全 文 ：网络出版时间:2015 － 10 － 16 9:52 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． Ｒ． 20151016． 0952． 032． html
野苋菜提取物抗肿瘤作用及诱导人肝癌
HepG2 细胞凋亡的分子机制
刘金娟，曹成亮，丁 盼，蒋继宏
(江苏师范大学江苏省药用植物生物技术重点实验室，江苏 徐州 221116)
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2015． 11． 016
文献标志码:A 文章编号:1001 － 1978(2015)11 － 1558 － 05
中国图书分类号:Ｒ284． 1;Ｒ329． 25;Ｒ735． 702． 2;Ｒ979． 1
摘要:目的 研究野苋菜提取物的抗肿瘤作用及诱导人肝癌
HepG2 细胞凋亡的可能机制。方法 采用 Alamar blue 法检
测野苋菜提取物对肿瘤细胞的抑制作用;光学显微镜和 Ho-
echst 33258 荧光染色观察 HepG2 细胞的形态变化;流式细
胞术检测该提取物对 HepG2 细胞凋亡的影响;Western blot
和 caspase-3 活性检测试剂盒分析野苋菜提取物诱导 HepG2
细胞凋亡的作用机制;caspase-9、caspase-3 抑制剂(Z-LEHD-
FMK和 Ac-DEVD-CHO)验证相关的调控信号转导通路。结
果 野苋菜提取物对多种肿瘤细胞均有抑制作用，其中
HepG2 细胞最敏感;经提取物处理过的 HepG2 细胞出现明
显的凋亡特征，流式细胞术进一步证实野苋菜提取物能够诱
导 HepG2 细胞的凋亡;野苋菜提取物处理 48h 后的 HepG2
细胞中 Bcl-2、survivin表达下调，Bax、PAＲP、Apaf-1、caspase-9
表达量增加，并且 caspase-3、caspase-9 酶活性明显提高;
caspase-9 和 caspase-3 的抑制剂能够逆转野苋菜提取物对
HepG2 细胞的抑制活性。结论 野苋菜提取物具有抗肿瘤
作用，并且能够激活 caspase-9 内源性凋亡信号通路，发挥其
促进 HepG2 细胞凋亡的作用。
关键词:野苋菜提取物;抗肿瘤;细胞凋亡;caspase-9;特异性
抑制剂;分子机制
收稿日期:2015 － 07 － 18，修回日期:2015 － 08 － 18
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 31370646);江苏师范大
学自然科学基金项目(No 14XLA02，13XLA02);江苏省药
用植物生物技术重点实验室开放课题(No KLBMP1404)
作者简介:刘金娟(1982 －)，女，博士，讲师，研究方向:抗肿瘤药物
药理学，E-mail:jjlbest@ 163． com;
蒋继宏(1962 －)，男，博士，教授，研究方向:生物技术，通
讯作者，E-mail:jhjiang@ jsnu． edu． cn
野苋菜学名刺苋(Amaranthus spinosus L．)，又
称银杏苋，为苋科苋属的一年生草本植物，全世界均
有分布，是一种十分优良的药食两用作物［1］，具有
开发价值，受到广大学者的密切关注。野苋菜富含
棕榈酸、亚油酸、亚麻酸、多种必需氨基酸等，是非常
受欢迎的时尚野菜。《本草纲目》中有记载苋菜可
入药治疗痢疾、肠炎、痔疮等疾病［2］。近年来有研
究表明，野苋菜在调节血脂、调低心血管病发病风险
等方面也有重要作用［3］，但其是否具有预防肿瘤的
作用，国内外研究较少。本文通过体外培养的肿瘤
细胞为模型，探讨野苋菜的抗肿瘤作用及其可能的
分子机制，为肿瘤的防治提供食疗依据，也为野苋菜
资源的综合利用提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 供试细胞株 人肝癌 HepG2 细胞株、人胃
癌 SGC-7901 细胞株、人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞
株、人肺癌 NCI-H460 细胞株购于上海中科院细胞
库，由本实验室冻存。
1． 1． 2 研究对象 野苋菜采自郊外田间，并由专业
人员鉴定。
1． 1． 3 主要试剂与仪器 Alamar Blue(美国 Sigma
公司);caspase-9、Bax、Bcl-2、survivin、Apaf-1 和
GAPDH 抗体(美国 Bioworld 公司);Z-LEHD-FMK
(BioVision 公司);HＲP 标记羊抗兔 IgG、PAＲP 抗
体、caspase-3 活性检测试剂盒、Ac-DEVD-CHO、细胞
裂解液(碧云天生物技术研究所);化学发光检测试
剂盒(Thermo公司);其余试剂均为国产分析纯。
IBE2000 显微镜(COIC 公司);CO2 细胞培养箱
