全 文 ：基金项目:辽宁省自然科学基金资助项目(编号:2014021038)
通讯作者:孟繁浩 Tel:13386887639 E-mail:fhmeng@ cmu． edu． cn
葎草中黄酮类成分的分离鉴定及对 HepG2 细胞的抑制作用
陈再兴1 祝妍1 王星1 张美侠2 孟繁浩1 (1． 中国医科大学药学院 沈阳 110001;2． 中国医科大学代谢病分子
机制与药物研究所)
摘 要 目的:对葎草中主要黄酮类化学成分进行提取分离，并检测其对 HepG2 细胞的抑制作用。方法:乙醇提取葎草后，
采用柱层析技术分离纯化提取的有效成分，并通过光谱法分析鉴定化合物结构。采用台盼蓝染色法检测葎草中木犀草苷
(LGL)和大波斯菊苷(AGL)对 HepG2 细胞的抑制作用。结果:葎草中的主要黄酮类成分为木犀草苷和大波斯菊苷。台盼蓝
实验结果显示，当 LGL和 AGL的浓度由6． 25 μmol·L －1升到100． 0 μmol·L －1时，LGL对 HepG2 细胞增殖抑制率由28． 8%上
升至95． 2%，AGL对 HepG2 细胞增殖抑制率由3． 6%上升至21． 3%。结论:木犀草苷对 HepG2 细胞生长具有明显的抑制作
用，且呈剂量依赖性，而大波斯菊苷对 HepG2 细胞生长抑制作用不明显。
关键词 木犀草苷;大波斯菊苷;细胞毒作用
中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-049X(2016)02-0267-04
Separation，Identification and Inhibitory Effect on HepG2 Cells of Flavonoids from Humulus Scandens
Chen Zaixing1，Zhu Yan1，Wang Xing1，Zhang Meixia2，Meng Fanhao1(1． School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang
110001，China;2． Institute of Metabolic Disease Research and Drug Development，China Medical University)
ABSTRACT Objective:To extract，separate and identify the flavonoids in Humulus Scandens and detect their cytotoxic effect on
cells HepG2． Methods:After Humulus scandens bing was extracted by alcohol，luteolin-7-O-β-D-glucoside (LGL)and cosmoiin
(AGL)were obtained by using column chromatography and identified by spectral analysis． The inhibitory effects of LGL and AGL on
HepG2 cells were detected by a typan blue dye method． Results:The main flavonoids in Humulus Scandens were LGL and AGL． When
the concentration of LGL and AGL was increased from 6． 25 μmol·L-1 to 100． 0 μmol·L －1，the inhibition rate of LGL was increased
from 28． 8% to 95． 2% and that of AGL was increased from 3． 6% to 21． 3% ． Conclusion:LGL has notable inhibitory effect on
HepG2 cells in a dose-dependent manner，while the inhibitory effect of AGL is not obvious．
KEY WORDS Luteolin-7-O-β-D-glucoside;Cosmsiin;Cytotoxicity
中药葎草为桑科植物葎草 Humulus scandens．
(Lour．)Merr．的全草，味甘、苦，性寒，具有清热解
毒，利水消肿之功效［1］，是一味具有悠久历史的草
药。葎草生命力极强，能适应多种土壤质地和气候
条件的生态环境，而且资源非常丰富，在民间广泛应
用。葎草中含有多种黄酮类化学成分，该类成分具
有多种生物活性，如免疫激活、抗氧化、酶抑制剂、激
素样作用、抗病毒等，也能抑制肿瘤的生长［2］。因
此本实验选择人肝癌 HepG2 细胞评价葎草中木犀
草苷和大波斯菊苷成分的体外抗肿瘤活性，为葎草
抗肿瘤的药理作用提供一定的理论依据。
1 仪器与材料
RD-1 熔点测定仪(天津天光光学仪器有限公
