全 文 ：紫云英根瘤菌 ni f D N A的分子克隆 .
金润之 江群益 沈思师 朱劲松 沈善炯
(中国科学院上海植物生理研究所 ,上海 2 00 0 3 2)
关链词 紫云英根瘤菌 、 克隆 p R a N , 35 、 固氮陇结构签因
固抓微生物中涉及到与固氮作用有关的基因的研究已有详细的报道山 .
共生固氮根瘤菌中参与固氮作用的基因有二类 ,一类是与肺炎克氏杆菌 K p in f 基因有同
源性的基因— in f 基因 ,另一类是在共生状态进行固氮作用所必需的其它基因— f ix 基因 .根瘤菌中 in f 与 f ix 基因中的任何一个基因发生突变 ,根瘤菌虽仍感染宿主发育成根瘤 , 但
不能固氮图。
快生型根瘤菌 , 如首蓓根瘤菌 ( R . m e l i l o r i ) , 豌豆根瘤菌 ( R . l e g “ 。 10 0 , a r , 。 ) 其共
生固氮基因位于巨大质拉上 , 且固氮酶结构基因连锁排列形成一个操纵子 slt . 而慢生型根瘤
菌 , 如大豆根瘤菌 ( B . 夕a户。 , i c u 。 ) 共生固氮基因位于染色体上 , n i f H 和 n i f D x 分成二个
不连锁的操纵子闭 .
豆科植物紫云英 ( A “ , 叮 。加 ; : 认“ , : ) 是生长于我国南方的重要绿肥之一 紫云英根瘤
菌 ( R . as tr og o il ) 感染紫云英后形成有效的固氮根瘤 . 对紫云英根瘤菌共生固氮的分子遗
传学研究在国际上尚未见有报道 ,也未引起注意 . 但是 ,在相当长一段时期内 , 对紫云英根瘤菌
究竟属于快生型还是慢生型众说不一我们期望通过对紫云英根瘤菌共生固氮基因的研究 ,有
助于解决这个向题 . 我们实验室已经证明了紫云英根瘤菌 R 。 1” 的共生固氮基因位于巨大
质拉上 (待发表 .)
本文报道了我们以 ” P 标记的 6 . 2 kb 的肺炎克氏杆菌 K p in f D N A (从质粒 sP A 30 分
离 )作杂交探针 ,从紫云英根瘤菌基因文库中分离带 in f D N A 的克隆并进行了杂交分析 .
一 、 材 料 和方 法
1
. 菌株 、 质粒和培养基 大肠杆菌生长于 L B 培养基 ( 37 ℃ ) , 固体培养加 L S务 琼脂
粉 , 液体培养置于旋转摇床 ( 1 SO r /m i n ) , 抗菌素在培养基中的最终浓度 : 抓霉素 ( C m ) 为
2 0产g /m l , 四环素 ( T e ) 为 2 0拌 g / m l -
H B 10 1 ( p
r 。 、 L e u 、 t h i 、 L a e Y 、 e n d o l 、 r e e A 、 h s d s 、 s t广 ) 用作质粒转化 的受体 .
p R a N 35 cT
, 是从紫云英根瘤菌基因文库分离到的含 in f HD K 片段的克隆 . p s j ls Cmt 系
包含紫云英根瘤菌 in f H D K 片段的重组质粒 . p s A 30 T cr 是含 K p in f H D K 片段的重组
质粒 , 由 A u s u b e l 赠送 〔习 , p SU P 2 0 5 C m , 、 T e , 由 S i m o n 赠送 6[ , .
2
.
D N A 片段的分离及限制性内切曲的作用 质粒 D N A 的分离及 D N A 片段从低
19 9 1一 0 6一 2 6 收稿 , 1 99 1一 1 1一 2 0 收修改稿
. 国家宜点科技欢关苍金资助项目
第 17 期 科 学 通 报 l ` 0 3
徽点琼脂精凝胶上的回收 , 按 M o in o it 。切 等人的方法进行 .
各种限制性内切酶均购自华美生物工程公司 , 反应按 N e w E n gl : dn iB 。 l 。 b: 公司所示
条件进行 .
