全 文 ：第 4 卷第 6期 生 物 化 学 杂 志
198 8年 2 1月 C h in es eB io eh em iea l Jo u rn a l
V o l
.
4 , N o
.
6
D e e
.
,
19 8 8
野花生豆凝集素的纯化和性质 *
曹仲奎 杨静平 曹光耀
(四川大学生化教研室 , 成都 )
用猪胃拈蛋白一 eS hP “ or se 4 B作亲和吸附荆 ,可从野花生豆 (C or ` .al “ r , “
m cu
r
on
“ at ) 的种子中分离纯化 出对人类 A 型血专一凝某的凝某素 。 该凝
集素可用 PH 3 . 0 , lG y一 H CI 一 l m ol / L N a CI 溶液解吸附 。 纯 化 的 凝 集 素 在
P A G E或 s D s 一 P A G E中均显示单一蛋白带 , 表明凝集素分子内只有一种亚
基 。 用 s D s 一 P A G E刚得共亚基分子量为 49 , 0 0 . 氮基酸组成分 析表 明 ,
该凝某素富含甘氛酸和谷氮酸 , 不含甲硫氛酸 。
纯化的野花生豆凝集素 (简称 CM )L 含有 4 . n % 的中性糖 。 它 对人
A 型血细胞有强 .狱凝 集 作用 , 对 A B 型血有弱凝集作用 , 但对 B 型和 O
型血均不凝集 。 其对 A 型血细胞的凝某作用可被 N 一乙耽半乳糖胺抑制 ,但
对 A B型血则无抑制作用。 C M L 是一个促有练分裂原 , 对人外周血中淋 巴
细胞有促有练分裂作用 。
关键词 : 凝集素 糖蛋 白 野花生豆凝集素
前 言
许多豆科植物的种子都含有性质各不相同的凝集素 [` ] 。 某些凝集素与 A B H血 型物质直接
相关 [ 2 ] 。 已从 D o l泣e h o s b i f l o r o s [3 , ` 〕 、 A o p h f c a r p a e a b r a “ `。 a ` a [ ’ J 、 P h a s ` O l u s l“ n a ` u s [ 6 , 7 1 、
V云c泣a e r a e e a l “ , “ ] 和V : e i a V i l l o s a [` “ ]等植 物的种子中纯化出凝集素 , 它们能凝集 A 型红纽
胞 , 井能与血型物质 A 特异性地产生沉淀 。 对这些凝集素的物理 、 化学和生物学性质均已进
行了研究 。
本文报道从野花生豆 ( C or at lar 她 。 二 or 。 协 ) 的种子中分离纯化的野花生豆凝集素 (简
称 C M L ) 的物理 、 化学和生物学性质的研究结果 。
材 料 和 方 法
一 、 材料
新鲜正常人的红细胞得 自中国医科院成都输血研究 所 。 红 细 胞 用 P H 7 . 5 , 0 . 15 m ol / L
* 中国科学院科学基金资助的课题 。 本文于 1 9 87年 2 月 26 日收到
4 8 9
DOI : 10. 13865 /j . cnki . cj bmb. 1988. 06. 002
N ac l/ 0
.
ol m ol / L磷酸盐缓冲液 (P B s) 洗涤三次 。 A B O血型由本室用标准方法鉴别 。
新鲜猪胃购自本地屠宰场 。 野花生豆采用野外 10 一 12 月成熟的种子 。 N 一乙 酞 半乳糖胺
( G
a l N A e ) 和D 一半乳糖 ( D 一G a l ) 购 自 S i g m a ; 十二烷基磺酸钠 ( S D S ) 购自 S e r v a ; 蛋白
质标准品得 自 Bi o 一R a d 。 实验用化学试剂均为分析纯或化学纯 。
二 、 方法
1
. 猪胃粘蛋白亲和柱的制备 : 按 K ar hi [81 的方法制备 。 胃粘蛋白偶联于 C N B r 活 化的
s e P h a r o s e 4 B 应用 M a y l i e 一 p f e n n i n g e r [ ” ]的方法 。 吸附剂经p B S洗涤后 , 装柱 ( 1 1 X Z c m )井
用 P B S平衡备用 。
2
.
