全 文 ：绿豆芽中异黄酮类成分提取工艺的优化及含量测定
董银卯1，2，唐冬雁1，何聪芬2，赵 华2
( 1．哈尔滨工业大学化学系，黑龙江哈尔滨 100051; 2．北京工商大学化学与环境工程学院，北京 100048)
摘要 ［目的］确定绿豆芽中黄酮类成分的最佳提取工艺及绿豆发芽过程中大豆异黄酮类成分牡荆素和异牡荆素的变化趋势。［方法］
采用正交试验优化绿豆中异黄酮类成分的提取工艺，用 HPLC法测定牡荆素和异牡荆素在绿豆发芽过程中( 0 ～6 d) 的含量。［结果］绿
豆芽中异黄酮类成分的最佳提取工艺为: 提取次数 1次，提取时间 90 min，提取溶剂为 50%乙醇，料液比为 1∶ 50。绿豆发芽第 4天，牡荆
素和异牡荆素的含量最高，但均低于其在绿豆中的含量。［结论］该研究为绿豆及绿豆芽的开发和利用提供了良好的理论基础。
关键词 绿豆芽;提取工艺;牡荆素;异牡荆素;高效液相色谱( HPLC) 法
中图分类号 S132 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2011) 10 －05746 －02
Optimization of Extraction Process of Isoflavonoids from Mung Bean Sprout and Determination of Its Content
DONG Yin-mao et al ( Department of Chemistry，Harbin Institute of Technology，Harbin，Heilongjiang 100051)
Abstract ［Objective］To optimize the extraction process of the isoflavonoids from the mung bean sprouts and the variation tendency of the main
isoflavonoids like vitexin and isovitexin during the germination of mung bean． ［Method］The orthogonal experiment was used to optimize the ex-
traction conditions of isoflavonoids，and high performance liquid chromatography ( HPLC) method was used to determine contents of vitexin and
isovitexin during the germination of mung bean ( 0 －6 days) ． ［Result］The optimum extraction conditions of vitexin and isovitexin in mung bean
were determined to be: one time of extraction times，90min of extraction duration，50% ethanol of extracting solvent and 1∶ 50 of solid to liquid ra-
tio． The contents of vitexin and isovitexin reached the highest on the fourth day during the germination，both of which were lower than those in the
mung bean． ［Conclusion］This case provides theoretical basis the development and utilization of mung bean and mung bean sprouts．
Key words Mung bean sprouts; Extraction process; Vitexin; Isovitexin; HPLC
作者简介 董银卯( 1963 － ) ，男，北京人，教授，硕士生导师，硕士，从事
植物活性成分提取的研究，E-mail: ymdong2008@ 163． com。
收稿日期 2011-01-11
绿豆( Mung bean) ，又名青小豆、录豆、植豆，为豆科植物
绿豆( Vigna radiata) 的成熟种子，原产于我国。绿豆用途广
泛，民间称之可“养地、养人、养禽畜”。绿豆芽 ( Mung bean
sprout) ，别名豆芽菜，为绿豆浸泡后发出的嫩芽，主要食用部
分为下胚轴。绿豆芽性凉，味甘，具有清暑热、通经脉、补肾、
利尿、消肿、滋阴壮阳、利湿热、降血脂和软化血管等功效，适
用于治疗湿热郁滞、食少体倦、热病烦渴、大便秘结、小便不
利、目赤肿痛、口鼻生疮等症［3］。绿豆及绿豆芽中含有丰富
的生物活性成分，已证实的有黄酮类、鞣质、皂苷，生物碱、强
心苷、蒽醌类等［1 －3］。其中，大豆异黄酮作为一种弱的植物
雌激素，是强的抗氧化物，能够降低自由基对于低密度脂蛋
