全 文 ：野花生豆凝集素寡糖链的结构研究
邓 俊 林
(重庆师范学院生物系 ,重庆 ,400047)
摘　要　为了探讨凝集素的分子识别机制 ,对 A型血专一性凝集素 ———野花生豆
凝集素的寡糖链结构进行了研究。纯化的野花生豆凝集素(CML)用肼解法释放出
肽链上的寡糖链 ,经离子交换层析和纸层析去除肽链和其它小分子物质后 ,再用
NaBH4还原寡糖链的还原末端残基 ,经 Bio-Gel P-4凝胶柱过滤可分离出 CML分子
上的 4个主要寡糖链。将其分别进行甲醇解反应 ,最后制成三甲基硅醚衍生物 ,用
气相色谱法分析其糖基组成。结果表明 ,CML 分子中含 4种寡糖链 ,其糖基组成分
别为 ,寡糖 Ⅰ:Gal8Glc5GalNAc2 ,寡糖Ⅱ:Gal4Glc3GalNAc2 ,寡糖Ⅲ:Man2Gal6Glc4Gal-
NAc2GlcNAc2 ,寡糖Ⅳ:Man2Gal6Glc4GalNAc2 。
关键词　凝集素 , 野花生豆凝集素 , 寡糖链 , 寡糖链结构 , 糖基组成
中图法分类号　Q533
近20年来 ,有关凝集素的研究迅速发展 ,近 100种凝集素被分离纯化 ,并被广泛地运用
于生物学 、医学等研究领域[ 1] 。而对于凝集素本身的研究则主要集中在凝集素分子的结构
与生理功能和生物学意义的关系上[ 1 ,2] 。对凝集素的结构研究 ,又主要集中在两方面 ,其
一 ,凝集素分子肽链部分的结构 ,目前已有几十种凝集素的多肽链结构被完全阐明[ 3] ;其二 ,
对凝集素寡糖链结构的研究。越来越多的事实证明 ,糖复合物中的寡糖是体内重要的信息
分子 ,在分子识别中起着举足轻重的作用。阐明凝集素寡糖链的精细结构是认识凝集素结
构与功能的分子基础 。目前已发现的凝集素 ,被阐明糖链结构的还甚少[ 4 ～ 7] 。本文对 A型
血专一性凝集素 ———野花生豆凝集素(crotalaria mucronate lectin ,简称 CML)的寡糖链结构进
行了研究 ,现报道如下。
1　材料和方法
实验用 Dowex 50 W(H+型)为 Dow Chemical Co.产品 ,Bio-Gel p-4为 Bio Rad Co.产品 ,三
甲基氯硅烷(trimethylchlorosilane , 简称 TMCS), 六甲基硅胺烷(Hexamethyldisilazane , 简称
HMDS),N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)为 Sigma 产品 ,N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、岩藻糖(Fuc)为
Serva产品 ,甘露糖(Man)为 Fluka 产品 ,NaBH4为 Aldrich Chemical Co Ltd产品 。其余试剂为
第 16 卷第 1 期　　　　　　 重庆师范学院学报(自然科学版)　　　　　 1999 年 3月
Vol.16　No.1　　　　Journal of Chongqing Teachers College(Natural Science Edition)　　　　　Mar.1999

邓俊林.女 , 36岁 , 讲师 ,硕士
1998-09-09　收稿
分析纯 ,并根据需要对试剂作进一步纯化处理 。
1.1　野花生豆凝集素的纯化
野花生豆(crotalaria mucronate)种子采自福建省龙岩地区 ,按文献[ 8] 的方法纯化 CML ,
纯化的CML在 PAGE或 SDS-PAGE上均呈现单一蛋白带 。
1.2　肼解反应及寡糖链的纯化[ 9 , 10]
无水肼系以水合肼经甲苯和氧化钙处理 ,无水条件下回流 4 h ,然后在 93 ～ 94℃下蒸馏
收集馏分 ,待分层后取下层无水肼装于试管内封口 ,在 4℃干燥条件下暗处保存 。
CML的肼解及寡糖链的纯化参照Takasaki等的方法进行[ 9 , 10] 。取 0.8 ～ 1.2 mg CML ,经
P2O5在干燥器内充分干燥后 ,与 1 ml新蒸无水肼 ,在 100℃下封口反应 10 h。冷却后 ,以
H2SO4为干燥剂真空干燥至过量的无水肼全部抽净后 ,样品用甲苯洗涤数次 ,减压抽干。加
入饱和 NaHCO3 和乙酸酐 ,进行乙酰化反应(室温反应 2 h),反应液通过 Dowex 50 W(H+型)
离子交换柱 ,以 5倍柱床体积的双蒸水洗柱 ,合并洗出液 ,减压蒸发至干 。此样品用少量双
