全 文 ：第 39 卷　第 7 期
2011 年 7 月
西北农林科技大学学报(自然科学版)
Journal of No rthwest A&F Univer sity(Nat.Sci.Ed.) Vo l.39 No.7Jul.2011
1种苎麻根腐病线虫的鉴定 ＊
余永廷1 ,薛召东1 ,曾粮斌1 ,张　岗2 ,陈　权1 ,朱爱国1
(1中国农业科学院 麻类研究所 ,湖南 长沙 410205;2 陕西中医学院药学院 ,陕西 咸阳 712046)
[ 摘　要] 　【目的】对分离的一种苎麻根腐病线虫进行形态和分子生物学鉴定 , 为病原线虫分子生物学检测技
术的研发及苎麻根腐病的防治奠定基础。【方法】从感染苎麻根腐病植株根中分离出一种植物病原线虫 , 利用显微技
术观察线虫的形态特征 , 对其进行初步鉴定;之后采用分子生物学技术 ,提取单条线虫的 DNA , 利用通用保守性引物
扩增了线虫核糖体 DNA 内部转录间隔区(rDNA-ITS)序列 ,并用软件 DNAstar 和 DNAMAN 进行序列分析 ,对该植
物病原线虫进行进一步鉴定。【结果】根据形态特征 ,将获得的苎麻根腐病线虫初步鉴定为咖啡短体线虫。序列分析
结果表明 ,该线虫 rDNA-ITS 序列与咖啡短体线虫湖北种群 、越南种群 、台湾种群 、日本种群及尼日利亚种群的同源
性依次为 99.8%, 99.0%, 98.0%, 97.8%和 94.6%。该线虫 rDNA-ITS 序列在 GenBank 注册号为 HQ403649。【结
论】形态及分子生物学鉴定结果表明 , 分离的苎麻根腐病线虫为咖啡短体线虫(Praty lenchus co f f eae)。
[ 关键词] 　苎麻;根腐病;形态特征;rDNA-ITS;咖啡短体线虫
[ 中图分类号] 　S432.4 +5;S435.63 [ 文献标识码] 　A [ 文章编号] 　1671-9387(2011)07-0105-05
Identificat ion of a nematode isolate from rot root of ramie
YU Yong-ting1 ,XUE Shao-dong1 ,ZENG Liang-bin1 ,
ZHANG Gang2 ,CHEN Quan1 , ZH U Ai-g uo1
(1 Ins ti tu te o f Bast Fiber Cro ps , Chinese Academ y o f Ag ricu lture S ciences , Changsha , H unan 410205 , Ch ina;
2 Col leg e o f Pha rmacy , Shaan xi Universi ty o f Chinese Med icine , X ianyang , Shaanx i 712046 , Ch ina)
Abstract:【Object ive】T he study conducted mo rpholog ical and molecular identification o f a plant para-
sitic nematode isola ted f rom rot roo t of ramie ,which may lay a founda tion fo r developing a molecular detec-
tion method of pathogen and integ rated control.【Method】A plant pathogenic nematode w as isola ted from
rot root o f ramie in Yuanjiang .The nematode w as investig ated under the microscope for ini tial identifica-
tion.rDNA-I TS region w as amplif ied using DNA ex tracted f rom single nematode and sequenced.The se-
quence w as analy sed by DNAsta r and DNAMAN so ftw are fo r furthe r ident ification.【Result】The nema-
to de w as preliminari ly identi fied as P raty lenchus co f f eae by mo rphological characters.Fur thermore , the i-
dent ity o f rDNA-ITS sequence is 99.8%,99.0%,98.0%, 97.8% and 94.6%w ith populations f rom Hubei
(China),Vet Nam , Taiw an , Japan and Nigeria , respectively .The GenBank accession number of this rDNA-
ITS sequence is HQ403649.【Conclusion】The morpho logical and molecular character indicated that the
nematode w as P.co f f eae.
