全 文 ：生 物 工 程 学 报 7( 3 ): 2 一 3一 2 1 9, 1 9 9 1
C人i ” e s e oj 一`r 雌 a Z o f B i o t e e耘儿 o lo g y
紫云英根瘤菌基因文库的构建及含完整结瘤
基因的重组质粒 p Ra z1 5的分离
张忠明 陈华癸 李阜棣
(华中农业大学生物固氮研究室 , 武汉 )
范云六
( 中国农业科学 院分子生物学研究室 , 北京 )
以紫云英根瘤菌菌株 7 6 5 3 R为材料 , 制备总 D N A , 经 E co R I 限制酶部分酶解 , 通过10 一
50 %蔗糖梯度离心 , 分离到 20 一 3 0 k b 的 D N A 片段 。 利用能在革兰氏阴性菌中转移和复制的
广谱寄主载体— p L A F R I质粒 , 构建了紫云英根瘤菌基因文库。 通过与首楷根瘤菌 1 0 2 1菌株中 8 . 7 k b的共同结瘤基因 (作探针D N A )杂交 , 从基因文库中分离到紫云英根瘤菌共同结瘤
基因片段 。 以紫云英根瘤菌不结瘤突变株 7 6 5 3 R 十 1 ( 7 6 5 3 R消除共生质粒 ) 为受体 、 构建的
7 6 5 3 R基 因文库 (石 . e o Z云 C 6 0 0 )为供体 , 通过协助转移质粒 p R K Zo z 3 ( L E 3 9 2 )进行三亲交配 ,
在含四环素的根瘤菌合成培养基 ( S M )上选择接合转移子 。 将得到的所有接合转移子混合在
一起接种植物 , 通过植物结瘤试验 , 分离到含紫云英根瘤菌结瘤基因的重组质粒 p R a z 1 5 。
将该质粒用 F co R I 完全酶切 , 得到 2k5 b 左右的外源 D N A 片段 , 该 片 段携带完整的结瘤
共因簇 。
关键词 紫云英根瘤菌 , 结瘤基因 , 基因文库
紫云英 ( A s t r a 夕a l o s : ` n i e o s L . ) 是
我国南方水稻 田里的主要豆科绿肥 , 对增
加粮食产量 、 保持 土 壤肥力起着重要作
用 。 陈华癸 “ ’ “ 王 、 范云六 〔 3 ’ 等对紫云英
根瘤菌进行过许多研究 。
近几年来的遗传学研究表明 , 紫云英
根瘤 菌和其它一些快生型根瘤菌一样 , 也
广泛存在着 内 生 大 质粒 〔 ` ’ 5 ’ , 其共生基
因 也 存 在 于特定的大质粒上 〔 6 ’ ;” 。 迄今
为止 , 尚未见到关于紫云英根瘤菌完整结
瘤基因簇的分离和克隆的报道 。 本文利用
能在革兰氏阴性菌中转移和复制的广谱寄
主载体一 p L A F R I 〔 8 ’ 构 建 了紫云英根瘤菌 7 6 5 3 R 菌株的总 D N A 基因文库 , 并
通过与首着根瘤 菌 8 . 7 k b 一 E c O R [ 片段的
共同结瘤丛因杂交 , 从墓因文库中分离出
含有紫云英根瘤菌共同结瘤基因片段 。 同
时利用不结瘤 ( N o d 一 )突变株 7 6 5 3R + 1 ,
进行三亲交配 , 用接合转移子接种紫云英
植株 , 从 7 6 5 3R基因文库中分离出具有完
整功能的紫云英根瘤菌结瘤基因簇 。
材 料 与 方 法
(一 )材料
1
。 细菌和质粒 : 见表 1 。
2
。 培养基
( 1 ) T Y 培养基 ( g ) : 胰 蛋 白膝 5 ,
酵母粉 5 , C a C I : · 6H : 0 1 . 3 , 蒸 馏 水
1 0 0 0ml
,
P H 7
。
0
。
本文于 19 8。年 10 月 6 日收到 。
国家自然科学基金资助的课题 。
本文部 分工作是在中国农科院分子生物学研究 室完
成 , 并得到该室杜杰 、 刘阳 、 王宪等 同志的大力支
持 和布助 , 在 此表示感谢 。
DOI : 10. 13345 /j . cjb. 1991. 03. 004
生 物 工 程 学 报 7卷
裹 1细 , 和质较
T
a b le 1 B a e t e r i a l s t ar i
n s a n d p l a恤 i d s
菌株与质粒
S t r a i n s & p la sm i d
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有 关 性 状
R e le v a n t e h a r a e te r i s t i e s
文献及来源
R e f e r e n e e o r os u r
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. 口滋 r e o a l玄a就 r a g a
7 6 5 3 R
7 6 5 3 R + -
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N o d一 m牡 t a n t o f 7 6 5 3 R d e甲 o i d o f S r m一 p l a s m i d
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( 76 5 s R+ 1 e o n ta i n e d er
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p R a Z 1 5 )
〔 7 〕
〔 7 〕
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BH B 2 6 s s
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N Z o s
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一 (入i口m 4 3 4 , c l t s , , bZ , r ed 3 , E a m 4 , s . m 7 )入
N Zo s
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一 (入i m m ` 3 4 , e l t s , , b Z , r e d s , D a m 15 , s . m ? )入
中国农科院分子
生物学研究室
1 a b
.