蒸水溶解 ,转移至Whatman 3号层析滤纸上 ,以正丁醇∶乙醇∶水(4∶1∶1)为展层剂 ,下行展层
3 d ,将滤纸吹尽溶剂后 ,从点样处算起 ,剪下 0.0 ～ 0.5 cm ,浸入双蒸水中 ,洗下寡糖链 ,冷冻
干燥 。
寡糖链用 NaBH4 还原 ,上述冻干的寡糖链样品 ,加入 200 μL NaBH4 溶液(3 μmol/L
NaBH4 溶于 200μL 0.05mol/L NaOH 中),在30℃下反应 4 h ,再加入0.7 mg NaBH4(溶解在70
μL 0.05 mol/L NaOH)连续反应 2 h ,以 1 mol/L HAc 中止反应。反应混合液通过小体积的
Dowex 50 W(H+型)离子交换柱 ,5倍体积的双蒸水洗涤 ,合并洗涤液 ,减压蒸发至干 ,再以甲
醇洗涤数次 ,减压至干。样品经上述步骤处理 ,即获得还原末端为 GlcNAc的 N-连接的寡糖
链混合物 。
上述寡糖链混合物 ,用 Bio-Gel P-4凝胶柱作进一步纯化[ 10] 。Bio-Gel P-4(400目以下)溶
胀后装柱(1.5 cm×100 cm), 25℃下层析 ,双蒸水洗脱 ,分部收集(5滴/min ～ 6滴/min , 0.9
mL/ tube ～ 1.3 mL/ tube)。用苯酚-硫酸法测定各收集管的糖含量 ,分别合并各糖峰 ,冷冻干
燥 ,得纯化的寡糖链 。
1.3　CML寡糖链的糖基组成测定
参照 Sweely[ 11] 、Ward[ 12]等人的气相气谱法。用GC-7AG 型气相色谱仪(日本岛津公司)
和Chromatopac C-R3A积分仪(日本岛津公司)作数据采集处理。层析柱为:OV-101+SE-
30 ,3M 石英毛细柱;层析条件为:N2 为载气;40 mL/min;氢火焰检测器 , TD(检则器温度)=
TI(进样口温度)=260℃, Tc(柱温), 150℃恒温 1 min ,接着程序升温(3℃/min),最终温度
200℃,恒温 32 min。
气相色谱样品的制备
(1)寡糖链的盐酸甲醇解 ,将纯化的 CML 寡糖链样品 ,真空干燥过夜 ,加入 CH3OH -
HCl(含 0.75mol/L HCl)3.5 mL ,试管封口后 ,加热至 80℃反应 20 h ,冷却后以干燥过夜的固
体Ag2CO3 中和 ,离心后取出上清液 ,沉淀用 2 mL 甲醇洗涤两次 ,合并清液和洗涤液 ,减压蒸
发至干 ,以 P2O5和 NaOH为干燥剂进行真空干燥。向干燥样品中加入甲醇 ,吡啶和乙酸酐 ,
进行重乙酰化反应(20℃反应 1 h),用 N2吹干 ,再以 P2O5为干燥剂真空干燥过夜 。
(2)糖的三甲基硅醚衍生物的制备 ,甲醇解的样品 ,加入硅烷化试剂(吡淀 5 mL 、HMDS
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2mL 、TMCS 1 mL混匀 ,放置 12 h ,离心 ,将上清液转移至另一干燥的带塞试管中 ,4℃干燥下
避光备用),室温反应 2 h ,即可进行气相色谱分析。
图 1　CML寡糖链在 Bio-Gel P-4柱上的洗脱
5～ 6 滴/ min , 1.1 mL/ tube
2　结果与讨论
2.1　CML 寡糖链的分离纯化
应用 Takasaki 的肼解法从 CML 分子中
可以释放出与 Asn连接的寡糖链 ,经乙酰化
反应 ,寡糖链的末端糖基被乙酰化 ,可以应用
Dowex 50 W(H+型)离子交换柱对寡糖链进
行初步纯化 ,经纸层析可进一步去除小分子
物质和用NaBH4还原 ,就能获得 CML 分子上
的寡糖链混合物 。此法虽然费时较长 ,但其
操作容易 ,不需昂贵试剂 ,效果好 ,因此是一种纯化寡糖链的有效方法。Yamashita 等报道
Bio-Gel P-4凝胶过滤用于分离 3 ～ 24个葡萄糖单位的寡糖链 ,其效果很好[ 10] ,CML的寡糖链
经 Bio-Gel P-4柱纯化 ,其结果见图 1。图中有 4个寡糖峰 ,以其出峰顺序分别称为寡糖 Ⅰ 、
寡糖 Ⅱ、寡糖Ⅲ 、寡糖Ⅳ。
图 2　标准单糖的三甲基硅醚衍生物
混合样在气相色谱上的分离
　1.Ara　2.Fuc　3.Xyl　4.Man　5.Gal
　6.Glc　7.GalNAc　8.GlcNAcOH
2.2　CML 寡糖链糖基组成测定
应用毛细管气相层析法对痕量的寡糖进行测定是一
种有效的测试手段。当寡糖链被盐酸甲醇解后 ,乙酰化
