全 文 ：收稿日期:2010-05-11;　修订日期:2010-11-28
基金项目:国家科技支撑计划(No.2006BAC02A11);
湖北省科技厅科技攻关项目(No.2007AA301B62);
湖北省教育厅中青年项目(No.θ201001610)
作者简介:张　贤(1984-),女(汉族),湖北黄冈人 ,武汉纺织大学硕士研
究生 ,主要从事天然药物化学研究工作.
＊通讯作者简介:崔永明(1978-), 男(汉族),河南驻马店人 ,现任武汉纺
织大学副教授 ,博士学位 ,主要从事从事植物资源开发与应用研究工作.
苎麻根抗氧化活性部位研究
张　贤 ,陈　悟 ,周文聪 ,祝　荻 ,靖海瑞 ,曾庆福 ,崔永明＊
(武汉纺织大学纺织印染清洁生产教育部工程研究中心 ,湖北 武汉　430073)
摘要:目的 研究苎麻根 4种不同极性萃取物中总黄酮含量及其抗氧化作用。方法 采用硝酸铝显色法 , · OH自由基体
系和 O2 -·自由基体系 ,以苎麻根 4种不同极性的萃取物为研究对象 , 测定苎麻根四相萃取物中总黄酮含量 , 研究不同
萃取物的抗氧化作用。结果 醋酸乙酯相萃取物抗氧化活性最强 , 该相萃取物对· OH自由基的清除率为 65.74%, 对
O2 -·自由基的清除率为 48.88%, 与抗氧化剂 BHT相当 ,但比 Vc稍差;同时该相中总黄酮含量为 9.76%, 正丁醇相萃取
物中总黄酮含量为 14.38%,其它两相萃取物几乎不含总黄酮。结论 苎麻根中起抗氧化作用的可能是醋酸乙酯相中低
极性的黄酮苷元。
关键词:苎麻根萃取物;　总黄酮;　自由基;　抗氧化活性
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2011.04.050
中图分类号:R284.2;R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2011)04-0896-02
StudyontheAntioxidativeActivitiesofExtractsfromRootofBoehmerianivea
ZHANGXian,CHENWu,ZHOUWen-cong, ZHUDi,JINGHai-rui,ZENGQing-fu, CUIYong-ming＊
(EngineeringResearchCenterforCleanProductionofTextilePrinting, MinistryofEducation, WuhanTextileU-
niversity, WuhanHubei430073 , China)
Abstract:ObjectiveTostudythecontentoftotaflavonoidsinfourdiferentextractsofBoehmercanivearootsanditsantioxida-
tiveactivity.MethodsFourdifferentextractsofBoehmerianivearootswereevaluatedforcontentsoftotalflavonoidsbynitricacid
aluminummethod, andtheantioxidativeactivitiesofthefourdiferentextractswerestudiedbyhydroxylfreeradical(· OH)sys-
temandsuperoxideanionfreeradical(O2-· )system.ResultsEthylacetateextracthadthebestscavengingrateagainsthydroxylradicalandsuperoxideanionradical, whichwas65.74%, 48.88%, respectively.ItwasthesameantioxidantactivityasBHT,
butlowerthanVc.Inaddition, theresultsalsoshowedthatthecontentoftotalflavonoidsinethylacetateextractandn-butylal-
coholextractwere9.76%, 14.38%, respectively.Buttheothertwoextractshadnoflavonoids.ConclusionTheantioxidative
activitiesofBoehmerianivearootsmaybecausedbythelowpolarityflavonoidaglyconesinethylacetateextract.