M o l
.
B io l go 了 ,
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P l a , 叮 i d s
p L A F R I ( H B z川
p Rm S L 2 6 ( H B一0 1 )
PB R3 2 5 (H B l o z )
PR m Z I (H B z o z )
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a 3 7 o ( C 6 00 )
PR
a Z z s ( H B l o z )
PR K Zo r 3 ( L E s o Z )
N o d
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. 州 e l主ot 亡泛红 o d ge n e c l o n e d i n p L A F R I 〔1 4〕
A口 p r , T e r , C m r T h i s aL b
.
R
. 爪 e l吏Zo t乞 5 . 7K b e om 口 o n 且 o d g e n e o lo n e d i n p BR s 2 5 T五15 w o比
R
.
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.
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t r a + OC IE I D i *t
a . e t a l
.
( 又。 5 0 )
( 2 ) T A 培 养 基 ( g 、 : 胰蛋 白膝 4 ,
M g S O 4
·
7H
Z
O o
.
C, 蒸 馏 水 1 0 0 0 m l
P H 7
。
2
。
( 3 ) SM 培养基 : 蔗糖 1 09 , K N 0 3
0
.
5 9
,
K Z H P O
`
0
.
59
,
C a C I : 0
。
19
-
N a C I 0
.
19
,
H
o B O
3 2 0m g
,
N a : M o O
`
2 0m g
, 硫 胺素 0 . l m g , 烟酞胺 0 . l m g ,
泛 酸 钙 0 . l m g , 生 物 素 I n l g , 蒸馏水
1 0 0 0ml
,
PH 7
。
0
。
(二 )方 法
1
.
D N A的分离 及操作 : 根瘤菌总
D N A的分离方法参考 M a , Q . S . 等 ` . ’ 的
方法 。 提取的总 D N A经 E c o R I 部分酶解
后 , 经 1 0一 5 0% 蔗 糖 梯 度 , 2 5 0 0 0 I’P m
( B e e k m an SW 2 8 ) 2 0 oC 离心 2 4 h , 然后
收集20 一 30 k b的 D N A片段 , 装入透析袋
内 , 在 T E缓冲液 ( r o m m o l / L T r i S 一 H C I ,
l m m o l / L E D T A
,
PH 7
.