Key words:ramie;roo t rot disease;morphological characters;rDNA-ITS;Praty lenchus cof feae
　　根腐线虫是引起苎麻败蔸的重要原因之一 ,一 旦发生将产生长期的危害 ,严重威胁着苎麻的高产
＊ [ 收稿日期] 　2010-12-17
[ 基金项目] 　现代农业产业技术体系建设专项(nycy tx-19-S18),中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(0032011024)
[ 作者简介] 　余永廷(1980-),男 ,安徽淮北人 ,助理研究员 ,博士 ,主要从事植物-病原物互作的分子基础以及苎麻病虫害防治研究。
E-m ail:yy ting23@yahoo.com.cn
[ 通信作者] 　朱爱国(1973-),男 ,湖南常德人 ,副研究员 ,博士 ,主要从事苎麻栽培与遗传育种及生物信息学研究。
E-m ail:ibfczag@h otm ail.com
DOI :10.13207/j.cnki.jnwafu.2011.07.021
和稳产。20世纪 80年代 ,陈洪福等[ 1-2] 根据苎麻根
腐线虫的形态特征将其鉴定为咖啡短体线虫(Pra-
ty lenchus co f f eae)和穿刺短体线虫(P.penetrans)。
然而 ,这 2种线虫常常发生种内变异 ,给形态区分鉴
定带来很多困难 。随着现代分子生物技术的发展 ,
分子鉴定技术在植物病原线虫区分及鉴定中已得到
广泛应用[ 3-5] 。在短体线虫方面 ,Waeyenberge 等[ 6]
利用 PCR-RFLP 技术 ,分析了 18 种短体线虫的核
糖体 DNA内部转录间隔区(rDNA-ITS)序列特征 ,
并将这些线虫成功区分 。在分析桑尼短体线虫(P.
thornei)随机扩增产物的基础上 , Carrasco-Balles-
tero s等[ 7] 开发出特异性 SCA R引物 ,可以扩增不同
生长阶段的 P.thornei线虫 DNA ,为进一步建立线
虫诊断体系奠定了基础 。T roccoli 等[ 8] 利用 PCR
技术分析了来自西西里岛的一种短体线虫的 ITS
序列特征 ,并结合线虫的形态特征将其鉴定为 P.
lent is n.sp.。利用种群特异性引物 , Yan等[ 9] 利用
PCR技术成功检测并区分了土壤中分离的落选短
体线虫(P .neg lectus)和 P.thornei ,且可以检测到
1 g 土壤中的单条线虫。然而在过去的近 20年中 ,
关于苎麻根腐病的病原物研究报道还较少 ,对病原
线虫的识别仍然停留在形态鉴定阶段 ,关于病原物
有无变异 、优势种如何等问题 ,目前还未见相关研究
报道 ,给全面认识病原物及对其进行防治带来了很
大的困难 。本研究首先自沅江苎麻感染根腐病植株
根中分离出一种植物病原线虫 ,然后利用形态学以
及分子生物学方法对其进行鉴定 , 旨在为病原
物分子检测方法的建立及苎麻根腐病的防冶奠定基
础。
1　材料与方法
1.1　材　料
1.1.1　样品采集　2009-09 ,从中国农业科学院麻
类研究所沅江试验站农场试验田 ,选择生长矮小 、分
株少 、地下茎及根变成黑褐色 、内部呈海绵状腐朽 ,
为典型根腐线虫危害症状的苎麻根腐病重症病株 ,
采集病根 ,带回实验室 ,放置在 4 ℃冰箱保存 。
1.1.2　载体与试剂　大肠杆菌感受态细胞 DH5α、
pGM-T Vecto r、琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒 、质
粒小提试剂盒 ,均购自天根生物技术有限公司;2×
Pow er Taq PCR M asterMix ,购自百泰克生物技术
有限公司;DNA 分子量标准品(DGL 2000 DNA
Marker),购自北京鼎国生物技术有限公司;其他试
剂均为进口或国产分析纯 。
1.2　方　法
1.2.1　线虫分离　采用改进的贝曼漏斗法[ 10] 从苎
麻根腐病植株根中分离线虫 ,室温静置 24 h 后取出