白的氧化作用，降低胆固醇在动脉中的沉积，减少动脉硬化
的风险，为豆类产品的研究热点之一［4］。
目前，关于绿豆芽中大豆异黄酮类物质的研究有 HPLC
法测定大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素含量的报
道［5］，尚未见对绿豆发芽过程中大豆异黄酮类成分牡荆素和
异牡荆素进行含量测定的报道。笔者采用有机溶剂提取法
对不同发芽天数的绿豆芽进行黄酮类物质的提取，通过正交
试验优化其提取工艺条件; 通过高效液相色谱( HPLC) 法测
定了绿豆发芽过程中( 0 ～ 6 d) 主要黄酮类物质牡荆素和异
牡荆素含量的变化趋势。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 研究对象。绿豆，市售。
1． 1． 2 主要试剂。无水乙醇( 分析纯) ，由北京化工厂生产;
甲醇( 色谱纯) ，由 Fisher Scientific生产;牡荆素标准品( 纯度
＞98% ) 、异牡荆素标准品( 纯度 ＞98% ) ，由上海融禾医药科
技有限公司生产。
1． 1． 3 主要仪器。DK-S26 电热恒温水浴锅，由苏州江东精
密仪器有限公司生产; KQ-400KDB高功率数控超声清洗器，
由昆山市超声仪器有限公司生产; HPLC 色谱仪，由 Waters
公司生产; UV2300紫外分光光度计，由汕头市科毅仪器设备
有限公司生产。
1． 2 方法
1． 2． 1 绿豆芽的制备。称取绿豆 25． 00 g，浸泡 24 h，装入
铺有纱布的篮子中，在绿豆上方也覆盖一层纱布，放入 24 ℃
恒温培养箱中培养，光照 6 h /d，定期浇水。分别制备萌发 0
～6 d的绿豆芽 7份样品。
1． 2． 2 绿豆芽黄酮类成分的提取。精密称取样品0． 50 g，干
燥，粉碎，过筛，于 80 ℃下用有机溶剂法进行提取，浓缩，定
容至 25 ml量瓶中，过 0． 45 μm滤膜，测定牡荆素和异牡荆素
的含量。
1． 2． 3 提取工艺优化。采用 L9 ( 3
4 ) 正交试验( 表 1) ，考察
了提取次数、提取时间、料液比、提取溶剂浓度 4个因素对发
芽 3 d的绿豆芽中牡荆素和异牡荆素含量的影响，确定其提
取的最佳提取工艺。
表 1 正交试验因素水平设计
Table 1 The factor level and results of orthogonal test
水平
Level
因素 Faxctor
提取次数
( A) ∥次
Extracting
times
提取时
间( B) ∥min
Extraction
duration
乙醇浓度
( C) ∥%
Ethanol
concentration
料液比( D)
Solid to
liquid ratio
1 1 30 50 1∶ 50
2 2 60 70 1∶ 100
3 3 90 95 1∶ 200
1． 2． 4 HPLC 色谱条件。色谱柱为 Diamonsil C18柱( 5 μm，
250． 0 mm ×4． 6 mm) ;流动相为甲醇∶水( 0． 5%醋酸) ( 40∶ 60，V/
V) ;检测波长为 260 nm;柱温为 25 ℃ ;流速为 1． 0 ml /min。
责任编辑 刘群燕 责任校对 马君叶安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39( 10) : 5746 － 5747，5802
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.10.199
1． 2． 5 对照品溶液制备。精密称取一定量的标准品，甲醇
溶解并定容至 5． 0 ml。从中取 100 μl，定容至 1． 0 ml，0． 45
μm滤膜过滤，待测。对照品结构如图 1所示。
图 1 牡荆素和异牡荆素的结构
Fig． 1 Structures of vitexin and isovitexin
1． 2． 6 样品溶液的制备。精密称取发芽 0 ～6 d的绿豆芽各
0． 50 g，在最佳提取工艺条件下提取，用甲醇定容至 25 ml 量
瓶，过 0． 45 μm滤膜，备用。
1． 2． 7 方法学考察。
1． 2． 7． 1 线性关系考察。取照品溶液分别进样 4、8、12、16、
20 μl，以峰面积为纵坐标( y) ，进样量为横坐标( x) 绘制标准
曲线，考察线性关系。
1． 2． 7． 2 重复性。精密称取发芽 0 d的绿豆芽 6 份各 0． 50
g，在最佳提取工艺条件下进行提取，定容至 25 ml 量瓶，过
0． 45 μm滤膜，进样 10 μl，分别计算牡荆素和异牡荆素含量
的相对标准偏差值( RSD) 。
1． 2． 7． 3 精密度。将标准溶液连续进样 6次，每次 10 μl，分
别计算牡荆素和异牡荆素含量 RSD值。
1． 2． 7． 4 稳定性。将发芽 0 d的样品，分别在滴 0、2、4、6、8、
10 h进样，每次 10 μl，分别计算牡荆素和异牡荆素含量
RSD值。
1． 2． 7． 5 加样回收率试验。精密称取 0． 25 g发芽 3 d的样
品，根据所测的牡荆素和异牡荆素含量，加入已知浓度的 6