Keywords:ExtractsofBoehmerianivearoots;　Totalflavonoids;　Freeradical;　Antioxidantactivity
　　在人体生命活动中有多种生化反应会产生多种活性氧自由
基 , 其中 O2 -·产生最早 , · OH自由基活性最高且造成的氧化
性损伤也最大 [ 1] , 因而 ,一旦自由基产生过多或抗氧化体系出现
故障 , 就会导致脂质过氧化 、细胞损伤 、DNA断裂等 [ 2] 。所以 ,寻
找毒副作用小 , 疗效好的清除活性氧自由基的天然活性物质对防
治上述危害的发生十分重要。
苎麻 Boehmerianivea(Linn.)Gaudich原产中国 , 属于荨麻科
苎麻属植物。苎麻种植和苎麻产品在我国有着悠久的历史。苎
麻是我国特有的以纺织为主要用途的农作物 , 是我国国宝 , 同时
它也是传统中药 , 明朝李时珍在著名的医学著作《本草纲目》中 ,
对苎麻 , 特别是苎麻根的药用功能作了详细的记载和阐述;在我
国台湾它也被用作利尿剂 , 退烧药和护肝药物。苎麻根具有广泛
的生物活性 , Huang和 Chang等研究表明 [ 3 , 4]苎麻根萃取物在体
外 HepG2 2.2.15细胞中和乙肝病毒血症 SCID鼠体内均能抑制
乙肝病毒活性和产生。 Lin等 [ 5]研究表明苎麻根粗提物具有清
除自由基 、抗 FeCl2 -抗坏血酸诱发的脂质过氧化等多种生理作
用 , 但其主要抗氧化活性成分还不是很清楚。
本研究以苎麻根为原料 , 采用乙醇萃取 , 然后用不同有机溶
剂进行萃取 , 获得了不同极性萃取物 ,并对萃取物清除超氧阴离
子自由基 、羟基自由基的能力进行研究 , 同时对各萃取物中的总
黄酮进行了定量测定 , 以期阐明苎麻根抗氧化活性部位物质基
础 , 并为苎麻根开发植物源抗氧化剂或功能性食品提供科学依
据。
1　材料与仪器
1.1　材料与试剂 苎麻麻根 , 采自湖北咸宁 , 采后在 40℃烘箱中
烘干至恒重。
芦丁标准品 、天然抗氧化剂 Vc、合成抗氧化剂:2, 6-二叔丁
基对甲酚(BHT)均购自国药集团化学试剂有限公司;石油醚 、醋
酸乙酯 、正丁醇 、亚硝酸钠 、硝酸铝 、氢氧化钠 、无水乙醇 、水杨酸 、
硫酸亚铁 、邻苯三酚均为分析纯 , 购自上海实验试剂有限公司。
1.2　仪器 CPA225D电子分析天平 , Sartorius公司;DF-101S型
集热式恒温水浴锅 ,上海东玺制冷仪器设备有限公司;UV-1201
型紫外可见分光光度计 ,北京瑞利公司;RE-52A型真空旋转蒸
发仪 , 上海亚荣生化仪器厂;SB-120D型超声波清洗器 , 宁波新
芦生物科技股份有限公司;AFZ-4001 -UT分子生物型超纯化
水器 , 艾科浦公司。
2　方法
2.1　苎麻根不同极性萃取物的制备 将干燥的苎麻麻根粉碎后 ,
过 80目筛备用。取苎麻根粉末用 10倍量 75%乙醇回流萃取 3
次 , 合并萃取液减压浓缩后得浸膏。
将浸膏加热水溶解后 , 依次用等体积石油醚 , 醋酸乙酯和正
丁醇分别萃取 3次 , 合并各自的萃取液并保留最后的水相。各相
(4种)经旋转蒸发仪浓缩 ,真空冷冻干燥后分别收集得到石油醚
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时珍国医国药 2011年第 22卷第 4期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.4
相萃取物 , 醋酸乙酯相萃取物 ,正丁醇相萃取物和水相萃取物 ,并
置于干燥器内保存备用。
2.2　芦丁标准曲线的制作 [ 6] 准确称取芦丁标准品 5.0 mg, 置
于 50ml容量瓶中 ,用 70%乙醇定容 , 得到 0.1 mg/ml的芦丁标
准溶液 , 分别准确吸取该标准溶液 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0
ml于 10ml容量瓶中 , 加 70%乙醇定容至 5 ml,加 5%亚硝酸钠