C r o t a l a r i a m u e r o n a t a 凝集素的纯化 : 将 C r o t a l a r i a m : ` e r o n a t a 种子 ( 1 0 0 9 ) 磨粉 ,
加 P B S在 4℃浸取过夜 。 过滤离心 ( 4℃ , 2 0 , 0 0 0 r / m i n . , 3 o m i n ) , 清液加入固体硫酸按达 4 0%
饱和度 , 置 4℃过夜 。 同前法离心 , 上清液中继续加人硫酸按达 60 % , 禽心收集沉淀 , 溶于
蒸馏水 , 透析去盐 , 冷冻干燥得凝集素粗品。
粗品溶于 P B S , 井对 P B S平衡透析 , 经 4℃ , 1 0 , o o o r/ m in 离心去沉淀上猪胃粘 蛋白亲和
柱 。 用 p B S洗脱至流出液在 Z s o n m 处的吸收值小于 0 . 0 2为 止 。 用 P H 3 . o , G l y一 H C I一 z m o l / L
N aC I缓冲液解吸附 。 洗脱和解吸附过程均分步收集 , 流速为 18 m l/ h , 每管 3一 4 m l。 蛋白质
含量用紫外分光光度计测定 ( 2 8 0n m ) 。 此亲和层析所得样品尚含有微 量 杂 蛋 白 , 可 通 过
se Ph
a d e x G 一 2 0 在 P B S 中过滤去除 。 样品透析去盐后冷冻干燥保存 。
3
. 聚丙烯酞胺凝胶 电 泳 ( p A G E ) : 按 p e a e o e k [ ’ 2 ] 的方法 在 p H s . 9 , T r i s一 E D T A N a Z-
b o r at e缓冲液中进行 。 凝胶浓度为 7 . 5 % 。 电泳后的凝胶经 10 %三氯醋酸固定 , 考马斯亮蓝
R 一 2 5 0染色 , 7% 乙酸脱色保存 ,用 双波长薄层扫描仪 ( S h i m a d z u , D u a l w a v e l e n t h T e l S e a n n e r ,
C S一 9 1 0 ) 扫描记录 。
4
. 分子量测定 : 按 W e b er 等的 S D S一 P A G E 法测 定 〔 ’ “ 〕 。 样 品 (0 . 5一 1 . Om g / m l) 溶 于
P H 7
.
2
,
o
.
01 m ol / L含有 1% S D S 和 l %刀一琉基乙醇的磷酸缓冲液中 , 沸水加热 s m in , 随后样
品对 。 . 1% S D S 和 0 . 1%刀一琉基乙醇的磷酸缓冲液透析 。 用磷酸化酶 B ( 92 , 5 0 0 ) 、 牛血清白
蛋白 ( 6 7 , 0 0 0 ) 、 卵白蛋白 ( 4 5 , 0 0 0 ) 、 碳酸醉酶 ( 3 1 , 0 0 0 ) 和大豆胰蛋白酶抑 $lI 剂 ( 2 1 , 5 0 0 )作
标准蛋白。
5
. 红细胞的凝集作用 : 在微量稀释板上用 2 5川凝集素 ( l m g / m l) 与等 量 P B S 进 行系
列稀释 , 加人 2%血球悬液 2 5川 , 振摇后室温放置 2 小时 , 显微镜下检查凝集结果 。
6
. 糖的抑制作用 : 凝集素样品经系列稀释后 , 加入 25 川糖液 , 混匀 , 加人 25 川 血 球悬
液 , 室温放置 2 小时 , 显微镜下检查结果 。
7
. 化学侧定 : 按 L o w yr 等 〔’ ` , 的方法测定蛋白质 , 用牛血清白蛋白作标准 。 凝集素样品
在抽空处理下用 6 m ol / L HCI , 1 10 ℃水解 2 小时 , 日立 8 35 型氨基酸 自动分析仪测定氨基酸
组成 。 中性糖含量按 D ub io s 等的酚一硫酸法测定 〔` ” ’ , 以葡葡糖作标准 。
8
. 热稳定性实验 : 纯化的凝集素配制成 s m g / lm 浓度 , 水浴中保温每 3 分钟升温 5 ℃ ,
升温至 1 0 ℃ , 每隔 5 ℃取样测定凝集活性 。
9
. 促有练分裂活性 : 对淋巴细胞的促有练分裂作用 , 用人外周血中淋 巴细胞经培养按
il ho 等的方法 〔’ “ J测定 。
4 9 0
结 果 和 讨 论
一 、 凝集素的纯化 CM L的纯化主要分两个步骤 。 浸取液经硫酸钱分级沉淀和在猪胃粘
蛋白亲和柱上层析 。 在硫酸按分级分离中 , 饱和度达 40 一 60 % 时 , 对 A 型血细胞专一的凝
集素组分被沉淀出来 。 此组分用于亲和层析 。 亲和层析柱用 P B S洗涤后 , 被亲和吸附的蛋自
可用 P H 3 . 0 , 0 . l m o l / L 心l y一 H c l (含 l m o l / L N a c l ) 的缓冲液解吸附 ( F i g . z ) 。
P H 7
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F lo w r a t e ; 1 2 m l / h
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.