(Thermo公司);SpectroMax M2 荧光检测仪(Molecu-
lar Device 公司);流式细胞仪(BD 公司);荧光显微
镜(德国 Leica 公司);电泳仪及转膜仪(美国 Bio-
Ｒad公司);化学发光凝胶成像系统(Protein Simple
公司)。
1． 2 方法
1． 2． 1 野苋菜提取物的制备 野苋菜提取物的制
备参照文献［4］，将野苋菜切碎，然后采用家用榨汁
机将其榨成汁液，用低温离心机 4 ℃、5 000 r·
min －1离心 10 min，取上清，无菌滤膜抽滤后保藏于
－ 20 ℃冰箱备用。
1． 2． 2 细胞培养与体外抗肿瘤活性实验 采用
Alamar blue法检测各浓度提取物体外抗肿瘤活性，
具体实验方法参照文献［5］。
·8551· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2015 Nov;31(11):1558 ～ 62
1． 2． 3 Hoechst 33258 染色法观察细胞形态 取状
态良好的 HepG2 细胞，胰酶消化后接种于 6 孔培养
板，待贴壁后，加入含野苋菜提取物培养液，48 h 后
倒置相差显微镜观察并拍照;收集细胞，加入 Ho-
echst 33258 染液(终浓度 5 mg·L －1)，染色 10 min，
取 10 μL悬液滴于载玻片上，荧光显微镜下观察拍
照。实验重复 3 次。
1． 2． 4 流式细胞仪检测细胞凋亡 参照 Annexin
V-FITC /PI细胞凋亡检测试剂盒说明书。收集经过
野苋菜提取物处理 48 h 后的细胞，PBS 重悬;2 000
r·min －1离心 5 min，弃上清;加入 195 μL 的 FITC-
Annexin V结合液，轻轻将细胞吹成悬液;加入 5 μL
的 PI，轻轻混匀;室温避光孵育 10 min，1 000 r·
min －1离心 5 min，弃上清，加入 190 μL 的 FITC-An-
nexin V结合液轻轻重悬细胞;最后向细胞悬液中加
入 10 μL 的 PI 染色液并充分混匀，冰浴中避光放
置，流式细胞仪检测。
1． 2． 5 Western blot检测凋亡相关蛋白质表达 收
集野苋菜提取物处理 48 h 后的细胞，提取蛋白，
12% SDS-PAGE分离，转膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗
(1 ∶ 500)封闭过夜，二抗(1 ∶ 2 000)37 ℃孵育 2 h，
化学发光凝胶成像系统检测。实验重复 3 次。
1． 2． 6 caspase-3 和 caspase-9 酶活性的检测
caspase-3 和 caspase-9 酶活性的测定按照 caspase-3
和 caspase-9 活性检测试剂盒说明书进行。
1． 2． 7 caspase-3 和 caspase-9 抑制剂对野苋菜提取
物抗肿瘤活性的影响 将 HepG2 细胞接种于 96 孔
培养板中，细胞贴壁后，加入 10 μmol·L －1 caspase-
9 和 caspase-3 抑制剂(Z-LEHD-FMK 和 Ac-DEVD-
CHO)，孵育 2 h 后，加入野苋菜提取物继续培养 48
h，Alarmar blue法检测细胞活性。
1． 2． 8 统计学分析 采用 SPSS 19． 0 统计分析软
件进行单因素方差分析，数据以 珋x ± s表示。
2 结果
2． 1 野苋菜提取物对各肿瘤细胞增殖的抑制作用
不同浓度(1、2. 5、5、10、20、40、80 mL·L －1)的野
苋菜提取物处理 HepG2、SGC-7901、NCI-H460、
MDA-MB-231 细胞 48 h 后，IC50值分别为 32. 70、
41. 28、51. 34、48. 27 mL·L －1(Tab 1)。由于 HepG2
细胞最敏感，因此选择 HepG2 细胞作为研究对象，
进一步探讨野苋菜提取物抑制肿瘤细胞增殖的可能
分子机制。
2． 2 野苋菜提取物对 HepG2 细胞形态的影响 对
照组细胞生长贴壁较牢固，细胞间紧密相连，细胞边
界清晰，细胞膜完整，细胞核被 Hoechst 33258 染成
Tab 1 IC50 values of cancer cells induced by Amaranthus spinosus L．
extract at different concentrations with alarmar blue assay
Cell strain Source IC50(mL·L －1)
HepG2 Human hepatoma cancer cell 32． 70 ± 1． 31
SGC-7901 Human gastric cancer cell 41． 28 ± 1． 25
NCI-H460 Human lung cancer cell 51． 34 ± 0． 98
MDA-MB-231 Human breast cancer cell 48． 27 ± 1． 91