8 ) 中透析 24 h ,
每隔 6 h 换一次缓冲液 , 取出样品 , 加 入
1 / 10体积的 3m o l / L醋酸钾 ( p H s . o ) , 加入
2 倍体积的 一 20 ℃ 冷却的无水乙醇 , 置
一 Z o oC 过夜 。 离心 ( 1 5 0 0 0 pr m , 4 ℃ ,
20 m in )沉淀D N A , 加入 70 %冷乙醇洗涤
一次 , 以同样的条件离心再沉淀 D N A ,
最后 D N A悬浮于 2 0 0川的 T E缓冲液中。
载体 D N A ( p L A F R )I 的制备以及重
组质粒D N A的检测按 M an iat is 等 『` 。 ’ 的
碱性裂解法进行 。
D N A的连接采 用 T 4D N A 连接酶 ( 日
本 Z e o n 公司 )在 1 2℃连接 1 6h 。
2
. 入噬 菌体包装物的制备及效价测
定 : 包装物的制备参照 uP 垃er , A . 〔 ` ” 的
方法。 效 价 测 定 指 示 菌 的 制备 参 照
B o e hr i吧 e r M an n h e im 公 司 产 品 目录
上介绍的方法 「’ “ ’ , 指示菌为L E 3 9 o2
3
. 重组 D N A 的体外包装及转染 :
3期 张忠明等 :紫云英根瘤菌基因文库的构建及含完整结瘤基因的重组质粒 p Ra 之15 的分离 1 25
重组 A D N的体外包装及转染按 Pu hle l’ ,
A
. 「` ” 的方法进 行 , 重 组 子在含四环素
( 1 5协g / m l) 的 L B选择性培养基上筛选 , 受
体菌为C 6 0 o 。
4
. 缺 口转译及菌落原位杂交 : 缺 口
转译药盒为B R L公司产品 , a 一 3 “ ]户一 d C T P
为 D u p o n t 公 司 产 品 , 被 标 记 的质粒
p R m Z I D N A 为 碱 解法制备物 , 反应条
件按 B R L 公司缺 口转移药盒的说明进行 。
菌落原位杂交 : 硝酸纤维素膜 ( S er v a
公司 ) 的制备 处 理 按 M a in at is 等 〔 , 。 ’ 的
方法进行 。 膜杂交按下述方法进行 : 膜在
杂交 前 , 用 5 0 m m o l / L T r i s 一 H C I , p H
8
.
0
,
0
.
1% S D S
, l m m o l / L l二D T A ,
] m o l / N a C I在 4 2 oC 处理 3 0m jn , 然后置于
滤纸上吸干 , 按 o . Zm l c/ m “ 膜的量加入预
杂交 液 ( l : 1 甲酸胺 , s x S S P E , 0 . 3%
S D S
, 0
.
l m g /间热变性的蛙精 ]〕 N A ) ,
42 ℃ 预杂交 2 . 5h , 倒去预杂交液 , 再按
1/ 4 原体积 的量加入杂交液 , 热 封 口 ,
置 42 ℃水浴中杂交 24 h 。 然后取出膜置于
4 2 oC 预热的 0 . 5 % S D S 、 2 x S S C 中漂洗
3 o m in
, 再转入 4 2℃预热的 0 . 2% S D S 、
2 x S S C中漂洗 s o m in 。 膜放在滤纸 士晾
干 , 并置于X 一光暗匣中 , 压上 X 一光片 ,
在 一 2 0 oC 曝光 2 4h 。
5
。 三亲交配及植物结瘤试验 : 取 巳
转染的大肠杆菌 o . s m l ( 40 %甘油保存 )接
种于 5间含四环素 ( 1 5件g /m l) 的 L B培养液
中 , 3 7℃振荡培养 1 2 h 。 同时接种含质粒
p R K 2 0 1 3的菌株于 s m l含卡那霉素 ( 5 0卜g /
ilr )的 L B培养液中 , 37 ℃ 培养 1 2 h 。 紫云
英根瘤菌不结瘤突变株 7 6 5 3R + 1 接种于
5m l T Y 培养液中 , 28 ℃ 振 荡培养 24 一
36 h
。 将三 个 培 养 好的菌株等比例混合
后 , 用无菌注射器注射到醋酸纤维素滤膜
上 (中2 5m m , 孔径为 0 . 2协m ) , 然后将膜
置于已制备好的 T Y 固体培养基 J二, 28 ℃