3
. 连续反应及转化 T一 n N ^ 连接酶购自 N e w E n g l a n d B i o l a b。 公司 , 并按其方法
进行连接反应 . 转化按 D a g er t 和 E nr il 。 hl 目 方法进行 .
4
. 杂交 a 一 ” P d A T P 购自 A m e r s ha m 公司 。 缺口 翻译按 iR g .b} gt] 方法进行 。 D N A
探针比活性为 , x 1 07 cP m /产 9 . 原位杂交按 M an ia it : m 等人的方法进行 . 限制性内切酶作
用后 O N A 片段与 ’午 标记的 D N A 探针杂交按 s ou t h er n叫 方法进行 . 滤膜在 3 x s C ,
及 , x D en ha dr st , 溶液中 65 ℃ 预杂交 3 h , 然后加人热变性的杂交探针 ,在 65 ℃ 杂交 2 h4 。
杂交后滤膜用 1 x s C 和 1% s D s 洗 3 一 4 次 , 放射性自显影用上海感光胶片厂生产的 X
光片 , 在一 70 ℃ 暗盒压片 1一 , 天后冲洗底片 .
二 、 实 验 结 果
1
. 簇云英根自 , 固抓曲结构甚因克隆的分离 我 们 于 1 9 8 9年叨用野生型紫云英根瘤
(
一 ) P Ra N 3,
衣 R R R R R R R
` 一一一 , 一一一 , 一了甲一一一` 书一一一一尸一一一 一一 , - , 习H B B g B H B B H B B B
` ~ ~ ~ ~ - ~ - - - ~ 一一 ~一曰一 J P S J l l~ P S J12 I k b.-曰
A 3 A
` 一 - ~一一一 J A么l一一~一一 - -曰 A In让 11 n ifD n if K K p遗传图进,. I k b ,
图 l 紫云英根瘤菌和肺炎克氏杆菌 in f D N A 之间同源关系
。 ) p S J ! , 的限制性内切酶图谱 : B— B a m H I , H e— H i n e l l . H d— H i n d l l l , p一 p . t l二 g— B` 111 .( b ) p SA 3 o 所拼带的 K p n i f 片段的物理图讲 : A I-一 2 . g k b , A Z— l . s k b , A 3 ^ — l . x k b . A 3 B— 0 。 7 4 k b
菌 R al 59 的总 D N A 经 E . co h 部分酶解连接于广谱性可转移的 C O S 质粒 , L A F IR . 经
体外包装而 构建成紫云英根瘤菌基因文库 .
基于编码固氮酶的结构基因 in f H D K 在进化过程中的保守性 , 我们以 ” P 标记的 6 . 2 kb
盆` 0今 科 学 通 报 1 9 9 2 年
肺炎克氏杆菌 Kp ni f D N A(重组质拉 p s A3 o插人有 Kp ni f H n K片段 ,经 E e o R z 醉娜
后分离 6 . k2 b K p in f H D K 片段 )作杂交探针 , 经原位杂交从紫云英根瘤菌基因文库分离得
到一株能与探针进行杂交的克隆 p R a N 3 5 . 提取克隆 p R a N 35 D N A 经多种限制性 内切醉
作用及亚克隆分析 ,制作了克隆 p R a N ” D N A 的物理图谱 , 如图 1 ( 。 ) 所示 . 其长度为 32 . `
k b
. 同时以 ” P 标记的 6 . 2 k b K p n i f D N A 作探针分别与 p R a N 3 5 D N A 的 E e o R I 酶解物 、
p R a N 3 , n N A 的 B : m H I 酶解物进行滤膜
杂交 。 结果 (图 2 )表明 p R a N 3 5 D N A一 E e o R I
酶解物中的 1 . s k b 和 1 . 3k b 能与 探针 杂
交 . p R a N 3 5 D N ^ 一 B a m H I 酶解物中的 4 . ,
k b能与探针杂交 .为便于进一步精确的分析 ,
我们将 p R a N ” D N A 中能与探针杂交 的
4
.
g k b B a m H I 片段经 .T 一 D N A 连接酶的作
用连接到质粒 p s U P 2 0 5 的 B a m H I 位点 ,
转化 E . 。 0 11 H B 10 z , 选择 C m , 、 T c ` 的转
化子 . 经 电泳鉴定得到了在质粒 p S U P ’ 2 05
的 B a m H I 位点插人有 4 . g k b B a m H I 片段
的重组质粒 p s J I , , 并制作了 p s j ls 的酶
切图谱 , 如图 1 ( a ) .