溶液 0.3 ml,摇匀静置 6min后 , 加 10%硝酸铝溶液 0.3 ml, 摇匀
后静置 6 min, 再加 1mol/L氢氧化钠溶液 2ml,混匀 , 70%乙醇定
容至 10ml, 静置 30 min, 在 500 nm下测定其吸光度。 以芦丁标
准品的浓度 X(mg/ml)为横坐标 , 以吸光度值 Y为纵坐标 , 绘制
标准曲线见图 1,回归方程 Y=14.339X+0.015, 并求相关系数
R2 =0.999 4。
图 1　芦丁标准曲线
2.3　苎麻根各相萃取物总黄酮含量测定 分别称取四相萃取物
0.05 g,用 50ml乙醇溶解 , 分别精确吸取各相溶液 1 ml, 置于 4
个具塞试管中 , 加 70%乙醇定容至 5ml,加 5%亚硝酸钠溶液 0.3
ml, 摇匀静置 6min后 , 加 10%硝酸铝溶液 0.3 ml, 摇匀后静置 6
min,再加 1 mol/l氢氧化钠溶液 2 ml, 混匀 , 70%乙醇定容至
10ml,静置 30min,在 500 nm下测定其吸光度 , 由回归方程计算
出总黄酮含量。
2.4　苎麻根各相萃取物抗氧化活性测定
2.4.1　羟基自由基(· OH)清除能力的测定 采用 Fenton反应
产生· OH,参照刘晓丽等 [ 7]的方法略加修改。在 10 ml的具塞
试管中依次加入 9 mmol/L水杨酸 -乙醇溶液 1 ml, 9mmol/LFe-
SO4 1 ml(现配现用), 再加入不同浓度样品溶液 1 ml, 最后加入
8.8 mmol/LH2O2 1ml启动整个反应 , 37℃反应 15 min后 , 4 000r/min离心 3min, 在 510 nm下测定吸光度为 A1。考虑待测溶液
本身的吸光值不同 , 取 1 ml的蒸馏水代替 Fe2+溶液(9mmol·
L-1)所测得的吸光度为 A2;取 1 ml双重蒸馏水代替待测样品所
测得的吸光度为 A3 , 以抗坏血酸 Vc和抗氧化剂 BHT为对照实
验。羟自由基的清除率计算公式为:P(%)=[ A3 -(A1 -A2)] /A3 ×100%。
2.4.2　超氧阴离子自由基(O2 -· )清除能力的测定 通过邻苯
三酚反应体系 , 采用分光光度法测定萃取物对超氧阴离子的清除
作用 [ 8] 。预先在各具塞试管中加入 5.7 ml50 mmol/L的 Tris-
HCl缓冲液(pH8.20),再加入 0.2 ml样品 , 于 25℃保温 10 min,
然后加入 25℃预热的 6mmol/L邻苯三酚 0.1ml,总体积 6.0ml,
迅速摇匀后于 320 nm处测定吸光度 A2 ,反应 1min时开始测定 ,
每隔 30s记录吸光值 , 观察吸光度随时间的变化 , 至反应 5min,
另取试剂同上 , 将样品用等体积蒸馏水代替 , 以 Tris-HCl做空
白参比 ,同法测定反应 1 ～ 5 min时吸光度值 A1 ,记录邻苯三酚的
自氧化速率。以抗坏血酸 Vc和抗氧化剂 BHT为对照实验。根
据邻苯三酚自氧化速率计算抑制率:抑制率(%)=(ΔA1 /Δt-ΔA2 /Δt)/(ΔA1 /Δt)×100%
式中:ΔA
1
/Δt-邻苯三酚自氧化时反应速率 , ΔA
2
/Δt-加入
萃取物后邻苯三酚自氧化反应速率。
3　结果
3.1　苎麻根各相萃取总黄酮含量 苎麻根各相萃取物中总黄酮
含量测定结果见表 1。 正丁醇相萃取物中总黄酮含量最高 , 为
14.38%;醋酸乙酯相萃取物中总黄酮含量略低 , 为 9.76%, 石油
醚相萃取物和水相萃取物中检测不到总黄酮。
表 1　苎麻根各相萃取物的总黄酮含量 %
样品名称 总黄酮含量
石油醚相萃取物 -
醋酸乙酯相萃取物 9.76
正丁醇相萃取物 14.38
水相萃取物 -
3.2　苎麻根各相萃取物对 · OH自由基的清除能力 羟基自由
基是最活泼 、毒性最大的自由基 , 因而对羟基自由基的清除能力
是反映样品抗氧化作用的重要指标 [ 9] 。参照 Fenton反应的方法
建立· OH自由基产生体系模型 , H
2
O
2
与二价铁离子混合反应产