恢复乙酰氨基糖的乙酰基 ,再制成单糖的硅烷化衍生物 ,
即可进行色谱分析。此法简便 ,结果准确。
在糖基组成测定前 ,选用在糖蛋白分子中常见的几
种单糖 , Fuc 、Gal 、Glc 、Man 、GlcNAc、GalNAc、Ara(阿拉伯
糖)和 Xyl(木糖)作标准单糖 ,对各种标准单糖及其混合
样作出色谱图(图 2)。根据图中各峰的自动积分值和出
峰时间求出各单糖的相对保持时间 ,见表1。
表 1　各种单糖的三甲基硅醚衍生物的相对保持时间
Ara Fuc Xyl Man Gal Glc GalNAc GlcNAc GlcNAcOH
Rt 1 1.21 1.38 2.07 2.44 2.67 4.23 4.51 4.62
　　　R t:相对保持时间
从CML纯化出来的 4个寡糖链样品 ,经甲醇解和乙酰化后 ,制成三甲基硅醚衍生物 ,在
相同条件下进行气相色谱分析的结果见图 3 ～ 6。根据图中各峰的自动积分值 、出峰时间求
出其相对保持时间以确定各峰是由哪种单糖所贡献。利用峰高和面积可确定各糖基的数
量 ,得到 4个寡糖链的糖基组成 ,见表 2。
在表 1和表 2中所出现的GlcNAcOH是 N-乙酰氨基葡萄糖醇 ,它是寡糖链的还原末端
GlcNAc经NaBH4 还原所得 。在气相色谱中 ,GlcNAc 与 GlcNAcOH 表现了一定差异 ,因而出
现两个很接近的峰;同时 ,由于 NaBH4仅对还原性末端的半缩醛羟基发生还原反应 ,因此在
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1条寡糖链上 ,只有一个 GlcNAc糖基被还原成 GlcNAcOH 。从图 5和表 2中 ,可以看出 Glc-
NAc和GlcNAcOH 的峰高和相对含量大体相同 。因此 ,由表 2可知 ,CML 的 4条寡糖链组成
分别为:Gal8Glc5GalNAc2 ,Gal4Glc3GalNAc ,Man2Gal5Glc4GalNAc2GlcNAc2和 Man2Gal6Glc4Gal-
NAc2。这种糖组分的特点是出现了较多的 Gal 、GalNAc和 Glc ,没有通常N-糖苷键连接的寡
糖链所应有的五糖核心;除了寡糖 Ⅲ有GlcNAc 外 ,其余 3条寡糖链均没有 GlcNAc;4条寡糖
链中GalNAc 的相对数目都是 2。
表 2　CML 寡糖链的糖基组成
Man Gal Glc GalNAc GlcNAc GlcNAcOH
PeakⅠ 0 8 5 2 0 0
PeakⅡ 0 4 3 2 0 0
PeakⅢ 2 6 4 2 1 1
PeakⅣ 2 6 4 2 0 0
Rt 2.07 2.44 2.67 4.23 4.51 4.62
　　　　R t:为相对保留时间
图 3　寡糖链Ⅰ的三甲硅醚衍生物的气相色谱　 　图 4　寡糖链Ⅱ的三甲硅醚衍生物的气相色谱
5.Gal　6.Glc　7.GalNAc　 　5.Gal　6.Glc　7.GalNAc
图 5　寡糖链Ⅲ的三甲硅醚衍生物的气相色谱　 　图 6　寡糖链Ⅳ的三甲硅醚衍生物的气相色谱
4.Man　5.Gal　6.Glc　7.GalNAc　8.GlcNAc　 　4.Man　5.Gal　6.Glc　7.GalNAc
目前已阐明结构的凝集素糖链中只出现两类糖链 ,即N-连接的糖链和以 Araf与 Hyl连
接的O-连接糖链。从寡糖 Ⅲ的糖组分看属于 N-连接的复杂型寡糖链 ,即除含 Man 、GlcNAc
外还有其它的单糖。而寡糖Ⅰ 、Ⅱ和Ⅳ的糖组分都有更多的类似动物粘蛋白型 O-连接糖链
的特点 ,这在生物进化上是很有意义的 。据曾仲奎等报道[ 13]Glc 、Man 、Gal 、GalNAc对 CML 与
A型血红细胞的结合有不同程度的影响 ,而以 GalNAc和Gal尤其是GalNAc表现较强的抑制
作用。而这几种糖恰好是 CML糖链的单糖组分 ,这似乎从侧面表明了凝集素与其细胞表面
受体相互识别 ,结合的过程中糖链的重要作用;同时 ,这种罕见的糖链组成类型是否是 A型
血专一性凝集素特有的糖链特点 ,这些问题都将有待于进一步研究阐明。
43第 1 期　　　　　　　　　邓俊林:　野花生豆凝集素寡糖链的结构研究　　　　　　　　　　　　　
参 考 文 献
1　陈惠黎主编.糖复合物的结构和功能.上海:上海医科大学出版社 , 1997.29～ 53 , 316～ 319