2
. 紫云英根右菌 n i f H 、 n i f D 、 n i f K 连
续排列 从质粒 p S A 30 分离得到的 .6 2 k b
K P n i f H D K 片 段经 B a m H I 一 H i n d l l l 双
酶解可分离得到片段 A l 、 A Z 和 A 3 . 片段
3A 经 B gl l , 酶解分离得到片段 A 3 A 和 里三速隆 p!-’.v 竺乡吵妙匆醒酶解馋鲍珍些. _ _ -一 厂二 _ 一 ” ” - - . - . .一 “ _ ’ _一 _一 二 _ 一 ’ 一 箱凝胶电泳 、 A ) 及与 ’ 甲 标记的 K p “ “ D N A杂交
3A B
. 其中片段 A l 含 K p in fE 的 , ` 端及 ’ - - -一“ 瘫射自显泳函反B )’ ` ~ 一n i f K 的 3 ’ 端 . 片段 A Z 含 n i f K 的 5 ` 端及 , · 汽D N ^ 经 H i n d l l l 酶解 , 中1 7` n N ^ 经 H a e川 . 解
n i ,。 的 , , 端 . 片段 A 3 A 含 。 i f n 的 , ,端 2 . , R。 N 3 , 。 N ^ 一 E昆黔霏黔 ’
及 n i f H 的 3 ’ 端 . 片段 A 3 B 含 n i f H 的 3 · p R a N 3 5 D N ^ 一 B . m H一 酶解物 ,
5
’端 (见图 l ( b ) ) ·同时从 p s J 15 n N A 分离 咭· ` · Z k b K p n i f H D K (来自 p s ^ 3 0 )
4
.
g k b B a m H I 片段 , 分别以 H i n e l l 、 H i n e l l 和 H i n d l l l 、 H i n e l l 和 P s t l 等限制性内切酶
作用 , 电泳后将 D N A 带转移到硝酸纤维素薄膜上 , 然后分别以片段 A I 、 人 2 、 A 3 A 和 A 3B
作探针进行杂交 . 放射性自显影结果 (图 3 、 4) 表明 : 片段 人 1 作探针能与 1 . 2 , k b aB m H I -
H i n c l l 片段 、 o . s k b H i n e l l 片段进行杂交 (其中 1 . 2 5 k b 片段经 P s t l 酶解成 0 . s z k b B a m H I
P s t l 片段及 0 . 7 3k b p s t卜 H i n e l l 片段均能与 A x 探针杂交 ) . 片段 A z 作探针能与 l . 6k b
H i n o l 片段进行杂交 . 片段 A 3 A 作探针能与 1. 3 k b H in 。 1 片段进行杂交 . 片段 A 3 B作
探针能与 l . 3 k b H i n c l l 片段及 0 . 2 5 k b H i n c l l一 Ba m H z 片段进行杂交 (其中 z . 3 k b Hi n e l l 片
段经 H i n d l l l 酶解成 z 条同样大小的 o . 6 5 k b H i n c一I一 H i n d l l l 片段 , 能与 A 3 A 、 A 3 B 探针
杂交 ) 。 上述簿膜杂交结果清楚地显示了 4 . gk b B : m H I 片段中与 K p in f H 、 in f D 和 in f K
之间的专一性同源区域 (见图 3 ) . 表 明了紫云英根瘤菌 R al ” 的 in f H D K 类似于 K p in f
H D K 是连续排列的。
第 ” 期 科 学 通 报 l ` 0 ,
图 3p j l s, 的 4 . gk b .B 二 H I 片段经限制性内切酶
酶解的琼脂抢凝胶电泳 ( A ) 及与 ’甲 标记的 K p o if
片段 ^ l ( B ) , A Z ( c ) 杂交的放射自显影图
-— 又D N A 经 H i n d xl x 醉 , 巾一7` D N A 经 H a o l l l 酶解后的片段作标准 , 2— 4 . g k b B o m H I 片段的 H i n e l一酶解物 , 3— 今. , k ` B a m H I 片段的 H i n e l l /H i n d一11酶解物 ,4— 令 . g k b B。口 H 一 片段的 H i n c l l l P . t l 酶解物 , ,—片段 ^ l , `— 片段 ^ 2
图 峪 p s j l s 的 呼 . g k b B一m H I 片段经限制性内切酶
酶解的琼脂搪凝胶电泳 ( A ) 及与 ” P 标记的 K p 成 f
片段 A 3 A 、 B ) 、 A 3 B ( C )杂交的放射性自显影图