亲和层析后的凝集素样品尚含有微量杂蛋白 , 可用 eS Ph “ d “ x G一 20 0过滤去除 ( iF g . 2 ) ,
从而获得在 P A G E 图谱上均一的凝集素 , 电泳及扫描图谱见 iF g . 3。 此纯化样品用于以下实
验 。
二 、 纯化凝集素的血型专一性 C M L 的硫酸钱沉淀粗品 , 在蛋白质浓度分别为 15 . 6拌g /
回 、 62 . 5雌 / m l 和 25 卯 g / m l时可分别凝集 A 、 AB 和 B 型血细胞 , 但不凝集 O 型血 。 此凝集
素粗品经猪胃粘蛋白亲和层析后 , 其血型专一性结果见 aT b le l 。 表中列出凝集素凝集 A 、 A B
和 B 型血细胞所需凝集素的最低浓度 。
纯化的 C M L 对人 A型血细胞发生专一凝集 。 当凝集素浓度为 0 . 9 7卜g / m l时 , A型 血 细
胞即可发生凝集反应 ; 凝集素浓度为 1 5 . 6协g / m l 时 , A B 型血也能发生凝集反应 。 但对 B型
血细胞 , 即使凝集素浓度高达 2 0 0 0卜g / lm 时 , 也不发生凝集反应
三 、 精的抑制作用 有关凝集反应的抑制糖类列于 aT b l ” 2 · G aI N A “ 对 C M L与 A 型血细胞
的凝集反应表现出完全的抑制作用 , D一 Gal 表现部分抑制 , 但 G aI N A 。 和 D一 G a l 对 A B型血细
4 9 1
T a b le 1 H e m a g g lu tin a 七 in ga e ti v i七y o f C . m “ c r o 玲 a `a le e 七 in
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9 7林 g/ m l1 5. 6件 g/ m > l2 0 0 0件 g/ rn l
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胞无抑制作用 。
四 、 亚基分子量的测定 C M L 在 S D S一 P A G E 中显示出一个蛋 白质 , 相 当于亚基分子量
4 9
,
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.
4 )
、
S D S一 P A G E 结果表 明 , CM L 只有一种亚基 ( F i g . 3 , C ) 。
。 . 。 . 一 ` , 一 了 ` 一 二一 一 。 。 1 e l e e t r o Ph o r e t i e p a t七e r n a n d e l e e t r o p h o r e t i e 名 e a n n i n g d i a g r a m
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氨基酸组成分析 T a bl e 3列出 C M L 的氨基酸组成分析的结果 。 从表中可见 C M L 含
今山、五`
有 17 种氨基酸 , 其中甘氨酸和谷氨酸含量较高 , 含硫氨基酸甚少 , 分子中无甲硫氨酸 。
C M L 是一种糖蛋白 , 其分子中含有 4 . n %的中性糖 。
T a b l e 3 A m i n o a e i d e o m P o o i七i o n o f C . 饥二 c r o 介 a t a I e e t i n ( % )
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4 7 * U n d e t e r m i
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六 、 促有练分裂活性 C M L的促有练分裂活性测定结果见 T a lb e 4 . 表明 C M L 是一个促有
练分裂原 , 能促使人外周血中淋巴细胞增殖 。
T a b l e 4 T h e a e七i v i t y o f C . m 封 e r o 而 a ` a l e e 七i n i n m i七o g e n e s i s
T r a n s f o r m
e d C e l l s i n N o n
一
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一
T o t a l T r a n s f o r m
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S a m p l e
e e l l s d i v i s i o n m
e d e e ] 15 e e l l吕 七i o n r a 七10 r a 七10
l e e t i n 3 8 4 5 8 2 8 7 7 2 9 6 0
.