司) ;P270 高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有
限公司) ;Bruke-ARX-300 型核磁共振光谱仪(德国
Bruker公司) ;LCQ Fleet离子阱液质联用仪(赛默飞
世尔科技公司) ;4850E 型 CO2培养箱(美国 Nu-
Aire) ;SW-CJ-1B超净工作台(上海苏净实业有限公
司) ;WTDS-2 光学显微镜(深圳微特光电仪器)。
葎草采自沈阳北陵地区，经本校生药学教研室张
东方教授鉴定为桑科 Moraceae 葎草属 Humulus 植物
葎草 Humulus scandens(Lour．)Merr． 的全草，标本保
存在中国医科大学药学院中心实验室;硅胶(100 目
和 160 ～200目，青岛海洋化工有限公司) ;D 101大孔
树脂(天津南开大学树脂有限公司)。
木犀草苷和大波斯菊苷(实验室自制，纯度均
大于 98%) ;多柔比星(ADM，德国 Sigma 公司，批
号:在 2650) ;胎牛血清(天津灏洋生物公司，批号:
TBD-31) ;RPMI-1640 培养液(美国 GIBCO 公司，批
号:C11875500BT) ;二甲亚砜(德国 Sigma 公司，批
号:D2650) ，青霉素和链霉素(江苏碧云天生物技术
研究所，批号:CO222，100X) ;HepG2 细胞株(中国
科学院上海生命科学研究院，批号:ATCC-HB-
8065TM) ;甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2． 1 葎草中黄酮类化学成分的提取分离与鉴定
2． 1． 1 提取 取干燥葎草全草 10 kg，切碎后，第一
次加 10 倍量 70%乙醇提取 2 h，第二次加 8 倍量
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中国药师 2016 年第 19 卷第 2 期 China Pharmacist 2016，Vol． 19 No． 02
70%乙醇提取 1 h，第三次加 6 倍量 70%乙醇提取 1
h，合并提取液，回收乙醇至无醇味;加入氯仿萃取 3
次，每次 1 500 ml，弃去氯仿层，水层加热除去残留
氯仿;将上述水层溶液加入药用级 D101 树脂(1 500
g)柱中，吸附 12 h，先用适量水冲洗，再用 95%乙醇
洗脱，洗脱液浓缩至干，提取物备用。
2． 1． 2 分离 取上述提取物 120 g，用甲醇溶解，加
入硅胶(100 目)适量，研匀，挥干溶剂，备用;称取柱
层析用硅胶(160 ～ 200 目)1 200 g，湿法装柱上样
后，用氯仿-甲醇不同比例进行梯度洗脱，结合薄层
色谱合并相同流份，然后用制备液相色谱继续进行
分离，在氯仿-甲醇不同比例(100∶ 20 ～ 100∶ 30)的
洗脱剂中得到 4 种单体化合物。
2． 1． 3 鉴定 得到的化合物单体经紫外光谱、红外
光谱、质谱和核磁共振波谱确定结构，并与已发表的
文献对照核对。
化合物Ⅰ:淡黄色结晶粉末，mp 258 ～ 260 ℃。
UV λ(nm) :205，255，350 (MeOH)。
IR在 3328，1651，1603，1495，1441，1381，1270，
1174，1077，827，618 cm －1处有吸收峰。
ESI-MS m / z:449． 36，结合碳谱和氢谱得分子式
为 C21H20O11。
1H-HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ:12． 99(1H，
s，5-OH) ，9． 99(1H，s，4 #-OH) ，9． 40(1H，s，3 #-
OH) ，7． 45(1H，d，J = 8． 4Hz，6 #-H) ，7． 42(1H，s，
2 #-H) ，6． 91(1H，d，J = 8． 4Hz，5 #-H) ，6． 79(1H，
d，J = 1． 8Hz，8-H) ，6． 75(1H，s，3-H) ，6． 44(1H，
d，J = 1． 8Hz，6-H) ，5． 39-4． 60 (glu-H)。
13 C-NMR(DMSO-d6)δ:182． 0(C-4) ，164． 6(C-
2) ，163． 0(C-7) ，161． 2(C-5) ，157． 0(C-9) ，150． 0
(C-4 #) ，145． 9(C-3 #) ，121． 5(C-1 #) ，119． 3(C-6 #) ，
116． 1(C-5 #) ，113． 7(C-2 #) ，105． 4(C-10) ，103． 3
(C-3) ，100． 0(glu-C-1 $) ，99． 6(C-6) ，94． 8(C-8) ，
77． 2(glu-C-3 $) ，76． 5(glu-C-5 $) ，73． 2(glu-C-2 $) ，
69． 6(glu-C-4 $) ，60． 7(glu-C-6 $)。
以上光谱数据与文献报道的数据基本一致［3］，
鉴定化合物Ⅰ为木犀草苷，其结构见图 1。
图 1 木犀草苷结构图