生· OH和 Fe3+, · OH具有很高的反应活性 , 存活时间短 , 但在
反应体系中加入水杨酸可有效捕捉· OH并产生有色产物 ,若加
入具有清除· OH的被测物 , 便会与水杨酸竞争· OH, 从而有色
产物的生成量减少。见图 2。
图 2　苎麻根各相萃取物对· OH自由基的清除能力
由图 2可知 , 随着样品浓度的增大 , 各相萃取物对 · OH自
由基清除率也依次增强 ,但各相萃取物清除· OH自由基也存在
较大差异。与天然抗氧化剂 Vc相比 ,水相和石油醚相萃取物清
除· OH自由基能力很弱;醋酸乙酯相萃取物清除 · OH自由基
能力均强于其它各相萃取物 ,但比 Vc清除 · OH自由基能力弱 ,
与 BHT清除能力相当。
3.3　苎麻根各相萃取物对 O2 -· 自由基的清除能力 O2 -· 是
机体内寿命最长的自由基 ,一般情况下作为自由基链式反应的引
发剂 , 产生活性更强的 · OH自由基 , 给机体造成进一步的损
伤 [ 10] 。
通过邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化释放 O2 -· , O2 -·
有加速邻苯三酚自氧化速度 , 生成一系列有色中间产物 , 当加入
具有清除 O2 -·功能的被测物 ,便可抑制中间产物的形成。以回
归方程的斜率作为邻苯三酚的自氧化速率 ,并计算出清除率来反
映萃取物对 O2 -·自由基的清除能力。由图 3可知 ,在该体系中
四相萃取物对邻苯三酚自氧化速率具有一定程度的抑制作用 , 其
抑制率的大小依次为:Vc>醋酸乙酯相萃取物 >BHT>正丁醇相
萃取物 >水相萃取物 >石油醚相萃取物 ,其中水相萃取物和石油
醚相萃取物对 O2 -·自由基清除能力比较弱 ,明显不及醋酸乙酯
相萃取物。另外 ,随样品质量浓度的增大 , 对 O2 -·自由基清除
能力先增加 , 到达一定程度后又开始减弱 , 醋酸乙酯相萃取物对
O2 -·自由基清除率最高可达 48.88%,但相比较与 Vc来说还是
较弱 , 稍微强于 BHT。见图 3。
图 3　苎麻根各相萃取物对 O2 -·自由基的清除能力
4　讨论
实验结果表明 , 苎麻根各相萃取物清除 · OH自由基和
O2 -·自由基的能力各不相同 ,其中醋酸乙酯相萃取物清除能力
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.4 时珍国医国药 2011年第 22卷第 4期
最强 , 但该相中总黄酮含量低于正丁醇相萃取物中总黄酮含量。
水相和石油醚相萃取物中几乎不含总黄酮 ,而且清除自由基能力
很弱。由于生物总黄酮是一大类天然产物 ,其中高极性的黄酮苷
多存在于正丁醇相萃取物中 ,低极性的黄酮苷元则多存在于醋酸
乙酯相萃取物中 , 各种研究和实验也证明 , 黄酮苷元的抗氧化活
性明显优于黄酮苷 [ 11～ 13] , 并且黄酮苷元比黄酮苷具有更高的生
物利用度 , 本实验研究表明苎麻根中起抗氧化作用的可能是醋酸
乙酯相中低极性的黄酮苷元。
醋酸乙酯相萃取物的抗氧化活性与 BHT的抗氧化活性相
当 , 但与 Vc相比 , 其抗氧化能力较弱 , 这可能是因为本实验所使
用的 Vc为纯品 ,本身具有较强的清除自由基能力 , 而苎麻根醋
酸乙酯萃取物还未经进一步的萃取和纯化处理。
由于各相萃取物中总黄酮含较多杂质 ,因而需进一步对苎麻
根中总黄酮进行分离 、纯化与抗氧化活性检测 , 进而探明苎麻根
黄酮类成分结构与抗氧化活性的关系 ,以期为从苎麻根中筛选出
高效抗氧化活性物质提供依据。
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收稿日期:2010-04-20;　修订日期:2010-09-10
基金项目:吉林省教育厅项目(No.2008-319);
吉林省中医药管理局项目(No.08sys-020)
作者简介:张文风(1970-),女(汉族),吉林德惠人 ,现任长春中医药大学
副教授 ,硕士研究生导师 ,博士学位 ,博士后 ,主要从事中药复方的配伍及
机理研究工作.
