全 文 :*基金项目:陕西省中医药管理局资助项目(2005079)
椒目中 α-亚麻酸的提取与鉴定*
杨 倩 ,王四旺 ,王剑波 ,谢艳华 ,刘 喆 ,孙纪元 ,缪 珊 ,苗 青
(第四军医大学药学系药物研究所 ,西安 710033)
[摘要 ] 目的:从花椒的种子即椒目中分离和纯化 α-亚麻酸 ,鉴定化学结构并进行含量测定 。方法:椒
目粗粉采用皂化 、酸化 、梯度冷冻 、尿素包合及硝酸银络合等步骤分离和纯化不饱和脂肪酸 ,并用 HPLC测定
α-亚麻酸含量 ,鉴定结构 。结果:提取样品中 α-亚麻酸的含量为 91.6% ~ 95.2%;结构为 9, 12, 15-十八碳三
烯酸(z, z, z-9, 12, 15-octadecatrienoicacid),全顺式 ,非共轭立体构型 ,分子式为 C18H30O2。结论:本研究从废
弃资源椒目中提取分离得到高纯度 α-亚麻酸 ,因此 ,椒目是 α-亚麻酸的良好资源。
[关键词 ] 椒目;α-亚麻酸;亚油酸
[中图分类号 ] R284.1;R344.7 [文献标识码 ] A [文章编号 ] 1003 -3734(2008)04 -0318 -03
Studyonextractionandidentificationofα-linoleicacid
fromSemenZanthoxyliBungeani
YANGQian, WANGSi-wang, WANGJian-bo, XIEYan-hua, LIUZhe,
SUNJi-yuan, MIAOShan, MIAOQing
(InstituteofMateriaMedica, SchoolofPharmacology, TheFourth
MilitaryMedicalUniversity, Xian710033 , China)
[ Abstract] Objective:Toextractandpurifyα-linoleicacidfromtheseedsofPericarpiumZanthoxyliBun-
geani, vizSemenZanthoxyliBungeani, toidentifythechemicalconstitutionanddeterminethecontents.Methods:
SemenZanthoxyliBungeanicoarsepowderwasprocessedbysaponification, acidification, gradientfreezing, urea
clathrationandbecomingargentnitratecomplex.Finaly, thehighlypurifiedα-linoleicacidwasobtained.Thecon-
tentswereassayedbyHPLC, andthestructurewasidentified.Results:Thecontentofα-linoleicacidwasinthe
rangeof91.6% ~ 95.2%.Thestructurewasidentifiedtobez, z, z-9 , 12 , 15 octadecatrienoicacid.Theformula
wasC18H30O2.Conclusion:Thepureα-linoleicacidwasobtainedfromSemenZanthoxyliBungeani.SemenZan-
thoxyliBungeaniisanewresourceofα-linoleicacid.
[ Keywords] SemenZanthoxyliBungeani;α-linoleicacid;linoleic
椒目为芸香科植物青椒(Zanthoxylumschinifoli-
umSieb.etZucc)或花椒 (Zanthoxylumbungeanum
Maxim)的干燥成熟种子 [ 1] 。 20世纪 90年代对花椒
子的研究发现其种仁油脂中含 α-亚麻酸 17% ~
24%[ 2, 3] 。 α-亚麻酸为人体必需脂肪酸 , 其在人体
内不能自身合成 ,必须从体外摄取 。α-亚麻酸在体
内参与磷脂的合成 ,并代谢转化为人体必需的二十
碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸 (DHA)。 α-亚
麻酸及其代谢物具有益智 、保护视力 、降血脂 、降血