化合物Ⅱ:淡黄色结晶粉末，mp 227 ～ 229 ℃。
UV λ(nm) :205，268，335 (MeOH)。
IR在 3190，1654，1596，1494，1441，1347，1175，
1067，827，612 cm －1处有吸收峰。
ESI-MSm / z:433． 25，结合碳谱和氢谱得分子式
为 C21H20O10。
1 H-NMR(300 MHz，DMSO-d6)δ:12． 96(1H，
s，5-OH) ，10． 39(1H，s，4 #-OH) ，7． 96(2H，d，J =
8． 4 Hz，2 #，6 #-H) ，6． 94(2H，d，J = 8． 4 Hz，3 #，5 #
-H) ，6． 87(1H，s，8-H) ，6． 83(1H，s，3-H) ，6． 45
(1H，s，6-H) ，5． 40-4． 61(glu-H)。
13 C-NMR(DMSO-d6)δ:182． 1(C-4) ，164． 3(C-
7) ，163． 0(C-2) ，161． 5(C-9) ，161． 2(C-4 #) ，157． 0
(C-5) ，128． 7(C-2 #，6 #) ，121． 1(C-1 #) ，116． 1(C-3 #
，5 #) ，105． 4(C-10) ，103． 2(C-3) ，100． 0(glu-C-1 $
) ，99． 6(C-6) ，94． 9(C-8) ，77． 3(glu-C-5 $) ，76． 5
(glu-C-3 $) ，73． 2(glu-C-2 $) ，69． 6(glu-C-4 $) ，60． 7
(glu-C-6 $)。
以上光谱数据与文献报道的数据基本一致［4］，
鉴定化合物Ⅱ为大波斯菊苷，其结构见图 2。
图 2 大波斯菊苷结构图
化合物 Ⅲ:黄色结晶粉末，mp 258 ～ 259℃。
UV λ (nm) :215，270，332 nm (MeOH)。
IR在 3164，1649，1609，1568，1502，1427，1358，
1294，1224，1173，1088，826，558 cm －1处有吸收峰。
ESI-MS m / z:433． 31，结合碳谱和氢谱得分子式
为分子式为 C21H20O10。
1H-NMR (300MHz，DMSO-d6)δ:13． 16 (1H，
s，5-OH) ，10． 79 (1H，s，7-OH) ，10． 27 (1H，s，4＇-
OH) ，8． 04(2H，d，J = 8． 4 Hz，2＇，6＇-H) ，6． 89(2H，
d，J = 8． 4 Hz，3 ＇，5 ＇-H) ，6． 77(1H，s，6-H) ，6． 23
(1H，s，3-H) ，5． 39-4． 60(glu-H)。
13C-NMR (DMSO-d6)δ:182． 1(C-4) ，163． 9(C-
2) ，162． 6(C-7) ，161． 2(C-4 #) ，160． 4(C-5) ，156． 0
(C-9) ，129． 0(C-2 #，6 #) ，121． 6(C-1 #) ，115． 9(C-3
#，5 #) ，104． 6(C-8) ，104． 1(C-10) ，102． 5(C-3) ，
98． 0(C-6) ，78． 7(glu-C-5 $) ，81． 9(glu-C-1 $) ，73． 4
(glu-C-2 $) ，70． 9(glu-C-3 $) ，70． 8(glu-C-4 $) ，61． 3
(glu-C-6 $)。
以上光谱数据与文献报道的数据基本一致［5］，
鉴定化合物Ⅲ为牡荆素，其结构见图 3。
化合物Ⅳ:淡棕色粉末，mp ＞300℃。
UV λ (nm) :258，205 (MeOH)。
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www． zgys． org 研究论文
图 3 牡荆素结构图
IR在 3094，1713，1665，1450，1414，1388，1233，
1089，797，536 cm －1处有吸收峰。
ESI-MS m / z:113． 23，结合碳谱和氢谱得分子式
为 C4H4N2O2。
1 H-NMR (300MHz，DMSO-d6)δ:5． 45(1H，
dd，J = 7． 8 Hz，6-H) ，7． 39(1H，d，J = 7． 8 Hz，5-
H) ，10． 82 (1H，s) ，11． 02 (1H，s)。
13C-NMR (DMSO-d6)δ:100． 3，142． 3，151． 6，
164． 4为双键碳信号。
以上光谱数据与文献报道的数据基本一致［6］，
鉴定化合物Ⅳ为尿嘧啶，其结构见图 4。
图 4 尿嘧啶结构图
2． 2 葎草中 LGL 和 AGL 对 HepG2 细胞增殖抑制
作用研究
2． 2． 1 细胞培养 将人肝癌细胞 HepG2 置于含
10%胎牛血清、100 U·ml －1青霉素和 100 μg·ml －1
链霉素的 RPMI-1640 培养液中，于 37℃、饱和湿度、
5% CO2的培养箱中培养。3 天传代一次，实验时用
对数生长期细胞。
2． 2． 2 细胞增殖抑制率测定 取对数生长期人肝