线虫悬浮液 ,在 10倍光学显微镜下观察 ,选择植物
病原线虫 ,收集到含有少量 ddH 2O 离心管中 ,并命
名为 YJ-1100。
1.2.2　形态观察　将收集的线虫温热杀死 ,制成临
时玻片 ,用光学显微镜(Olympus)观察 、拍照 ,并记
录虫体状态 ,头冠 、口针 、食道腺与肠的位置关系 、交
合伞(刺)特征 、尾部特征等。观察雌雄虫各 10 ～ 15
条 ,按照 de M an 公式[ 10] 测量虫体相关部位位置数
据。
1.2.3　分子生物学鉴定　(1)DNA 提取 。挑取分
离的线虫若干条 ,用体积分数 70%乙醇表面消毒 2
min ,再用无菌水洗涤 2次。挑取灭菌的单条线虫放
入灭菌的 200 μL PCR管中(约含 10 μL 灭菌水),
-70 ℃放置 1 h ,解冻后依次加入 10×PCR缓冲液
3μL 、蛋白酶 K (2 mg/mL)5 μL 、灭菌水12μL ,65
℃放置 1 h , 95 ℃ 20 min , 14 000 r/min 离心 2
min ,取上清液备用[ 11-12] 。设置 10个重复。
(2)PCR扩增 。参考文献[ 13]的方法 ,用通用
保守性引物Pc1(5′-CG TAACAAGG TAGCTGT
AG-3′)和 Pc2(5′-TCCTCCGCTAAATGA TATG-
3′)扩增线虫 ITS 序列 ,引物由上海生工合成。PCR
反应体系为:DNA 模板(40 ng)2 μL , Pc1(10
μmol/L)1 μL , Pc2(10 μmol/ L)1 μL , 2 ×Pow er
Taq PCR MasterM ix(Taq 酶活性 5 U/μL)12.5
μL ,加无菌去离子水至 25 μL。反应程序:94 ℃4
min;94 ℃45 s ,54 ℃45 s , 72 ℃60 s , 32个循环;
72 ℃10 min。设置 3个重复 。
(3)PCR产物的回收 、克隆及测序。将 PCR产
物用 15 g/L 琼脂糖凝胶电泳分离 ,回收目的 DNA
片段。将纯化的 PCR产物与 pGM-T 载体连接 ,连
接产物转化大肠杆菌感受态细胞 DH5α,经蓝白斑
筛选 、菌落 PCR鉴定后获得阳性克隆 ,将阳性克隆
培养并提取重组质粒进行序列测定(上海生工)。测
序结果采用序列分析软件 DNAstar(Ver sion 5.0)
和 DNAMAN(Version 6.0)分析。
2　结果与分析
2.1　苎麻根腐病线虫的形态特征
苎麻根腐病线虫分离结果显示 ,每克受害病根
组织中植物病原线虫数量达 110条 。该病原线虫经
温热杀死后呈“J”型 。雌虫虫体圆筒形 ,阴门至头端
106 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 39 卷
体宽几乎相等 ,肛门后变窄;侧线 4条;唇环数 2个 ,
唇区低平 ,不缢缩 ,口针强壮 ,基部球圆形;中食道球
圆形 ,食道腺呈长叶状 ,覆盖于肠腹 、侧面 ,其长度是
体宽的 2 ～ 3倍;排泄孔在神经环附近;单卵巢 ,卵母
细胞单行排列 ,受精囊卵圆形;尾端宽圆或平截 ,有
缺刻。雄虫与雌虫形态相似 ,交合刺弓状 ,纤细 。交
合伞包裹尾端。其形态特征(图 1)、测量数据(表 1)
与 Roman等[ 1 4] 以及 Siddiqi[ 15]报道的咖啡短体线虫
的形态特征相似 。故将苎麻根腐病根中分离的线虫
初步鉴定为咖啡短体线虫 。
图 1　苎麻根腐病线虫的形态特征
a.雄虫;b.雌虫;c.雌虫前端;d.阴门(箭头处);e.雌虫尾端;f ～ h.雄虫尾端。放大率:a～ b.100×;c～ h.400×
Fig.1　Morpholog y o f nematode iso lates from ro t roo t of ramie
a.Male;b.Female;c.An terior of female;d.Vu lva region(arrow);e.T ail end of female;f-h.T ail end of m ale.