6 % 8 0%
经纯化的 CM L 对热表现稳定性 , 当在水浴中温度升高至 80 ℃ 、 5 分钟后 , 其凝集活性
不受影响 , 当温度继续升高时 , 则凝集活性迅速丧失 。 T a b le s 列出 C M L 对热稳定的关系 。
T a b l e 5 H e a七一 s t a b i l i t y t e s t
T
O
C 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5 6 O 6 5 7 0 7 5 8 0 8 5 9 0 9 5 1 0 0
A 七y P e 十 十 十 十 十 十 十 + 十 十
A B t y P e + 十 十 + 十 十
4 9 3
应用猪胃粘蛋白特异性地吸附作用 , 以纯化 A 型血专一凝集的凝集素已有报 道 , 诸 如
V该C`a v i l l o s a 凝集素 [` “ , 、 V `e i a e r a e e a 凝集素 〔“ ] 、 D o l “` h o s b￡f l o r “ s凝集素 [ ’ ]和 p h a s e o l u s
坛 n 。 `时凝集素 [“ ]等 , 用猪胃粘蛋白偶联于 S e P h a or s e 4b 未纯化 A 型血专 一的凝集素是一种
比较地想的方法 , 其纯化步骤比较简单 。 本文第一个报道用猪胃粘蛋偶联于 S eP h a r os e 4 B作
亲和吸附剂 , 从野花生豆的种子中纯化出 A型血专一凝集的凝集素 , 以及共性质研究 的 结
果 。
参 考 文 献
仁1 〕
〔 2 〕
仁3 〕
〔 4 〕
〔 5 〕
〔 6 〕
仁7 刁
〔 8 三
仁9 〕
仁1 0二
〔 1 1〕
〔 1 2〕
仁1 3〕
〕 14二
〔1 5卫
〔 1 6〕
〔 1 7习
B o y d
,
C
.
a n d S h a p le i g h
,
E
.
( 1 9 54 )
, 习 e ` e 冷 e e , 1 1 9 , 4 2 0 .
M a k e l a
,
0
.
( 1 05 7 )
, A , n
.
M e ` . E劣尹艺l . B` 0 1 . 尸 。 : : . , 3 5 , S u p p l . l l , 1一 13 3 .
E t z l e r
,
M
.
E
.
a n d K a b a t
,
E
.
A
.
( 1 9 70 )
, B石o e h e 阴蓄s t 了夕, 9 , 8 6 9一 8 7 7 .
C a r t e r
,
W
.
G
.
a n d E七z le r , 入1 . E . ( 1 0 7 5 ) , 刀 `o e丙e 仍 `s ￡: 夕, 14 , 2 6 5 5一 2 6 9 0 .
B la e i k
,
L
.
J
.
e七 a l . ( 1 9 7 8 ) , B i o 。 无i仍 . B `o 尹人夕s . A e t a , 5 3 2 , 22 5一 2 3 2 .
G a l b r a i t h
,
V.
a n d C o l d s t e x n
,
I
.
J
.
( 1 97 2 )
, B 落o e h e 仍 i s l r 少 , 1 1 , 3 9 76一 3 9 8 4 .
P a n d o l f i n o
,
E
.
R
.
a n d M a g n u s o n
,
J
.
A
.
( 1 98 0 )
, 了 . B `o l . C h e o . , 2 5 5 , 8 7 0一 87 3 .
K a r h l
,
K K
.
a n d G a h m b
e r g , C
.
G
.
( 2 9 5 0 )
, B `o e h ` ,n . B i o夕h 扩、 . 4 o t a , 6 2 2 , 53 7一 3 4 3 .
R u d i g e l、 11 . 〔1 97 7 ) , J . B感o e h e 用 . , 7 2 , 3 17一 3 4 3 .
T o l l e f s s n
,
C
.
F
.
a n d K o r n f e l d
,
R
.
( 1 9 5 3 )
, J
. 厅 i o l . C h e 刀己 . , 2 5 8 , 5 1 6 5一 51 7 1 .
M
a y l i e
一
P f e n n i n g e r
,
M
.
F
.
a n d J a m i e s o n
, J
.
