全 文 ：锥栗(C.henryi Rehd.& Wil s.)俗称榛子，是中国南
方栽培驯化最早、利用最久的经济林树种之一，主要分
布于中国南方亚热带地区，闽北及浙南山区种植较多。
锥栗果实多呈圆锥状，其果肉细嫩香甜，营养丰
富，富含淀粉、糖、脂肪、蛋白质、氨基酸，以及抗坏血
酸、胡萝卜素等[1]，深受消费者青睐。近年来大量药理试
验研究表明[2-3]，黄酮类化合物有降脂、抗血栓、抗氧化、
抗衰老、抗心率失常等作用，可广泛用于医药、食品等
行业，具有极广的开发应用前景。陈在新等[4]用分光光
度法测定了板栗黄酮含量，但锥栗果实的黄酮含量测
基金项目：福建省教育厅资助项目“锥栗空棚形成机理研究”（K02058）；“闽北锥栗种质资源开发利用研究”（J91014）。
第一作者简介：郑诚乐，男，1963年出生，中共党员，福建农林大学园艺学院副教授，副系主任，硕导，博士。兼任福建省园艺学会常务副秘书长，福建省
经济林协会副秘书长、专家组成员，福建省农科教结合协调领导小组专家组成员，福建省、福州市评标专家。长期从事果树教学与科研工作，对锥栗、柿
等落叶果树有较深入研究。先后主持或参加福建省科技厅、教育厅科研课题 15项，发表论文 20多篇，其中有关锥栗的论文近 10篇，出版论著 10部，
其中 1部为《锥栗板栗无公害栽培》。曾获得校优秀教师称号。通信地址：350002福建省福州市金山福建农林大学园艺学院，E-mail：zcl2003@126.com。
通讯作者：潘东明，男，1956年出生，教授，博士生导师，研究生处处长，长期果树栽培和果实采后生理、果树分子生物学等方面研究。主持国家支撑计
划课题 1项，福建省果茶重大专项 1项，享受国务院特殊津贴专家。许伟东，男，1971年出生，中共党员，硕士，高级农艺师，现在莆田市农业局工作。已
参加了省科技厅课题五个，主持或参加市、县科技局课题 10余个，获得 3个科研成果，发表论文 20多篇，合作出版论著 3部，曾获得县十大杰出青年
等荣誉称号。
收稿日期：2008-08-04，修回日期：2008-11-04。
正交试验法测定锥栗总黄酮含量技术研究
郑诚乐，许伟东，潘东明，吴宪志，邱伟琴，郭亚市
(福建农林大学园艺学院，福州 350002)
摘 要：【研究目的】建立锥栗果实总黄酮含量的测定方法；【方法】样品采用正交实验法，用乙醇浸提法
提取，以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法，在波长 509 nm 处测定锥栗果实总黄酮含量；【结果】锥
栗果实在 50%乙醇、固液比 1:4、浸提温度 70℃、浸提时间 6 h 条件下提取出的总黄酮含量最高，平均
值为 0.0727%，加样回收率为 94.3%，RSD 为 0.61%(n=6)；【结论】该试验方法简单，操作方便，可用于
锥栗黄酮含量的测定。
关键词：正交设计法；锥栗；总黄酮
中图分类号：S664.2，Q946-33 文献标识码：A
Determination Method on Total Flavonoids in Fruit of Castanea henryi
by Orthogonal Design
Zheng Chengle, Xu Weidong, Pan Dongming, Wu Xianzhi, Qiu Weiqin, Guo Yashi
（College of Horticulture, FAFU, Fuzhou 350002）
Abstract：【OBJECTIVE】To establish a method for determining the content of total flavonoids in fruit of
Castanea henryi. 【METHOD】The total flavonoids in Castanea henryi was distilled with ethanol and deter－
mined at 509nm by ultraviolet spectrophotometry with rutin as a standard control by orthogonal design.
【RESULTS】The results showed that at the conditions of 50% alcohol as solvent, S／L amount 1:4, 70 ℃ of
extraction temperature and 6 hours of extraction time, the average content of total flavonoids was as high
as 0.0727%. The recovery was 94.3% and the relative standard deviation was 0.61%(n=6).【CONCLU－
SION】The method is simple，rapid and accurate. It can be used for determining the content of total
flavonoids in fruit of Castanea henryi.