份等量标准品溶液，在最佳提取工艺条件下提取，过 0． 45
μm滤膜，分别进样 10 μl，计算牡荆素和异牡荆素的平均回
收率和 RSD值。
1． 2． 8 含量测定。取 6份样品溶液，按“1． 2． 3”中色谱条件
进行分析，根据标准曲线回归方程计算牡荆素和异牡荆素的
含量。
2 结果与分析
2． 1 提取工艺优化 极差分析结果表明，各因素对绿豆芽
中异黄酮类成分提取率的影响顺序为: 提取溶剂浓度 ＞提
取时间 ＞提取次数 ＞料液比。得绿豆芽异黄酮类成分提取
的最佳条件为 A1B3C1D1，即提取次数为 1 次，提取时间 90
min，提取溶剂为 50%乙醇，料液比为 1∶ 50。
表 2 L9 ( 3
4 ) 正交试验结果
Table 2 L9 ( 3)
4 orthogonal experimental results
试验号
No．
因素 Factor
A B C D
异黄酮类平均含量∥mg /g
Mean content of
isoflavonoids
1 1 1 1 1 1． 941
2 1 2 2 2 1． 879
3 1 3 3 3 0． 551
4 2 1 2 3 1． 807
5 2 2 3 1 0． 487
6 2 3 1 2 1． 928
7 3 1 3 2 0． 386
8 3 2 1 3 1． 838
9 3 3 2 1 1． 943
k1 1． 457 1． 238 1． 902 1． 457
k2 1． 407 1． 401 1． 876 1． 398
k3 1． 389 1． 474 0． 475 1． 399
R 0． 068 0． 236 1． 427 0． 059
注: A． 牡荆素( vitesin) 标准品; B．异牡荆素( isovitesin) 标准品; C．发芽 1 d样品，D．发芽 5 d样品; E．发芽 6 d样品。
Note: A． standard vitesin; B． standard isovitesin; C． germinating sample within 1 day; D． germinating sample within 5 days; E． germinating sample
within 6 days．
图 2 对照品及样品色谱图
Fig． 2 Chromatograms of comparative substance and sample
2． 2 方法学考察
2． 2． 1 线性关系。计算得牡荆素的回归方程为 y =0． 000 3x
+2． 422 2，R2 = 0． 999 3，异牡荆素回归方程为 y =0． 000 3x +
1． 701 4，R2 = 0． 999 2。结果表明，牡荆素和异牡荆素在样品
测定范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2． 2． 2 重复性。计算得牡荆素和异牡荆素含量 RSD值分别
(下转第 5802页)
747539 卷 10 期 董银卯等 绿豆芽中异黄酮类成分提取工艺的优化及含量测定
蛋白表达( 泳道 1、2) ，而转入目的基因的酵母菌有明显的
目的蛋白表达( 泳道 3) 。经计算，此差异蛋白的分子量约
为 58 kD，这与通过目的基因 DNA 序列翻译后计算得到的
氨基酸序列分子质量 56 ku基本相符，这也进一步证明了试
验提取的穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因的正确性。
注: 1: IPTG 不诱导的阳性菌; 2: 带有空白载体的阴性菌; 3:
IPTG诱导的阳菌体。
Note: 1． Un-induced positive strain; 2． Negative strain with blank
vector; 3． IPTG induced positive strain．
图 10 毕赤酵母表达产物的 SDS-PAGE分析
Fig． 10 SDS-PAGE analysis of Pichia pastoris expression
product
3 结论
在成功提取到穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因后，课题组
曾将此基因转入到大肠杆菌表达过，但是表达出的蛋白没
有活性，可能是因为大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物
的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，而且在大
肠杆菌中表达的蛋白质不能进行正确的折叠，其产物往往
形成没有活性的包涵体。因此，该研究选用真核表达系统
巴斯德毕赤酵母来表达穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因。在
0． 5%甲醇诱导培养 144 h 后，从酵母菌液中提取的蛋白具
有穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶的活性，以转化空白质粒的酵母
菌作对照，在 SDS-PAGE中找到了差异条带，相对分子质量