D
.
( 1 9 了。 ) , J . C e l l B￡0 1 . , 80 , 6 9一了6 .
P e a e o e k
,
A
.
C
.
e t a l
.
( 1 6 65 )
,
S e i e 忍 e e ’ 1 4 7 , 1 4 5 1
.
W
e b e r
,
K a n d O s b o r n
,
M
.
( 1 9 69 )
, J
.
B 艺o l . C h e m . , 24 2 , 4 4 0 6一峨4 1 2 .
L o w l下 , O . H . e t a l . ( 2 9 5 1 ) , J . B i o l . C h e 撰 . , 19 3 , 2 6 5一 2 7 5 .
D u b o i s
,
M
.
e t a l
.
( T 9 56 )
, 」 n a l . C h e仍 . , 2 8 , 3 50一 3 5 6 .
I七o h , M . e t a l . ( 2 9 5 0 ) , 注夕r 乞e . B `o l . C h e 价 . , 4 4 , 12 5一 1 3 3 .
C a r t e r
,
W
.
G
.
a n d E r z l e r
, 入I . E . ( 19 7 5 ) , J . B 云o l . C 人e m . , 2 5 0 , 27 5 6一 27 62
P U R I F I CA T I O N A N D C HA R A CT ER I Z A T I O N O F A
L E T CI N W I T HB I O O G DR O U P A S P E CI F I CI T Y F R OM
CR O T A L A R I A M U CR O N A T A
Z e n g , Z h o n g 一 k u i Y a n g , J i n g一 P i n g Z e n g ,
( D e p a r t m e n 七 o f B i o r o g y , S i e h u a n U n i v e r s i t y ,
G u a n g一 y a o
C h e n g d u )
A BS T R AC T
A b l o o d g r o u P A s p e e i f i e l
e e t i n f r o m C r o ￡a l a r i a m z , e r o n a t a s e e d s w a s P u r i f i e d ’
b y a f f i n i t r e h r o m a t o g r a Ph v o n h o g g a s t r i e m u e i n 一 s e P h a r o s e 4 B e o l u m n a n d s u b s e -
q u e n t e l u t i o n w i t h P H 3
.
0
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G l y一 H C I一 m o l / L N a C I . T h e P u r i f i e d I e e t i n g a v e o n e b a n d
o n a e r y l a m i d e g e l e l e e t r o P h o r e s i s a n d o n SD S a e r y l a m i d e g e l e l e e t r o P h o r e s i s
.
T h e
r e s u l t s h o w e d t h a t t h e l e e t i n h a s o n l y o n e k i n d o f
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s u b u n i t
.
T h e m o l e e u l a r w e i g h t
o f s u b u n i t w a s 49
,
0 0 0 w h e n S D S一 p A G E w a s u s e d . A m i n o a e i d a n a l y s i s o f t h e
P u r i f i e d l e e t i n s h o w e d t h a t t h e l e e t i n e砚) n t a i n s a l a r g e a m o u n t o f G l y e i n e a n d
G l u t a m i e a e i d , a n d h轰5 n o M e t h i o n i n e .
T h e p u r i f i e d C r o t a l a r i a m 。 。 r o o a o a l e e t i n e o n t a i n s a b o u t 4
.
1 2% n e u t r a l s u g a r
.
s/ u g a r
.
T h i s P u r i f i e d l e e t i n a g g l u t i n a t e s t y P e A h u m a n
r e d b l o o d e e l l s v e r y s t r o n g l y
,
a n d t y P e AB v e r y s l i g h t l y
,
b u t d o e s n o t a g g l u t i n a t e B o r 0 e e l l s
.
T h e m o s t P o w e r -
f u l i n h i b i t o r o f t h e a g g l u t i n a t i o n o f t y p e A r e d b l o o d e e l l s b y t h e C
.
m u e r o n a t a
l e e t i n i s N 一 a e e t y l一D 一 G a l a o t o s a m i n e . T h i s l e e t i n 1 5 a l s o a m i t o g e n , i t h a s m i t o g e n i c
e f f e e t o n h u m a n P e r i P h e r a l b l o o d l y m P h o e y t e s
.
K e y w o r d s
: L e e t i n G l y e o P r o t e i n C r o t a l a r 汇a m u e r o , ; a t a l e e t i n
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