培养 1 6一 24 h , 用无菌水洗下菌苔 , 所洗
下的菌悬液全部涂布到含 四 环素 ( 1卯 g /
m l )的 SM培养基上 。 o . Zm l /皿 , 用 7 6 5 3R
的基因文库和 7 6 5 3R 十 1 同时涂皿作对照 ,
2 8℃培养 3 一 5 天后 , 长出的菌落用无菌
水全部洗下 , 混合起来制成菌悬液 , 作为
接种物进行植物结瘤试验 。
紫云英种子经表面灭菌和 催芽后 , 播
入无氮植物营养液配制的琼脂栽培管中 ,
置 25 ℃光照室生长 2天后 ,将上述制得的菌
悬液接种于琼脂栽培管中 , 0 . 5一 l m l/ 每
管 , 植物继续在光照室生长 30 一40 天后观
察结果 。
结 果 与 讨 论
( 一 )萦云英根瘤菌基因文库的构建
紫云英根瘤菌 7 6 5 3 R 菌株的总 D N A
用 E c o R I部分酶解后 ,通过蔗糖梯度离心 ,
得 到 20 一 30 k b的 D N A 片段 , 将这种 D N A
片段连接到经 E c o R I 酶切的 p L A F R I 质
粒上 , 参照 F ir e d m an 的方法 〔“ ’ , 连接
时外源 D N A 与载体D N A的比例约为 8 : 1 ,
即根瘤菌D N A为 4 0 0件g / m l , 载休 D N A为
50 蜡/m1 。 高浓度的外源 D N A 可以降低
载体 D N A 自身连接的比例 , 酶连结果见
图版 卜 A 。 这 种连接物经体外包装并转
染 E 。 c o l f C 6 0 o , 在含四环 素 ( 1 5件g / m l )
的 L B 培养基 上筛选四环素抗性克隆 , 结
果见 图 1 。 四 环 素 抗 性克隆数的得率为
7
.
4 x l o ` / ” 9 D N A连接物 。
为了检测四环素抗性克 隆 中载体 一外
源 D N A 连接和载体自身连接的比例 , 我
们随机挑取 了 50 株四环素抗性克隆分离质
粒作为初检 , 结果 表明 50 株中有 1 5株含有
载休与外源 D N A 连接的 贡组质粒 , 其余
均为载体自连的 p L A F R I质粒 。 结果见图
版 工 一 B 。 图版 工一 B是 50 株四环素抗性克
7卷2 16 生 物 工 程 学 报
隆质粒检测中的部分结果 ( 5块电泳凝胶
中的 1块 ), 从图版 工一B 可以看出 , 3 ,
4
,
6
,
7
,
8 号样品的质粒带型与 1 号
样品 (载体 p L A F R I 质粒 ) 完全一样 ,
而 5 , 9 , 1 0 , 1 1 , 1 2号样品带型与 1 号
样品不一样 , 所以我们初步认为后者不一
样的是重组质粒 , 即在 p L A F R I上克隆有
外源 D N A片段 。 值得说明的是 , 本文采用
的是碱性裂解法抽提质粒 , 而 p L A F R I质
粒及克隆有外源 D N A 片段的重组质粒都
含有“ c o s ” 位点 , “ c os ” 位点在碱性条件下
很容易连在一起 , 使质粒形成多聚体 。 从
图版 卜 B 可以看出除 2 号样品 (无质粒对
照菌株 C 6 o o) 外 , 其余样品在染色体带以
上均隐约可见 多聚体带 , 根据 p L A F R I的
单体质粒带以及多聚体带的位置 , 我们初
步确定 3 , 4 , 6 , 7 , 8 样品的质粒为
载体自连的结果 , 其它均为重组质粒 。 通
过这种判断方法 , 在上述 50 株中有 15 株是
重组质粒 。 为了进一步确证这 15 株是否克
隆有外源 D N A 片段 。 我们从 15 株中随机
取 6 株制备质粒 D N A , 用 E c o R I 完全酶
切 。 并将这 6 株 不 同的质粒分别命名为
P R a l
、
P R a Z
、
P R a 3
、
P R a 4
、
P R a s
、
p R a 6
。 酶切分析结果见 图版 卜 C 。 结果
表明这 6 个质粒均含有外源 D N A 片段 ,
而且不同的质粒克隆的外源 D N A 片段都
不相同 ,说明克隆有多种多样的外源 D N A
片段 。 其外源 D N A片段的大小在 18 . 8一
29
.