糖尿病大鼠血液流变学与坐骨神经细胞凋亡的相关性
及中药复方的干预研究
张文风 ,苏　鑫 ,粟　栗
(长春中医药大学 ,吉林 长春　130117)
摘要:目的 探究糖尿病大鼠血液流变学与坐骨神经细胞凋亡的相关性及益气活血通络中药的干预作用。方法 采用链
脲佐菌素复制糖尿病大鼠模型 ,随机分为模型组 、中药组 、弥可保组 , 并设正常对照组。检测血液流变学及坐骨神经细胞
凋亡情况。结果 糖尿病大鼠血液流变性发生改变 , 坐骨神经细胞发生凋亡 , 中药组与糖尿病模型组及弥可保组比较均
有显著差异。结论 糖尿病大鼠血液流变学与坐骨神经细胞凋亡具有相关性 , 益气活血通络中药对二者具有改善作用 ,
从而防治糖尿病周围神经病变。
关键词:糖尿病;　血液流变学;　坐骨神经;　细胞凋亡;　中药复方
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2011.04.051
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2011)04-0898-02
　　糖尿病周围神经病变(DPN)是糖尿病的慢性并发症之一 , 随
着病程的延长 , 发病率可达 90%以上 [ 1] 。 DPN的发病机制较为
复杂 , 目前缺乏安全有效的治疗方法及药物。 以往研究表明 , 以
益气活血通络为治法的中药复方能够改善糖尿病大鼠血液流变
学 、提高坐骨神经传导速度 、调节血清胰岛素 、C肽的分泌 、降低
糖化血清蛋白及坐骨神经 AGEs含量 [ 2 ～ 5] 。本实验在前期研究
的基础上 , 继续探究糖尿病大鼠血液流变学与其坐骨神经细胞凋
亡的相关性及中药干预作用 ,旨在揭示其防治机理。
1　试剂与仪器
链脲佐菌素(STZ):美国 SIGMA公司。中药复方由黄芪 、桂
枝 、葛根 、水蛭组成 , 由本校制剂室提供。弥可保(卫材(中国)药
业公司生产),全自动血液流变快测仪 FASCO-3010(重庆大学
维多生物工程研究所), TNNUL细胞凋亡试剂盒(北京中山生物
技术有限公司),病理切片机(德国 Leica公司),光学显微镜及成
像系统(日本 Olympus公司)。
2　方法
2.1　实验模型的建立 选用 8周龄雄性健康 Wistar大鼠 ,体质量
220 ～ 250g。适应性饲喂 1周后 ,禁食 12h,将链脲佐菌素临用前
用 0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液(pH 4.2, 4℃)配成 2%浓度溶液 ,
按剂量 50mg/kg左下腹腔内单次注射 , 72h后取尾血测血糖 , 凡
血糖≥16.7 mmol/L作为糖尿病大鼠。适应性喂养 3 d后将糖尿
病大鼠随机分为 3组 , 即模型组 、中药组 、弥可保组。每组 10只。
并取体质量 、鼠龄相匹配的同批正常大鼠 10只 , 用 0.1 mmol/L
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时珍国医国药 2011年第 22卷第 4期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.4