压 、抑制血小板凝聚 、抗血栓形成 、延缓衰老 、抗过敏
及抑制癌症的发生和转移等作用[ 4] ,在医药 、保健
品等领域有广阔应用。
α-亚麻酸的缺乏是导致老年痴呆 、癌症 、心脑血
管疾病 、高血压 、高血脂 、糖尿病等疾病的重要诱因。
医学和营养学专家根据人群膳食结构的流行病学调
查证实 ,人类普遍缺乏 α-亚麻酸 ,日摄入量不足世
界卫生组织推荐量(1.25 g)的一半。对此 ,联合国
粮农及世界卫生组织联合发表声明指出 “鉴于人
类普遍缺乏的现状 ,需要在世界范围内推广 α-亚
麻酸” [ 5] 。 α-亚麻酸不能人工合成 ,但全球每年养
生保健 、食品及医药市场对高纯度 α-亚麻酸原料
的需求量超过 2千吨 。椒目中天然富含椒目仁油
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约 10%, 经分析发现其中 α-亚麻酸含量约占
28% ~ 33%[ 6 ~ 8] 。椒目因其是花椒的种子 ,仅中
国境内每年约有 12万吨新增资源被废弃。因此 ,
开发提取椒目中 α-亚麻酸的有效方法不仅可以最
大限度的开发和利用自然资源;同时也能为医药 、
保健品市场提供急需的原料 ,为提高人类健康水
平做出贡献 。
材 料
Waters2996型高效液相色谱仪 , 2996型二极管
阵列检测器 (美国 Waters公司 );低温反应器
(DLSB 5/20,上海 FLUKO公司);Bruker AV500
型超导核磁共振谱仪(上海纽迈电子科技有限公
司)。电热套(上海华岩仪器设备有限公司 ZDM调
温恒温电热套)
椒目购自陕西省韩城市 ,经陕西省药检所鉴定
符合《山东省中药材标准 》2002年版第 181页椒目
项下有关规定。 α-亚麻酸标准品 (批号:111631-
200502;美国 Sigma公司);乙腈 ,色谱纯(TEDIA);
硫酸 、氢氧化钠 、石油醚 、乙醇 、硝酸银 、无水硫酸镁
等均为分析纯。
方法与结果
提取分离方法
1.1 皂化 、酸化 取椒目 ,粉碎过 60目筛 ,称取
100g,加入 2倍量的 5%氢氧化钠水溶液 , 65℃可控
的电热套加热 1 h,过滤得煎煮液 。同法操作 2次 ,
合并煎煮液 ,缓缓滴加 50%的硫酸 ,调节溶液 pH值
到 2.0,分离出油层 ,用水洗至中性即得椒目仁混合
脂肪酸 63g。
1.2 梯度冷冻 给混合脂肪酸中加入 63 mL的
95%乙醇 , 0 ℃冷冻 6 ~ 8 h后快速过滤。滤液冷至
-5 ℃继续冷冻 6 ~ 8 h,过滤 。用适量预先冷冻的
95%乙醇冲洗滤渣 ,合并滤液 、回收乙醇后得到脂肪
酸粗产物 47mL。
1.3 尿素包合 [ 9, 10] 取尿素 47 g在 65 ℃的加热
回流条件下溶解于 94 mL的 95%乙醇中 ,加入冷
冻后的脂肪酸粗产物 (油∶尿素 =1∶1)中 ,充分混
匀 ,依次在 3 ℃ ~ 5 ℃, -6 ℃, -12 ℃下分别冷冻
6 ~ 8 h,快速过滤 ,用适量 95%乙醇冲洗 , 滤液蒸
去乙醇后用水洗 3次 ,以石油醚萃取滤液 。石油
醚层加无水硫酸镁振摇 5 ~ 10 min,过滤 ,滤液蒸去
石油醚 ,得 31 g混合脂肪酸 ,产物绝大部分为不饱
和脂肪酸 , 其中 α-亚麻酸约为 50%, 亚麻酸约
50%。
1.4 硝酸银络合[ 11] 将尿素包合后的混合脂肪酸
与 31 mL浓度为 4 mol·L-1的硝酸银溶液在低温
(0 ℃)下混合 ,搅拌 ,分取硝酸银层 41 mL,以 20 mL
石油醚(沸点 60 ~ 90 ℃)萃取。取醚层 28mL,重复
络合 3次 ,合并醚液 70 mL,蒸去石油醚 ,得 α-亚麻
酸 8 g。
含量测定
采用 HPLC测定 α-亚麻酸含量。标准品及样
品的制备方法:将标准品及样品溶解于乙腈 -1%
乙酸溶液 (90∶10)的溶液中 (浓度范围:19.7 ~
91.3 mg·L-1 )。色谱条件:ZORBAXExtend-C18
(200 mm×4.6 mm, 5 μm);流动相为乙腈-1%乙酸
溶液 (90∶10);检测波长为 205 nm;流速为 1.0
mL·min-1;柱温25 ℃;进样量 20 μL。标准曲线 Y=
6.118 ×104C+1.034 ×104 , r=0.999 7。测得产物
中 α-亚麻酸含量达 91.6% ~ 95.2%。所得 α-亚麻
酸与对照品及空白样品经比较色谱保留时间相同 ,