均匀的蓝色;而苋菜提取物处理组(IC50 = 32. 7 mL
·L －1)，细胞体积变小，形态逐渐变圆，细胞间接触
松散，形态不规则，Hoechst 33258 染色呈亮蓝色，表
现出凋亡的明显特征(Fig 1)。
Fig 1 Morphology changes of HepG2 cells induced by
Amaranthus spinosus L． extract (20 ×)
2． 3 野苋菜提取物对 HepG2 细胞凋亡的影响 用
野苋菜提取物(32. 7 mL·L －1)处理 HepG2 细胞
48 h后，细胞凋亡率(32. 61% ±0. 43%)明显高于对
照组(2. 57% ± 0. 10%)，且差异有显著性(P ＜
0. 05)，提示野苋菜提取物能够促进 HepG2 细胞的
凋亡(Fig 2)。
2． 4 野苋菜提取物对 HepG2 细胞内凋亡相关因子
表达的影响 野苋菜提取物处理 HepG2 细胞 48 h
后，Western blot 检测发 现 Bax、Apaf-1、PAＲP、
caspase-9、caspase-3 蛋白水平表达明显上调，而抑凋
亡因子 Bcl-2 和 survivin表达下调(Fig 3)。
2． 5 野苋菜提取物对 HepG2 细胞内 caspase-9、
caspase-3 酶活性的影响 野苋菜提取物处理
HepG2 细胞 48 h 后，caspase-9、caspase-3 的活性均
高于对照组，差异有显著性(P ＜ 0. 01)，见 Fig 4。
·9551·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2015 Nov;31(11)
Fig 2 Apoptotic rate of HepG2 cells treated with
Amaranthus spinosus L． extract
Fig 3 Effect of Amaranthus spinosus L． extract on
expression of apoptotic protein in HepG2 cells
2． 6 caspase-9 和 caspase-3 抑制剂对野苋菜提取
物促凋亡的影响 caspase-9 和 caspase-3 抑制剂 Z-
LEHD-FMK和 Ac-DEVD-CHO能够明显提高处理组
中 HepG2 细胞的活性(P ＜ 0. 05)，说明 caspase-9 和
caspase-3 抑制剂可明显逆转野苋菜抑制肿瘤细胞
增殖的作用，进一步验证了野苋菜提取物是通过
caspase-9 介导的内源性凋亡信号通路发挥抗肿瘤
作用。见 Fig 5。
3 讨论
随着消费观念的变化，人们开始追求食品的内
在营养、保健食疗，要求无污染、食用安全、方便等。
Fig 4 Effect of Amaranthus spinosus L． extract on caspase-3
and caspase-9 activity in HepG2 cells
＊＊P ＜ 0． 01 vs control．
Fig 5 Effect of Z-LEHD-FMK and Ac-DEVD-CHO on the
inhibited proliferation of Amaranthus spinosus L． extract
* P ＜ 0. 05 vs control．
苋菜是一种十分优良的菜、粮、药兼用作物。本文研
究结果显示，苋菜提取物可明显抑制各种肿瘤细胞
的增殖，其中对 HepG2 最敏感。有研究表明［6］，肿
瘤的发生主要是由于细胞的无限增殖和细胞凋亡受
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到抑制引起的。本实验 Hoechst 33258 和流式细胞
术检测结果表明，苋菜提取物可诱导 HepG2 细胞的
凋亡。肿瘤细胞的凋亡过程是由多种凋亡相关蛋白
参与的。Bcl-2 家族蛋白是线粒体膜上调控细胞凋
亡的一类蛋白［7］，该类蛋白的结合状态将调节线粒
体膜电位的变化，改变细胞色素 C 等相关蛋白的释
放，结合 Apaf-1 等蛋白，进而激活 caspase-9 凋亡信
号通路，激活 caspase-3，剪切 PAＲP，导致细胞凋
亡［8］。Bcl-2 和 Bax是 Bcl-2 家族的两个重要成员，
二者可通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋
亡［9］。survivin是凋亡抑制蛋白家族的成员之一，具
有抑制细胞凋亡的作用［10］。本实验结果表明，苋菜
提取物上调抑癌蛋白 Bax、Apaf-1，下调促癌蛋白
Bcl-2、survivin的表达，同时提高 caspase-9、caspase-3
的活性，进而诱导 HepG2 细胞的凋亡。caspase-9 和
caspase-3 特异性抑制剂处理细胞后，抑制了野苋菜