8 k b 范围之间 。 因此 , 重组克隆的质
粒在 基 因 文 库 中的比例约为 30 % 。 根
据 M a n iat i s 等 〔` ” ’ 介 绍 的 公 式 : N =
本文所得基因文 库 的 重 组子数达到理论
值 , 满足了建库的要求 。
(二 ) 紫 云 英根启菌共同结右基因的
分离
将根瘤菌基因文库中分离出的 2。。o个
菌落复印到硝酸纤维素膜 上 ( 膜处理及杂
交见材料和方法 ) , 从 p R m S L 2 6质粒上切
下含有首偕根瘤菌 8 . 7 k b的共同结瘤基因
.刃 ` 举月 尹 I, 月 , 习` l口〔 J奋 】恤 P , , 甲 」乙
F i g
. 1 S e le e t io n o f t e t ar
e r l i n e er s i s ta
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培养 基为含四环素 ( 16 卜g /m l) 的 L B培养基
L B 口 e d i她 e o n t a i n i n ` t e t r a e y l i n e ( 25“ g /m l )
In ( 1 一 P )
nI ( 1
一 f / g ) ’ 根瘤菌基因组 D N A 为 I
X
1 0
7
b P ( g )
, 插入片段以 2 . 5 x l o ` b P ( f )计
算 , 构建基因文库能以 9 %的概率 ( P )覆
盖根瘤菌整个 D N A , 理论上需要的重组
子数 ( N )可以通过上式计算为 1 。 8 x 10 3 。
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.
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( pR m S L 2 6 ) u关 d a s
p o s i t i v e e o n t or l
,
p R几 2 1 u se d a s a p or b e
3期 张忠明等 :紫云英根瘤菌基因文库的构建及含完整结瘤基因的重组质粒 p Ra Z15 的分离 1 27
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一 Ino c u l a t e d w i t h 7 6 6 3 R st r a i n (主) o s i t i v e
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2 。 I n o c u la t e d 可i t h 7 6 5 3R + 1 s t r o in
( n eg
a t i v e e o o t r o l )
,
。
In o e o l . t de 贾 i til 扭 i x t u er o f * r iaP er n t a l
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u g a n ts ( 76 5 3 R 明 n e
li b r a r了 , p R K Zo 1 3 a n d 7 6 6 3 R + 1 )
片段 , 克隆到 P B R 3 2 5的 E e o R I 位点上 ,
构成p Rm Z 了质粒 , p R m Z i 的酶切分析见
图版 卜 D 。 将该质粒作为探针 D N A , 从
上述菌落中分离到含紫云英根瘤菌共同结
瘤基因片段的重组质粒 ,定名为 p R a3 70 ,
菌落原位杂交结果见图 2 。 p R a3 70 质粒
经 E c o R I完全酶切得到 2 条外源 D N A 片
段 , 其分子量大小分别为 6 k b和 3k b ( 结
果见图版 I 一 E ) 。
(三 )用互补 N do 一 突 变体功能的试脸
分离萦云英根抽菌结油基因簇
以 紫云 英 根 瘤 菌 不 结 瘤 突 变 株
( N o d
一
) 7 6 5 3 R + 1 (消除了共生质粒 )为受
体, 紫云英根瘤菌 7 6 5 3 R基因文库 ( C 6 0 0 )
为供体 , 以 p R K 20 1 3 ( L E 3 9 2) 为协助转移
质粒 , 进行三亲交配后得到的所有接 合转
移子 , 用无菌水洗下并混合在一起接种紫
云英植株 。 在无氮植物营养液紫云英琼脂
栽培管中 , 10 管有 9 管结瘤 , 7 6 5 3R 正
对照有4 / 5管结瘤 , 7 6 5 3R + 1 负对照 5 管
都不结瘤 (结果见图 3 ) 。 从接合转移子所
结的根瘤中分离并纯化根瘤菌 , 检测该根
瘤菌是否具有四 环 素 抗性 。 实验结果表
明 , 分离的 菌 株 都 具有四环素抗性 。 按
H jr sc h ` ’ “ ’ 的 方 法 分离质粒并作电泳检
测 , 表明从瘤 中 分 离 出的根瘤菌增加了
一个 50 k b 左 右 的质粒 , 该 质粒定名为
p R a z l s (图版 I 一 F ) , 含该质粒的根瘤菌
定名为 R 15 。 在图版 工一 F中的 1 号样品 ,
其 p aR Z 15 质粒也呈现多条带现象 , 我们
认为也是由于碱解法引起的质粒多聚体。
这种多聚体不影响转化和酶切 , 酶切后多
聚体完全消失 。 我们将 p R a Z 15 质粒的抽
提物转化 E 。 co lI’ H B 1 0) , 在含四环素的
L B培养基 ( 1 5“ g /叫 )上筛选转化子 , 然后
从转化 子 中 分离 , 制备质粒 D N A , 用
E co R I进行完全酶切 。 结果表明重组质粒
p R a Z 15 除含有载体p L A F R I质粒D N A带
( 2 1
.