见图 1, 核磁共振氢谱 、碳谱及质谱也与文献报
道[ 12]一致。
1为 α-亚麻酸(tR =6.036min)
图 1 α-亚麻酸样品含量测定的典型 HPLC图
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鉴定结果
13CNMRδ:180.43(C1);134.13(C2);131.85
(C9);130.14(C16);128.26(C12);128.22(C13);
127.80(C15);127.16(C10 );29.62 (C6);29.21
(C7);29.13(C5);29.09(C4);27.23(C8);25.65
(C14);25.56(C11);24.69(C3);20.56(C17);14.26
(C18)。1HNMRδ:11.4(br, s, 1H, -COOH);5.3 ~
5.4(m, 6H, -CH-CH-, C9, 10, 12, 13, 15, 16);2.8(t, 4H,
CH2 , CH2 , C11, 14);2.35(t, 2H, CH2 , C2);2.06(m,
4H, CH2 , C8, 17 );1.63(5重峰 , 2H, CH2 , C3);
1.32(m, 8H, CH2 , C4, 5, 6, 7 );0.98(t, 3H, CH3 ,
C18)。MSm/z:278(M);279(M+1);261(M-17),
羧酸的特征;41, 55, 67, 79, 95烯烃裂解 。
讨 论
椒目中的脂肪酸主要以脂的形式存在 ,少量以
游离形式存在。因此 ,本实验直接采用碱水煎煮提
取 ,酸中和得混合脂肪酸 。经与传统提取油脂的水
蒸气蒸馏 、有机溶剂提取及 CO2超临界萃取等方法
进行比较 ,证实本方法有利于工业化生产 ,且出油率
较高。试验中根据脂肪酸凝固点的不同 ,使用梯度
冷冻除去蜡质 、部分饱和脂肪酸及部分单或双不饱
和脂肪酸等物质 ,以减少后续实验中尿素的用量 ,并
提高尿素包合的效率 。尿素可与混合脂肪酸中的饱
和及单不饱和脂肪酸在低温下形成稳定的晶体包合
物 ,从而 ,可达到与多不饱和脂肪酸分离的目的 [ 9] 。
但尿素也可将部分不饱和脂肪酸包合 ,所以使用油
与尿素的比例并非尿素最高包合量 ,目的是减少 α-
亚麻酸的损失。尿素包合后的产物主要是亚油酸和
α-亚麻酸 ,根据银离子可以与双键形成不稳定络合
物的性质以及与亚油酸和 α-亚麻酸形成络合物的
优先顺序不同 ,用硝酸银可以将亚油酸和 α-亚麻酸
进行有效分离。实验中发现硝酸银溶液浓度低时 ,
仅有很少的 α-亚麻酸进入水相 ,当硝酸银水溶液浓
度较高时络合效果较佳。由于络合反应是放热反
应 ,故络合时应在低温环境下操作;本试验综合了多
种方法提纯得到高纯度 α-亚麻酸。
此外 ,本课题组已对从椒目中提纯的 α-亚麻酸
进行了药理活性研究 ,结果表明源于椒目的高纯度
α-亚麻酸及其 50%混合不饱和脂肪酸(即 α-亚麻
酸 /亚油酸 =1 /1)能显著延长小鼠出 、凝血时间
(P<0.01);明显降低胶原蛋白-肾上腺素诱发性肺
动脉栓塞小鼠的死亡率(P<0.01);显著抑制血小
板在动-静脉旁路中丝线上的沉积和大鼠体外血小
板聚集。具体研究方法和数据以及更多的药理作用
将另文报道。
本研究从椒目中分离得到高纯度的 α-亚麻酸
91.6% ~ 95.2%。椒目是人们生活中十分喜爱的调
味品即花椒的种子 ,而花椒在全世界有着极广泛的
分布 。所以 ,椒目作为有益于人类健康的不饱和脂
肪酸食药原料资源被开发和应用 ,其重大意义不仅
仅在于废物利用 ,还在于提高人类生活质量 、有利于
自然环境及生态平衡。
[作者简介 ] 杨倩(1984-), 女 , 硕士研究生。联系电话:
(029)83224790, E-mail:liu lianger@163.com。
[通讯作者 ] 王四旺(1958-), 男 ,教授 ,博士生导师 , 主要
从事天然药物研究。联系电话:(029)83224790, E-mail:wan-
gsiw@fmmu.edu.cn。
[ 参 考 文 献 ]
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编辑:周卓 /接受日期:2007-10 -23
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