Key words: orthogonal design, Castanea henryi, flavonoids
中国农学通报 2009,25(01):128-131
Chinese Agricultural Science Bulletin
定方法尚未见报道。该试验首次采用正交实验法测定
锥栗黄酮含量，以期为锥栗的进一步开发利用奠定理
论基础。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
KQ-400DB型超声清洗器（昆山市超声仪器有限
公司）、BECKMAN高速冷冻离心机(美国 BECKMAN
公司)、HQ-60-Ⅱ型旋涡混合器（北京北方同正生物技
术发展公司）、TU-1810紫外可见分光光度计（北京普
析通用仪器有限公司）。
1.2 对照品及试剂
芦丁对照品(Sigma公司生产)；无水乙醇、亚硝酸
钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯。
1.3 试样
供试锥栗果实 2007年 9月 20日取自福建省建瓯
市水源乡 18年生嫁接树，品种为‘处暑红’。样品采集
后装入编织袋带回福建农林大学园艺学院果树生理实
验室，置于 -20℃冰箱中，测定前 1天取出置于 -4℃
下解冻备用。试验于 2007年 9~12月在福建农林大学
园艺学院果树生理实验室进行。
2 试验方法
2.1 正交试验设计
参考陈在新[4]、宋国斌[5]等的研究方法，采用乙醇
浸提法提取锥栗果实的总黄酮。在预备试验中，对提取
温度、乙醇浓度、固液比、提取时间等因素分别进行了
单因素筛选试验，即固定其他三个因素，对其中 1个因
素作大范围变化的试验考察，选出每个因素中较好的
3个水平，采用 L9(34)表安排正交试验，以总黄酮含量
为评价指标。正交试验因素与水平见表 1。
2.2 正交试验
2.2.1 总黄酮的提取方法 准确称取样品 2 g (精确到
0.0001g)于研钵中，研磨后，装入 10 ml离心管中，按正
交表设计中固液比的量分别加入不同浓度的乙醇，分
次洗涤研钵，洗涤液一并装入离心管中，再按正交表设
计的试验方案分别置于 50、60、70℃恒温水浴下间隙
振荡提取，样品提取后，放置冷却到室温（25~30℃），
以 10000 rpm离心 10 min，吸出上清液后，残渣再按正
交表的方案加入乙醇溶剂，涡旋混匀后，重复提取 3
次，合并上清液，定容到 25 ml，制成样品待测液。每个
样品 3次重复。
2.2.2 测定波长选择及标准曲线制备 精密称取经
120 ℃真空干燥至恒重的芦丁对照品 20 mg (精确到
0.0001 g)，60%乙醇 70℃水浴溶解并定容至 50 ml，作
为贮备液。精密吸取贮备液 0（空白）、0.5、1.0、2.0、3.0、
4.0、5.0 ml，分别置于 10 ml 容量瓶中，以 60%乙醇定
容，配成浓度分别为 0、20、40、80、120、160、200 μg/ml
的标准溶液。准确吸取上述溶液 1 ml于 10 ml离心管
中，分别加入 30%乙醇 5 ml、5%NaNO2溶液 0.35 ml，
摇匀放置 6 min后，加入 10% Al(NO3)3溶液 0.35 ml，
再摇匀放置 6 min，加 4% NaOH溶液 2.5 ml，摇匀放置
15 min后待测。
以上述空白为对照，在 400~700 nm范围进行扫描
标准曲线和样品待测液的最大吸收波长，发现在 509 nm
处出现最大吸收峰，故确定 509 nm为测定波长。
标准曲线待测液放置 15 min后，分别在 509 nm
处测定吸收度，得标准曲线：
C（μg/ml）=0.012A-0.0037(r=0.9996)。
2.2.3 样品测定 准确吸取 1 ml样品待测液，按制备标
准曲线的方法进行比色测定吸收度，计算总黄酮含量，
用 DPS软件进行 Duncan新复极差法方差分析。
2.2.4 精密度试验 按表 2试验号 6的样品处理方法，