提取物引起的细胞凋亡，进一步验证了野苋菜提取
物是通过调控 caspase-9 介导的线粒体凋亡信号转
导途径调控细胞凋亡的。
目前，对于苋菜所含成分及药理作用和其制剂
的临床应用等方面的研究还不够完善，今后应对苋
菜的有效成分，特别是单体成分进行深入研究，进一
步使苋菜发挥出更高的药用价值和经济价值。
参考文献:
［1］ Hilou A，Nacoulma O G，Guiguemde T Ｒ． In vivo antimalarial ac-
tivities of extracts from Amaranthus spinosus L． and Boerhaavia
erecta L． in mice［J］． J Ethnopharmacol，2006，103(2):236 －
40．
［2］ 玄永浩，金银哲，刘 旭，金英善． 苋菜药理作用研究进展
［J］． 长江蔬菜，2010，22(2):1 － 4．
［2］ Xuan Y H，Jin Y Z，Liu X，Jin Y S． Ｒesearch advances in phar-
macology of Amaranthus spinosus L．［J］． J Changjiang Vegeta-
bles，2010，22(2):1 － 4．
［3］ 岳大海，朱毓卉，蔺新英，等． 野苋菜对高脂血症大鼠血脂水
平的影响［J］． 中国老年学杂志，2012，32(6):1198 － 200．
［3］ Yue D H，Zhu Y H，Lin X Y，et al． The effect of wild amaranth
on serum lipid level in hyperlipidemia rats［J］． Chin J Geront，
2012，32(6):1198 － 200．
［4］ Ｒay Ｒ B，Ｒaychoudhuri A，Steele Ｒ，Nerurkar P． Bitter melon
(Momordica charantia)extract inhibits breast cancer cell prolifera-
tion by modulating cell cycle regulatory genes and promotes apopto-
sis［J］． Cancer Ｒes，2010，70(5):1925 － 31．
［5］ Chen Y Q，Liu J J，Yuan B，et al． Methylated actinomycin D，a
novel actinomycin D analog induces apoptosis in HepG2 cells
through Fas-and mitochondria-mediated pathways［J］． Mol Car-
cinog，2013，52(12):983 － 96．
［6］ Ouyang L，Shi Z，Zhao S，et al． Programmed cell death pathways
in cancer:a review of apoptosis，autophagy and programmed nec-
rosis［J］． Cell Prolif，2012，45(6):487 － 98．
［7］ 张贝贝，刘文洪，李俊峰，叶志青． 铁皮石斛多糖对高糖诱导
的血管内皮细胞 Bax、Bcl-2 表达的影响［J］． 中国药理学通
报，2015，31(1):64 － 70．
［7］ Zhang B B，Liu W H，Li J F，Ye Z Q． Effects of polysaccharides
from Dendrobium officinale on expression of Bax and Bcl-2 in vas-
cular endothelial cells induced by high sugar［J］． Chin Pharmacol
Bull，2015，31(1):64 － 70．
［8］ Weyhenmeyer B，Murphy A C，Prehn J H，Murphy B M． Targe-
ting the anti-apoptotic Bcl-2 family members for the treatment of
cancer［J］． Exp Oncol，2012，34(3):192 － 9．
［9］ Hao C，Gao L，Zhang Y，et al． Acetylated chitosan oligosaccha-
rides act as antagonists against glutamate-induced PC12 cell ceath
via Bcl-2 /Bax signal pathway［J］． Mar Drugs，2015，13(3):
1267 － 89．
［10］ Dang S C，Feng S，Wang P J，et al． Overexpression of Survivin
