化学成分及其生物活性[J].东北林业大学
学报,2005,33(6):76-78.
[17] 范刚,杜娟,尹鸿翔,等.印楝叶总黄酮的提取工艺研究及含量测
定[J].成都中医药大学学报,2009,32(3):74-76,80.
（上接第 83页）
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
A B
90
C M Y K