M agnif ication:a-b.100×, c-h.400×
表 1　苎麻根腐病线虫形态指标测量值与文献记载线虫的比较
Table 1　Comparison o f morphological measurements o f a nema tode population f rom ramie r ot ro o t w ith
the description of P.co f f eae in litera ture s
形态指标
Mopholo gical
index
沅江种群
Yuanjiang population
Praty lenchus co f f eae
♂ ♀ ♂[ 14] ♀[14] ♂[ 15] ♀[ 15]
n 10 13 25 25
L/μm
平均值
Average
624.6±44.8 582.3±106.5 516.8±7.9 592.7±10.5
观测值
Observa tion
value
584.6 ～ 692.3 430.8 ～ 715.4 430.7～ 600.0 516.4 ～ 721.2 450～ 700 450 ～ 700
a 28.9±3.0(24.9～ 35.8) 25.3±4.6 (18.6 ～ 32.4) 27.8±0.5(23.5 ～ 32.2) 26.3±0.6(20.1～ 33.7) 24～ 26 25 ～ 35
b 6.4±0.6(5.7 ～ 7.3) 6.4±1.0 (5.1～ 8.8) 6.4±0.1(5.1～ 7.0) 6.7±0.1(5.2 ～ 7.5) 6～ 7 5 ～ 7
c 22.0±2.6(17.4～ 27.3) 17.1±3.8 (10.2 ～ 23.2) 19.5±0.3(17.1 ～ 23.0) 18.2±0.3(14.9 ～ 20.8) 17～ 24 17 ～ 22
V 81.0±1.4 (79.3 ～ 82.3) 78.6±0.3(74.0～ 79.0) 76 ～ 83
St/μm 13.3±1.7(13.5～ 16.3) 15.1±1.2 (13.5 ～ 16.3) 14.4±0.1(13.8 ～ 15.6) 15.5±0.1(14.4～ 16.8) 15～ 17 15 ～ 18
Sp/μm 15.4±1.1(9.6 ～ 15.4) 16.2±0.3(15.0 ～ 18.0) 16～ 20
　　注:n.样品数;L.体长;a.体长/最大体宽;b.体长/体前端至食道与肠连接处的距离;c.体长/尾长;V.体前端至阴门的距离/尾长;S t.口针
长;Sp.交合刺长。
Note:n.Number of sample;L.Body length;a.Ratio of body leng th and maximal body w idth;b.Ratio of body length and distance f rom ante-
rior to joint of gu llet and intestine;c.Ratio of body length and tai l length;V.Ratio of dis tance f rom anterior end to vulva and tail
length;St.Stylet length;Sp.Spicule leng th.
107第 7 期 余永廷 ,等:1 种苎麻根腐病线虫的鉴定
2.2　苎麻根腐病线虫 rDNA-ITS 序列的 PCR扩增
根据苎麻根腐线虫形态特征 ,在将其初步鉴定
为咖啡短体线虫的基础上 ,进一步采用分子生物学
方法对其进行鉴定。首先提取线虫的 DNA ,以提取
的线虫 DNA 为模板 ,用引物 Pc1 和 Pc2 进行 PCR
扩增 ,得到大小为 1 100 bp 左右的片段(图 2)。将
扩增片段回收纯化后 ,克隆到 pGM-T 载体上 ,连接
转化后 ,通过菌落 PCR检测可知 ,重组质粒中含有
目的片段 。
2.3　苎麻根腐病线虫的 rDNA-I TS序列分析
利用 NCBI网站的 BLAS TN程序 ,将本试验测
序所得序列进行相似性搜索 ,结果显示 ,该序列与编
号为 HM469441 ～ 45(1 029 ～ 1 248 bp ,湖北种群)、
FJ799119(1 249 bp , 台湾种群)、FJ827744 ～ 47
(1 249 bp ,台湾种群)、AB053485(959 bp ,日本种
群)、FJ712902 ～ FJ712906(1 022 ～ 1 026 bp ,越南种