6 k b) 外 , 还含有 7 条外源 D N A酶切
带 , 累计外源 D N A 片 段 的 分 子量 约为
2 5 k b( 结果见图版 工一 G ) 。 通 过进一步的
植物试验证明 , 该片段具有恢复紫云英根
瘤菌不结瘤突变 株 7 6 5 3 R + 1 在紫云英植
株上的结瘤功能 。 7 6 5 3 R + 1是 一 株消除
了共生质粒的突变株 , 因此试验表明该片
段 含 有 完 整 功 能 的 结 瘤 基 因 簇 (或
7 65 3R + 1原 丢 失的共生质粒上的结瘤基
因簇 ) 。
今 考 文 献
二x 〕 Ch e n , H . K . e t a l . : 5 0葱1. S e 玄. , 5 1 , 2 9 1一 2 9 3 , 19 4 4 ·
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〔 3〕 范云六 : 土壤通讯 , 3 : 弓4一峨6 , 1 9 6 0 .
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( s 〕 F r i e dm a n , A . M . e t a l . : G e n e , 18 : 2 5。一 2日6 , 1 05 2 .
〔 。 〕 M a , Q 。 5 . e t a l . : M o l . G e ” . G e ” t . , 1 8 7 : 1 6 6一 27 2 , 2 0 5 2 .
〔10 〕 M a n i a t i s , T . e t a l . : M o le e u la r C l o n i n g : A L a b o r a t o r 了 M a n u a l , C o ld Sp r i n g H a r b o r L a b o r a t -
o r y
,
N e 可 OY r k
, 2 05 2
.
〔1 2〕 P “ h l e r , A . e t a l . : A d v a n e e M o l e e u l a r G e n e t i e s , SeP r i皿 g一 V e r la g B e r l in H e i d e l b e飞 , 即 . 1 0 0一
2 0 1一 1 9 8 4 .
〔12〕 oB e h r i n ge r , M . : B i o e hem i e a l s f o r M o le c u la r B io lo g了 , Ed s : B o e h r i n ` e r M “ n n h e im G m b H 一 B io c -
hem i
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P r i刀 t e d in W e s t e r eG恤 a n y , p . 1 2 , 1 05 7 .〔25〕 H ir s e h , P 。 R . : J . G e ” . M ie犷 o b乞0 1. , 1 20 : ` 0 3一` 12 , 1 05 0 。
〔 14〕 1· o n g , 5 . R . e t a l . : N a t u r e , 2 9 8 : 4 5 5一 4 5 5 , 19 5 2 .
C o n s t r u c t i o n o f G e n e L ib r a r y a n d Is o l a t i o n o f
C o n t a i n i n g C o m P l e t e N o d u la t i o n G e n e s
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T o t ia D N A P a r t i a l l y d ig e s t e d b y E e o R I w a s P r e P a r e d f r o m R h i z o b f
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( P R a Z 1 5 ) e o n t a in in g e o m P l e t e s e t o f n o d g e n e s
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P R a Z 1 5 w a s d ig e s t e d
c o m P l e t e l y b y E e o R I
, 2 5k b D N A i n se r t s o n P L A F R I w e r e o bt a i n e d
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K e y w o r d s
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3期 张忠明等 :紧云英根瘤菌基因文库的构建及含完整结瘤基因的重组质粒 pR az 15的分离 2 19
田 版 说 明
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o n o f P l a te
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. 醉连结果 I d e n t l f i e a t i o n o f l i g a t i o 。
1 . F
o r e i g n DN A f r
o g m e n t s ( 2 0一 3 o kb ) , 2 . I J i g吕 t e s o f E c o R I 一 d i ge s te d PL A F R I a n d f o r e i g n
D N A
, 3 . 入 D N A ( ~ s o k b ) , 遨 . E e o R I一 d i g e s t e d p L A F R I D N A ( Z I . e k b ) .