制备样品待测液，精密吸取 1 ml，依标准曲线制备方法
测定黄酮含量，平行操作 6次，结果分别为 0.0724%、
0.0731%、0.0730%、0.0722%、0.0733%、0.0725%，平均
值 0.0727%，标准偏差 0.000445，平均偏差 0.0004，相
对平均偏差 0.5502%，RSD=0.61%。
2.2.5 加样回收率试验 精密称取已经干燥至恒重的芦
丁对照品约 1.4 mg (精确到 0.0001 g)，加入到 2 g样品
(精确到 0.0001 g)研磨，再按表 2试验号 6的样品处理
方法制备样品待测液，依标准曲线制备方法测定黄酮
含量，重复 6次，平均回收率为 94.3%。
3 结果与分析
3.1 试验结果
正交试验结果及方差分析见表 2和表 3。
3.2 分析
由表 2中的极差大小值可知，各因素影响顺序为
B>A>D>C，A3B3C3D2处理组合总黄酮含量最高，即温
度 70℃、固液比 1:4、提取时间 6 h、乙醇浓度 50%的处
理组合检测出的总黄酮含量最高；表 3方差分析结果
表明，各因素对试验结果均有显著影响，对试验结果都
达到极显著水平。
表 1 正交试验因素与水平
郑诚乐等：正交试验法测定锥栗总黄酮含量技术研究 129· ·
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表 2 正交试验结果表
4 讨论
4.1 温度对总黄酮提取量的影响
从试验结果可以看出，70 ℃水浴下提取效果最
好，这与陈在新等测定板栗黄酮的结果一致[4]。锥栗为
高淀粉类果实，淀粉含量 736.6~425.8 g/kg[6]，占果实的
47.58%~56.94%[7]，其淀粉颗粒属限制型膨胀淀粉[8]，颗
粒的溶解度和膨胀度较小，且随温度上升而增大，淀粉
膨胀度在 75℃时出现跃变，超过 75℃时迅速增长。试
验所确定的 70℃的提取温度既能保证一定的溶解度，
又不致于糊化，可以保证黄酮类物质的提取。
4.2 固液比对总黄酮提取量的影响
在提取过程中，若固液比过小使得原料不易浸透，
导致一部分总黄酮不溶解，影响提取效果；若固液比过
大，则浓度过低，须增加浓缩步骤，使提取过程变得更
加复杂，而且增加试验误差。
4.3 提取时间对总黄酮提取量的影响
浸提时间过短，总黄酮未能完全提取；时间过长，
影响提取效率。另一方面，在 70℃的浸提温度下，浸提
时间过长，有可能引起锥栗淀粉的糊化，影响总黄酮的
提取，而且提取时间太长，也会降低工作效率。所以，在
RSD和回收率基本满足需要试验的情况下，浸提时间
以 6h为宜。
4.4 乙醇浓度对黄酮提取量的影响
黄酮类化合物都含有 C-C-C的基本骨架[3,9]，其溶
解度依中间吡喃环的氧化水平和两侧 A、B环上连接
的取代基的不同而不同。试验得出乙醇浓度 50%的处
理组合检测出的总黄酮含量最高，这与陈在新等[4]报道
的 30%乙醇浸提得率最高的结论不完全一致，这可能
与两者总黄酮结构不同有关。
4.5 回收率问题
试验得出的加样回收率为 94.3%，可能与浸提时
的振荡频率有关，该试验所用的恒温水浴锅，缺少自动
振荡装置，仅每 30 mim人工振荡一次，可能存在振荡
不均现象，进而影响试验结果。
表 3 方差分析表(完全随机模型)
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5 结论
5.1 锥栗果实在 50%乙醇、固液比 1:4、浸提温度 70℃、浸
提时间 6h条件下得出的总黄酮含量最高。加样回收率
为 94.3%，RSD为 0.61%(n=6)。试验方法简单，操作方
便，可用于锥栗黄酮含量的测定。
5.2 试验得出的回收率为 94.3%，若采用振荡恒温水浴
锅，克服人工振荡不均的问题，效果可能会更好。
参考文献
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