群)、AY561436(1 215 bp ,尼日利亚种群)的序列具
有较高的相似度(均在 90%以上),这些均是咖啡短
体线虫(P .cof feae)rDNA 18S-ITS1-5.8S-ITS2-
28S 的部分序列。将本试验获得 ITS 序列提交至
GenBank ,获得登录号 HQ403649。
利用 DNA star软件对本试验得到的序列与以
上 6个种群(其中湖北种群 、台湾种群 FJ827744 ～
47 、越南种群 ,分别选取序列最长的序列)进行比对 ,
结果表明 ,其与 AY561436种群的碱基差异相对较
多(51个碱基),与其他 5个种群基本无碱基差异。
　　利用序列分析软件 DNAMAN 对以上序列进
行同源性分析 ,结果(图 3)发现 ,本试验中苎麻根腐
线虫种群与咖啡短体线虫(P.co f f eae)中国湖北种
群(HM469441)的同源性最高(99.8%),其后依次
为越南种群(FJ712905 ,同源性 99.0%)、台湾种群
(FJ827747和 FJ799119 ,同源性均为 98.0%)、日本
种群(AB053485 ,同源性 97.8%),与尼日利亚种群
(AY561436)同源性相对最低(94.6%)。
图 2　苎麻根腐病线虫 rDNA-ITS 的 PC R扩增产物检测
M.DGL2000;1.阴性对照;2～ 4.扩增产物(3条单个线虫)
F ig.2　PCR amplification re sults o f of the rDNA-ITS region
of the nematode of ramie ro t roo t
M.DGL2000;1.Negat ive cont rol;2-4.Ampli ficat ion
products(three single nematodes)
图 3　基于 rDNA-ITS 序列苎麻根腐病线虫种群与
其他 6 个线虫种群的同源树
Fig.3　Construction of homo lo gy tree by analy sis of
rDNA-ITS reg ion sequences of nematode population fr om
rot roo t of ramie and of o the r six nematode populations
3　结论与讨论
根据形态特征以及 rDNA-ITS 序列特征 ,本研
究将引起沅江苎麻根腐病的病原线虫鉴定为咖啡短
体线虫(P.co f f eae)。咖啡短体线虫是一种能够危
害多种作物的病原线虫 ,它与穿刺短体线虫均能危
害苎麻 ,二者形态特征比较接近 ,传统的鉴定及区别
方法是利用头部 、消化道 、尾部及性器官形态特征的
不同加以区分。这不仅要求观察几十头甚至上百头
线虫 ,并且要求有较丰富的实践经验。此外 ,线虫的
种内变异 ,加大了利用形态特征辨别某些线虫的难
度。研究线虫的分子生物学特征就可以解决这一问
题。 rDNA 在生物体内大量存在 ,其 ITS 非编码区
在个体间差异较小。 rDNA-ITS 序列特征常用于种
及种下水平的分子鉴定。研究线虫 rDNA 的序列
特征 ,有的利用单条线虫 DNA 作为 PCR反应的模
板[ 8 , 16] ;有的在挑选线虫后进行纯培养 ,再以多条线
虫的 DNA 作为模板[ 6 , 9] 。无论是单条线虫还是多
条线虫 ,所用的线虫(群体)分子生物学背景需一致 ,
试验结果才会可靠。由于单条线虫 DNA 提取方法
108 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 39 卷
已经成熟 ,本研究采用单条线虫 DNA 作为模板 ,减
少了线虫培养的步骤;此外 ,单条线虫不仅适合线虫
样本量较少的操作 ,而且适合进行检验与检疫 。
本研究分离的苎麻根腐病线虫种群与咖啡短体
线虫中国湖北种群同源性最高 ,与咖啡短体线虫越
南种群 、中国台湾种群 、日本种群 、尼日利亚种群的
同源性依次降低 ,同时 2 个咖啡短体线虫台湾种群
之间的同源性也最高。这可能是区域差异(比如海
洋的阻隔),也可能是由于咖啡短体线虫的种内变异
所致 。
在本研究的基础上 ,笔者下一步的工作重点是 ,
将在国内多个苎麻栽培地区采集根腐线虫样品 ,对
其进行 rDNA-ITS 序列特征分析 ,以期开发出快速
检测苎麻根腐线虫的分子生物学技术。
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