B
. 四环素抗性克隆质粒检侧的电泳图谱
E le e t r o p h
o r e t o g r a m
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f d e t e
e t e d p l
a洒 i d o f t e t r a e了c l i n e er s i s t a n ce e l o n e s
1 . V e
e t o r p L A F R I p la sm i d
, 2
.
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r e s is t a n e e e l
o n e S
C
. 六株不 同重组子 D N人的醉切 鉴定
I d e
n t i f i e a t i o n o f E
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R I d i罗 s t e d p a t t e r n s o f 6 d i f fe r e n t r e e o m b in a n t s
1
.
p R a l /E
c o R I D N A f r a g m e几 t s , 2
.
p R
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R I D N A f r a `口 e n t s ,
3 . p R
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e o RI D N A f r a g m e n t s , ` . p R a ` / E e o R I D N A f r a gm e n t s .
5
.
p aR s / E
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R I D N A f ar 脚。 n t s , 6 . p R a 6 /E e o R I D N A f r a脚 en t s ,
7 . p L A F R I /E
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RI D N A f r铭 m e n t芝; , 5 . 入 D N A / E e o R I D N A m o le c u la r w e ig il t m a r k e r ,
9。 A D N A
D
.
p Rm Z I质粒 的酶切鉴定
Id e n t i f i e a t i o n o f p Rm Z I P la s m i d d ig e s t e d w i th E e o R I
1
.
V e
e t o r p B R 3 2 5 / E
e o
RI D N A f r :堆m e n t , 2 . p Rm Z I/ E e o R I D N A f r铭 m e n t s ,
3 . 入 D N A / H i牡 d l D N A 口 o le e止一a : , W e i gh t m a r k e r
E
.
p Ra3 70 质粒 的醉切鉴定
I d e
n t i f i
e a t i o n o f r e
c o m b i n a n t p la s o i i d p P a s 了0 D N A d i g e s t e d w i t h E e o R I
r
.
E c o R I
一
d ig e s t e d v e e t o r p L A F R I D N A , 2
.
p R a 3 7 o p la sm i d D N A
,
3 . E
e o
R I
一
d i g e s t e d p R
a 3了0 D N A , 4 . 入 D N A / H i n d l D N A 口 o le e u la r w e ig il t 几 a r k e r
F
. 转移接合子中重组质粒的检测
D e t e e t i o n o f r e e o m b i n a n t p la s m i d 】n t h e t r a n s c o n j u g品 n t
2 . t r a n s e o n j
u g a n t s t r a i n R z s
, 2 . R h i z o b i u m le g u m i n o as r u m s t r a i n T s 3 K 3 ( c o n t a i n i n g 3
m ge
a p l
a
sm i d s M W
. ` 5 0 , 2 0 0 , 2 5 o k l〕 ) ; 3 . r e c i p i e n t s t r a i n 7 6 5 3 R + z ( c o n t a i n i刀 9 a m铭 a p la s -
. id r s ok b )
G
. 重组质粒 p R a Z x s 的 E c o R I酶切鉴定
I d e
o t i f i e a t i o n o f r e e o m b i n a n t p la 印 , i d p R a Z 1 5 d i g e s t e d w i t h E e o R I
2 . 入 D N A / E e o R I D N A f r a g m e n t s ( MW . 也 a r k e r ) , 2 , 3 . p R a Z 一5 / E c o R I D N A f r a砰e n t s ,
` . p L A F R I / E e o R I D N A f r a g m e n t ( 2 1
.
6 k b )
.
沂 声
张忠明等: 紫云 英根瘤菌基因文库的构建及含完整结瘤墓因的重组质粒
P R aZ 一 5的分离
图版 I
P l a tel
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