癌细胞 HepG2 制成浓度为 5 × 105个 /ml 的细胞悬
液，将细胞悬液按每孔 2 ml加至 6 孔板内。设不同
药物实验组、阳性药物组及溶媒阴性对照组。24 h
后将不同浓度的 LGL、AGL 和 ADM 分别加入 6 孔
板内，使 LGL、AGL 和 ADM 终浓度分别为 0，6． 25，
12． 5，25． 0，50． 0，100． 0 μmol·L －1。每个剂量设 3
个平行孔。在 10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养液
中继续培养 72 h。胰酶消化，收集细胞，台盼蓝染
色，显微镜下计数。以阴性对照组做参比，计算细胞
增殖抑制率:细胞增殖抑制率(%)=(1 －药物组细
胞数 /阴性对照组细胞数)× 100%。通过 SPSS16． 0
软件计算，结果数据以 珋x ± s 表示，采用单因素方差
分析进行比较，以 P ＜ 0． 05为有统计学意义。结果
细胞增殖抑制率及 IC50见表 1。
表 1 LGL和 AGL对 HepG2 细胞增殖的抑制作用(n = 3)
药物浓度
(μmol·L －1)
细胞增殖抑制率(%，珋x ± s)
AGL LGL AMD
0 0 0 0
6． 25 3． 6 ± 0． 3 28． 8 ± 2． 2 38． 5 ± 3． 5
12． 5 9． 8 ± 0． 8 44． 3 ± 3． 9 59． 1 ± 5． 2
25． 0 13． 9 ± 0． 9 75． 6 ± 7． 1 86． 6 ± 8． 4
50． 0 19． 3 ± 1． 0 93． 4 ± 9． 1 96． 8 ± 9． 1
100． 0 21． 3 ± 1． 8 95． 2 ± 9． 0 97． 1 ± 9． 2
IC50(μmol·L －1) 930． 0 ± 121． 2 14． 2 ± 2． 1a 8． 7 ± 1． 2a
注:与 AGL组相比，* P ＜ 0． 05。
3 讨论
3． 1 黄酮类成分的提取、分离和鉴定
该试验主要对葎草中的黄酮类成分进行提取和
分离。采用 70%乙醇提取葎草中的有效成分;氯仿
萃取除去提取物中的叶绿素;大孔吸附树脂吸附能
够纯化有效成分，除去糖类等杂质;采用胶柱分离获
取单体成分;所得单体通过制备液相精制能得到更
高纯度的单体成分。所得的 4 种单体化合物经光谱
鉴定分别为木犀草苷、大波斯菊苷、牡荆素和尿嘧
啶。其中木犀草苷和大波斯菊苷含量和得率最高。
3． 2 LGL和 AGL对 HepG2 细胞增殖的抑制作用
MTT法是常用的检测药物体外抗肿瘤效果的
方法，实验中曾将葎草中的总黄酮提取物作为测试
组进行检测，但其溶解度较差，影响 MTT法测定，故
检测方法改用台盼蓝染色法。
通过台盼蓝染色法检测了 LGL 和 AGL 对
HepG2 细胞活性的抑制作用，实验结果表明 LGL 明
显抑制肝癌细胞 HepG2 的生长，其作用呈剂量依赖
性，而 AGL 不能有效抑制 HepG2 的生长。文献报
导［7］，黄酮类成分对于抗肿瘤细胞增殖作用，其 B
环上 C3和 C4位上的两个邻近的极性基团-OH 对于
抑制酶的活性是必需的。C2和 C3之间的共轭双键
导致 B环和 C环在同一平面，有利于接近激酶底物
结合位点，这两种结构对于黄酮类成分抗细胞增殖
的活性至关重要。这与本实验结果相吻合。同时也
能够解释为何 LGL 和 AGL 两个黄酮类化合物虽然
只相差了一个-OH，但其抑瘤作用相差悬殊。
3． 3 小结
葎草中含有的主要化学成分为木犀草苷和大波
斯菊苷，其中木犀草苷对 HepG2 细胞生长具有明显
的抑制作用，且呈剂量依赖性。大波斯菊苷对
HepG2 细胞生长抑制作用不明显。
参 考 文 献
1 侯宽昭． 中国种子植物科属词典［M］． 北京:科学出版社，
1984． 238
962
中国药师 2016 年第 19 卷第 2 期 China Pharmacist 2016，Vol． 19 No． 02
基金项目:湖南省长沙市科技局计划项目(编号:K1003068-31) ;湖南省科技厅计划项目(编号:2009SK3125) ;湖南省研究生精品课程建设项目
(编号:KC2011B026)
通讯作者:何群 Tel:(0731)88458231 E-mail:
櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊
hequn88@ 126． com
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(2015-09-11 收稿 2015-11-08 修回)
四妙君逸软膏不同提取工艺的止痛作用比较研究
陈光宇1 陈善军1 韩军涛1 何永恒3 何群1，2 (1． 湖南中医药大学药学院 长沙 410004;2． 湖南省教育厅药
学“十二五”重点学科;3． 湖南中医药大学第二临床医学院)
摘 要 目的:通过镇痛实验筛选四妙君逸软膏中 4 味药材的最佳提取工艺。方法:采用小鼠热板法及小鼠扭体法进行镇
痛实验，观察四妙君逸软膏中 4 味药材不同提取工艺的镇痛药效。结果:由等级一致性检验结果可知，小鼠热板法各组数据