约为 58 kD，与理论值相符，表明在将目的基因转入巴斯德
毕赤酵母后，菌株表达出了穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶。由此
进一步证明了提取穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因的正确性，
并为今后进一步研究该基因的调控以及蛋白质空间结构和
功能之间的关系提供了理论基础。
参考文献
［1］MCANUFF M A，HARDING W W，OMORUYI F O，et al． Hypoglycemic
effects of steroidal sapogenins isolated from Jamaican bitter yam，Dioscorea
polygonoides［J］． Food Chem Toxicol，2005，43( 11) :1667 －1672．
［2］马海英，周秋丽，王本祥．黄山药总皂苷和薯蓣皂苷元抗高脂血症及体
外抗血小板聚集的比较［J］．中国医院药学杂志，2002，22( 6) : 323 －
325．
［3］马海英，赵志涛，王丽娟，等．薯蓣皂苷元和黄山药总皂苷抗高脂血症
作用比较［J］．中国中药杂志，2002，27( 7) :528 －531．
［4］BAE E A，PARK S Y ，KIM D H． Constitutive beta-glucosidases hydroly-
zing ginsenoside Rb1 and Rb2 from human intestinal bacteria［J］ ． Biol
Pharm Bull，2000，23( 12) :1481 －1485．
［5］ KOBASHI K． Glycosidea are natural prodrugs-Evidence using germ-free
and gnotobiotic rats associated with a human intestinal bacterium［J］． Trad
Med，1998，15:1 －13
［6］王东明，汤思慧，鱼红闪，等．两种菌产皂苷糖苷酶的性质比较［J］．大
连工业大学学报，2009，28( 4) :261 －266．
［7］王东明．三种菌产皂苷糖苷酶的性质比较［D］．大连:大连工业大学，
2008．
［8］骆宁．薯蓣皂苷糖苷酶基因克隆的研究［D］．大连:大连工业大学，
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
2010．
(上接第 5747 页)
为 0． 70%、0． 90%，表明方法重复性良好。
2． 2． 3 精密度。计算得牡荆素和异牡荆素峰面积 RSD值分
别为 0． 96%、0． 54%，表明仪器精密度良好。
2． 2． 4 稳定性。计算得牡荆素和异牡荆素峰面积 RSD值均
为 0． 80%，表明样品溶液在 10 h内稳定。
2． 2． 5 加样回收率试验。结果表明，牡荆素和异牡荆素的
平均回收率分别为 98． 52%、99． 53%，RSD值分别为 1． 50%、
2． 40%。
图 3 绿豆发芽过程中牡荆素和异牡荆素含量变化
Fig． 3 Variation of vitexin and isovitexin in mung bean during
germination
2． 3 样品含量测定 牡荆素和异牡荆素标准品溶液色谱及
样品色谱图如图 2所示。由图 3可知，绿豆萌发过程中牡荆
素含量变化和异牡荆素含量变化趋势相同，即从绿豆( 发芽
0 d) 到发芽 2 d的过程中，二者含量均逐渐下降;发芽 2 ～4 d
时，二者含量又逐渐上升;而发芽 4 ～6 d时，二者含量又逐渐
下降，即发芽 4 d的绿豆芽牡荆素和异牡荆素含量均比其他
发芽天数的高，但比绿豆中的含量( 0 d) 低。
3 结论
绿豆芽异黄酮类成分提取的最佳条件为: 提取次数 1
次，提取时间 90 min，提取溶剂为 50%乙醇，料液比为 1∶ 50;
绿豆萌发过程中牡荆素和异牡荆素的含量在发芽第4 d时最
高，但低于其在绿豆中的含量。
参考文献
［1］江苏新医学院．中药大词典［M］．上海:上海科技出版社，1986:2272．
［2］赵守训，黄泰康，丁志尊．中药辞海(第三卷) ［M］．北京．中国医药科技
出版社，1997:642 －643．
［3］李敏．绿豆化学成分及药理作用的研究概况［J］．上海中医药杂志，
2001，35( 5) :47 －49．
［4］ELIZABETH A，PHUONG S，SHARI A，et al． Dietary isoflavones reduce
plasma cholesterol and atherosclerosis in C57BL/6 mice but not LDL re-
ceptor-deficient mice［J］． Nutr，1998，128:954 －959．
［5］周光明，李艳艳，辛丹敏． HPLC 法测定绿豆芽中四种大豆异黄酮的含
量［J］．食品研究与开发，2010，31( 8) :98 －102．
2085 安徽农业科学 2011 年