1— 久D N A 经 H i n d l l l 酶解 , 中一7乌 D N A 经 H一 e l l l 酶解后的片段作标准 , 2— 二 g k b B a m H I 片段的 H i n e l l酶解物 , 3— 4 . , k b B a m H I 片段的 H i n e l l l H i n d l l l酶解物 , `— 4 . g k b B a m H I 片段的 H i n e l l l P . t l 酶解物 , 5— 片段 A 3 A , 6— 片段 A 3 B
三 、 讨 论
目前已经知道的固氮微生物大约有 3 0 多种 ,分属于不同目 、科 、 属 . 它们在各自特定的
环境条件下进行固氮作用 . 但它们的固氮酶反应装置却非常相似 , 由钥铁蛋白和铁蛋白组成 ,
而且不同来源的固氮酶组分可互补 . 近年来对各种来源的固氮酶结构基因 in f H D K 的 D N A
序列分析表明其 O N A 序列有高度同源性 . 这些事实表明编码固氮酶的结构基因在生物进化
过程具有保守性 . 因此 , 可以用肺炎克氏杆菌 K p in f H D K 作杂交探针来检定或克隆其它固
氮微生物的 n i f 结构基因 . 我们以 ’ l p 标记的 6 . 2 k b K p n i f D N A (从 p s A 3 0 分离 ) 作探
针从紫云英根瘤菌基因文库中分离到含 in f 片段的克隆并证实紫云英根瘤菌 R o l ” 的 in f
H D K 是连续排列的 。 我们实验室也已经检定出紫云英根瘤菌 R al ” 具有 2 个巨大质拉 ,共
生固氮基因位于其中 1个巨大质粒上 . 这些事实表明了紫云英根瘤菌 R a l” 与首信根瘤菌 、
豌豆根瘤菌等快生型根瘤菌相类似 .
参 考 文 献
[ 1 ] M
e r r i e卜, M · , i n N i’ go , , iF 二 r i o 口 : 价“ r o d Y o a 。 刁 Ir。 ( Ed s . B o t h e , H . a n d d e B r u ii n . F d s . ) . F i s e h o r .
t g a r r l , 8 8
,
2 9 3一 3 0 2 .
B a t u t
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J
.
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,
M o l
.
C 口二
.
C 亡 n o t , 19 9 ( l , 8 5 )
, 2 3 2一2 3 9 .
S e卜e t g e n : R . M . p . e t a l . , M ol . G亡二 C e ” 。考 , 20 0 ( 19 85 ) , 3 6 8一 37 4 ·
A d , m 。 , T , H . e r . 1 . , J . 习“ ,。 r io l , 1 5 9( 19 8 4 ) , 8亏7一 8 6 2 .
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o n o 。 , F . C . , R i e d e l , G . E . , A皿u b e l , F M · , M o l . G 。 。 . G e o e r , 1 7 4 ( 1 97 9 ) , 5 9we 6 6 .
S i m o n
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D . g e r t
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M
· ,
Eh r l ic ` , S . D , G , . ` 叹 19 79 ) , 23一 2 8 .
R ig b y
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P
·
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. ,
J
. 封。 1. 系口 l , 1 13 ( 19 7 7) , 2 3 7一 2 5 5 .
S o u t h e r n
.
E
.
M
. ,
J
.
M o l
.
B iol
,
9 5 ( 19 7 5 )
.
50 3一 5 0 8 .
周宗汉等 , 科学通报 , 翻 ( 19 8 9 ) , 峪: 3 0 ,一 3 o a .
S t u卜
月3],]61518:0
1 6 0` 科 学 通 报 1 9 9 2