无统计学差异，不同提取工艺制得的四妙君逸软膏药效基本一致;小鼠扭体法各组数据均有统计学差异，花椒、延胡索采用超
临界 CO2萃取，没药用 95%醇提，三七用 50%醇提制成的四妙君逸软膏能很好地抑制小鼠醋酸引起的痛阈，镇痛作用最明显，
故该提取工艺最优。结论:通过镇痛实验筛选得到的四妙君逸软膏提取工艺科学、合理、可行，适合现代化中药制剂的研究与
开发。
关键词 四妙君逸软膏;提取工艺;镇痛作用
中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-049X(2016)02-0270-04
Comparative Study on Analgesic Effect of Simiao Junyi Ointment with Different Extraction Process
Chen Guangyu1，Chen Shanjun1，Han Juntao1，He Yongheng3，He Qun1，2(1． School of Pharmacy，Hunan University of Chinese Med-
icine，Changsha 410004，China;2． “Twelfth Five-Year Plan”Key Subject of Pharmacy of the Education Department of Hunan;3．
The Second Clinical Medical School，Hunan University of Chinese Medicine)
ABSTRACT Objective:To screen the best extraction process of four medicinal materials in Simiao Junyi ointment by analgesic ex-
periments． Methods:The analgesic experiments were performed by the hot-plate test and writhing test in mice to select the best extrac-
tion process of four medicinal materials in Simiao Junyi ointment． Results:According to the results of level consistency check，the data
of hot-plate test in mice in different groups had no significant difference，and the pesticide effect of Simiao Junyi ointment prepared by
different extraction process was similar． However，the data of writhing test had significant difference． The extraction process of the oint-
ment with the best analgesic activity was as follows:pepper and rhizoma corydalis were extracted by SFE-CO2，myrrha and pseudo-gin-
seng was extracted by 95% and 50% ethanol，respectively． Conclusion:The optimal extraction process tested by analgesic experi-
ments is scientific，reasonable and feasible，and suitable for the research and development of modern traditional Chinese medicine
preparations．
KEY WORDS Simiao Junyi ointment;Extraction process;Analgesic effect
疼痛是肛肠病术后常见的并发症之一，术后伤
口剧烈疼痛，不仅给患者的身心带来极大的痛苦，而
且还影响术后创面的愈合。四妙君逸软膏处方来源
于湖南中医药大学第二临床医学院著名中医肛肠科
专家何永恒教授创制的治疗肛门病术后伤口疼痛和
促进伤口愈合的临床经验方，由延胡索等 4 味中药
材组成［1，2］，具有行气活血止痛，止血生肌的作用，
用于各种肛肠病术后镇痛［3，4］及创面换药，促进伤
口愈合［5，6］，疗效显著，未见不良反应发生［7，8］。原
方为超微粉型喷散，因剂型不合理已改成软膏剂，软
膏关键工艺是提取物的制备，由于肛门部位用药面
积小，临床要求在保证药效的前提下，提取物尽可能
072
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