mutant Thr34Ala induces apoptosis and inhibits gastric cancer
growth［J］． Neoplasma，2015，62(1):81 － 7．
Anticancer activity and mechanism of apoptosis induced by
Amaranthus spinosus L． extract in HepG2 cells
LIU Jin-juan，CAO Cheng-liang，DING Pan，JIANG Ji-hong
(Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plants of Jiangsu Province，Jiangsu Normal University，
Xuzhou Jiangsu 221116，China)
Abstract:Aim To investigate the anticancer activity
and the mechanism of the apoptosis induced by Ama-
ranthus spinosus L． extract (ASE)in human hepatic
carcinoma cell line HepG2． Methods Alamar blue
assay was used for detecting the influence of ASE on
the proliferation of the cancer cells． The morphological
changes of cells were observed under inverted micro-
scope and Hoechst 33258 stainning． The apoptosis of
HepG2 cells was detected by flow cytometry． Western
blot and caspase-3 activity kit were used to detect the
protein expression in HepG2 cells． The specific inhibi-
tor of caspase-9 and caspase-3(Z-LEHD-FMK and Ac-
DEVD-CHO)was used to validate the signal transduc-
tion pathyway． Ｒesults The results indicated that the
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cell proliferation was inhibited by ASE，especicially the
HepG2 cells． The HepG2 cells showed obvious apop-
totic characteristics． Flow cytometry analysis further
validated the apoptosis of HepG2 cells． The expression
of Bcl-2 and survivin was downreagulated in HepG2
cells treated with ASE，and Bax，caspase-9，caspase-
3，Apaf-1 and PAＲP were upregualted． Besides，the
caspase-3 activity was also increased． Z-LEHD-FMK
and Ac-DEVD-CHO significantly increased the cell vi-
abilty of HepG2 cells induced by ASE． Conclusion
These results confirm that ASE induces the apoptosis of
HepG2 through mitochondria-mediated pathway．
Key words:Amaranthus spinosus L． extract; anti-
cancer;apoptosis;caspase-9;specific inhibitor;mo-
lecular mechanism
网络出版时间:2015 － 10 － 16 9:52 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． Ｒ． 20151016． 0952． 034． html
HIF-1α、ＲOCK-2、FoxM1 在醋酸铅诱导 PC12 细胞
损伤中的表达变化
李永金，张 谊，杨开勇，席 可，李少邱，朱春雪，陈月芳，黄晓佳
(江苏大学医学院药理学教研室，江苏 镇江 212013)