2　PeumansW J Van Damme JM.Lectin as plant defense protein.Plant physiol , 1995 , 109:347 ～ 352
3　James M.Rini , Lectin structure , Annu.Rev.Biophys.Biomol.struct.1995 , 24:551～ 557
4　Yoshinobu Kimura.Structure analyses of sugar chains from Abrus precatorius agglutinin.Biochem.Biophys.Acta ,
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5　Capon C.Structural analysis of the carbohydrate chain isolated from Jacalin lectin.Carbohydrate Res , 1990 , 199:127-
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6　顾新 ,孙册.蓖麻凝集素分子中寡糖的结构分析.生物化学与生物物理学报 , 1990 , 22(5):419～ 427
7　曾仲奎 ,郑建 , 周红.岩豆凝集素寡糖链的研究.四川大学学报(自然科学版), 1994 , 31(1):113～ 118
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26(1):90 ～ 96
Structural Studies of the
Oligosaccharides of Crotalaria Mucronata Lectin
Den Junling
(Dept.of Biology ,Chongqing Teachers College ,Chongqing ,400047)
Abstract　The structures of oligosaccharides from crotalaria mucronata lectin(CML)with human A-
blood-group specificity were studied to elucidate the molecular recognition mechanism of lectin.Hy-
drazinolysis was used for releasing the Aspargine-linked sugar chains from the purified CML , ion-ex-
change and paper chromatography for removing the peptides and lower molecular portion.The oligosac-
charides were then reduced by NaBH4 to obtain oligosaccharides with N-acetylamin-oglucositol at the
reducting end ,which could be fractionated by passing through a Bio-gel P-4 column , and four oligosac-
charides could be separated.These four portions were methanolysed and finally transformed into deriva-
tives of trimethylsilane.At last , gas chromatography of these four derivatives showed that these four
oligosaccharides were Gal8Glc5GalNAc2 ,Gal4Glc3GalNAc2 ,Man2Gal5GalNAc2GlcNAc2 and
Man2Gal5Glc4GalNAc2.
Key words　lectin , crotalaria mucronata lectin , oligosaccharides , glycoprotein , carbohydrate compo-
sition
(责任编辑　许文昌)
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