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2015． 11． 017
文献标志码:A 文章编号:1001 － 1978(2015)11 － 1562 － 07
中国图书分类号:Ｒ-332;Ｒ329． 24;Ｒ916． 3 ;Ｒ977． 3;
Ｒ977. 6;Ｒ995
摘要:目的 探讨低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-
1α，HIF-1α)、Ｒho关联卷曲螺旋蛋白激酶-2(Ｒho associated
coiled coil forming protein kinase-2，ＲOCK-2)、叉头蛋白 M1
(forkhead box protein M1，FoxM1)在醋酸铅［Pb(Ac)2］诱导
大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤 PC12 细胞损伤中的表达和意义。方
法 将 PC12 细胞暴露于不同浓度的 Pb(Ac)2(100、200、400
μmol·L －1)24 h以诱导细胞发生损伤。采用噻唑蓝比色法
检测细胞的存活率，倒置显微镜观察细胞形态的变化，乳酸
脱氢酶漏出率检测法测定细胞损伤程度，采用试剂盒检测丙
二醛(malondialdehvde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide
dismutase，SOD)水平，Hoechst 33342 单荧光染色法观察细
胞凋亡，免疫印迹法检测细胞 HIF-1α、ＲOCK-2、FoxM1、淋巴
瘤 /白血病-2(B cell lymphoma / leukemia，Bcl-2)和 Bcl-2 相关
蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)的表达。结果 MTT
实验显示 Pb(Ac)2对 PC12 细胞具有明显抑制作用并呈剂量
依赖性，与对照组相比，Pb(Ac)2 可增加细胞内 LDH 漏出
率，升高 MDA含量，降低 SOD含量，诱导细胞发生凋亡。此
外，Pb(Ac)2 上调细胞 HIF-1α、ＲOCK-2 的表达，下调 FoxM1
的表达，提高 Bax /Bcl-2 的表达比例。结论 Pb(Ac)2 诱导
收稿日期:2015 － 07 － 01，修回日期:2015 － 08 － 03
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 81300059);江苏大学高
级人才基金项目(No 08JDG005，11JDG092)
作者简介:李永金(1968 －)，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方
向:神经药理学，E-mail:lyj3600@ 163． com;
黄晓佳(1980 －)，男，博士，副教授，研究方向:神经药理
学，通讯作者，Tel:0511- 88791201，E-mail:harold1980@
163． com
PC12 细胞发生凋亡可能与 HIF-1α、ＲOCK-2、FoxM1 的表达
以及自由基损伤有关。
关键词:醋酸铅;PC12 细胞;细胞损伤;HIF-1α;ＲOCK-2;
FoxM1
铅是一种普遍存在的工业毒物和环境污染物，
长期低剂量接触铅对机体的各个系统都有不良影
响，尤其是神经系统。铅对中枢和外周神经系统都
有直接毒害作用，对胎儿和儿童影响最大，可造成儿
童智力、记忆力和神经行为障碍［1］。目前对铅的神
经毒性机制研究较多，但关于铅造成神经损伤的机
制及可能的药物保护作用靶点仍需研究。因此，深
入研究铅如何引起神经系统损伤，对于铅神经毒性
的防护和治疗有着重要意义。
在神经细胞损伤过程中，有多种因子参与了细
胞的死亡过程，其中低氧诱导因子-1(hypoxia-induc-
ible factor-1，HIF-1)和 Ｒho关联卷曲螺旋蛋白激酶
(Ｒho associated coiled coil forming protein kinase，
ＲOCK)受到了广泛的关注。HIF-1 是细胞在缺氧条
件下活化的重要转录因子，可调控 ＲhoA 和 ＲOCK
等蛋白的表达变化，尤其是 ＲOCK-2［2］。在缺氧诱
导脊髓神经细胞凋亡过程中，HIF-1α、ＲOCK-2、
caspase-3 表达上调［3］，提示 HIF-1α、ＲOCK-2 参与
了神经细胞的损伤过程。但目前仍不明确 HIF-1α、
ＲOCK-2 是否参与调节铅诱导的神经细胞损伤。
叉头蛋白 M1(forkhead box protein M1，FoxM1)
属于 FOX家族的转录因子之一［4］，FoxM1 在细胞周
期的调节中起着重要作用，在细胞周期的各个时期
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