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性，又能保留有效成分，缩短生产周期，避免了传统
乙醇沉淀法成本高、流程长等弊端，且已有学者证明
了壳聚糖絮凝沉降法对药液中高分子物质、多糖及
可溶性固形物的保留效果优于乙醇沉淀法［5］。试
验中仅选取处方中芍药苷和苦杏仁苷为考察指标，
未对其他成分如牡丹皮中丹皮酚、枳实中辛弗林等
进行研究，主要原因是经过减压浓缩后丹皮酚和辛
弗林损失率较高［6］。
不同药材及其处方需进行针对性研究。由表 4
可知，90%乙醇虽可使水浸出物收率降至 17. 65%
(表 4) ，但苦杏仁苷和芍药苷保留率降低太多;离心
法虽可使 2 种有效成分保留率较高，但水浸出物收
率未受较大影响;采用壳聚糖絮凝剂吸附澄清技术
可使水浸出物收率降至 19. 03%，又可使苦杏仁苷
和芍药苷具备较高保留率，且该方法稳定性、重复性
较好，且操作简单、成本较低，综合考虑，可将壳聚糖
絮凝剂澄清技术作为丹桃颗粒的澄清工艺。
［参考文献］
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［责任编辑 仝燕］
［收稿日期］ 20130603(008)
［基金项目］ 康缘中医药科技创新基金项目(HZ1015KY)
［第一作者］ 潘晓微，在读硕士，从事中药质量标准与制剂工艺研究，Tel:025-85637809，E-mail:panxiaowei． 1990@ 163． com
［通讯作者］ * 黄一平，研究员，硕士生导师，从事中药质量标准与制剂工艺研究，Tel:025-85637809，E-mail:yipingh@ 163． com
大孔树脂分离纯化楮叶总黄酮的工艺优选
潘晓微1，2，黄一平2*
( 1. 南京中医药大学药学院，南京 210028;
2. 江苏省中医药研究院国家中医药管理局中药释药系统重点研究室，南京 210028)
［摘要］ 目的:优选楮叶总黄酮的大孔树脂纯化工艺。方法:以楮叶总黄酮为指标，通过大孔树脂静态吸附和动态吸附试
验筛选树脂型号，通过单因素试验考察上样液质量浓度、洗脱剂用量、洗脱流速等因素对纯化工艺的影响。结果:HPD450 型大孔
树脂分离效果最好，其最佳工艺参数为上样液质量浓度 4. 4 g·L －1，径高比 1∶ 8，上样量 6 BV，吸附速度 1 BV·h －1，加5 BV水洗除
杂，用 50%乙醇 8 BV以 1 BV·h －1的速度洗脱。总黄酮纯度由精制前的 30. 65%提高至 75. 75%，总黄酮保留率达 79. 89%，除杂
率达 64. 88%。结论:HPD450型大孔树脂纯化楮叶总黄酮的效果良好，且工艺合理稳定，可推广于工业生产中应用。
［关键词］ 大孔树脂;楮叶;总黄酮;吸附;分离纯化工艺;单因素试验
［中图分类号］ Ｒ283. 6 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)23-0039-04
［doi］ 10． 11653 /syfj2013230039
Optimization of Separation and Purification Technology for Total Flavonids
from Leaves of Broussonetia Papyrifera by Macroporous Ｒesin
PAN Xiao-wei1，2，HUANG Yi-ping2*
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(1. College of Pharmaceutical Science，Nanjing University
of Chinese Medicine，Nanjing 210028，China;2. Key Laboratory of New Drug Delivery System of
Chinese Meteria Medica，Jiangsu Provincial Academy of Chinese Medicine，Nanjing 210028，China)
［Abstract］ Objective:To optimize purification technology conditions of total flavonoids from leaves of
Broussonetia papyrifera by macroporous adsorption resin． Method:With total flavonoids from leaves of B．
papyrifera as index， type of macroporous resin was screened by by static adsorption-desorption and dynamic
adsorption-desorption tests，effects of eluent consumption，elution flow rate，the concentration of sample solution
and other factors on purification technology were investigated by single factor tests． Ｒesult:HPD450 was selected
for its excellent adsorption and desorption properties，optimum process was as following: the concentration of
sampling solution 4. 4 g·L －1，sampling velocity 1 BV·h －1，sample liquid volume 6 BV，eluted by 5 BV
deionized water and 8 BV 50% ethanol at speed of 1 BV·h －1，diameter to height ratio of resin 1 ∶ 8，collected
eluate． Under these conditions，purity of total flavonoids was up to 75. 75% from 30. 65%，retention rate of total
flavonoids reached 79. 89%，impurity removal rate reached 64. 88% ． Conclusion:HPD450 macroporous resin
was suitable for separation and purification of total flavonoids from leaves of b． papyrifera，optimized purification
technology was stable and feasible，it could be extended for industrial production applications．
［Key words］ macroporous resin; leaves of Broussonetia papyrifera; total flavonoids; adsorption;
separation and purification technology;single factor test
楮叶，又名构叶、彀树叶、酱黄叶、谷树叶，味甘，
性良，无毒，始载于《名医别录》［1］，具有凉血、利水
的功效，适用于治疗吐血、衄血、血崩、外伤出血、水
肿等症［2］。现代药理研究表明，楮叶具有抗炎、抗
真菌、抗氧化、利尿、降压等作用［3-7］，其主要成分包
括黄酮类化合物、香豆素、生物碱、蛋白质、挥发
油等。
大孔树脂是一种不溶于酸、碱及各种有机溶剂
的有机高分子聚合物，具有吸附容量大、吸附速度
快、解吸条件温和、易于再生等优点。黄酮类化合物
具有多酚结构，依靠其与大孔吸附树脂之间的范德
华力进行吸附，可取得良好分离纯化效果，近年来已
被广泛用于黄酮类化合物等植物活性成分的提取和
分离，尤其适于工业化生产［8］。本实验以楮叶总黄
酮为研究对象，利用大孔树脂纯化技术对楮叶总黄
酮进行纯化，为下一步的剂型研究奠定基础。
1 材料
UV-2802 型紫外分光光度计(上海维诚仪器有
限公司生产) ，MS半微量型 1 /10 万电子天平(北京
赛多利斯仪器系统有限公司) ，Milli-Q型纯水器(美
国 Millopore公司) ，AL204 型 1 /万电子分析天平(梅
特勒-托利多公司) ，SHZ-82 型气水浴恒温震荡器
(常州丹瑞实验设备有限公司生产) ，DHG-9070A型
电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公
司)。
D101 型大孔树脂(上海摩速科学仪器有限公
司) ，AB-8，HPD400，HPD450，HPD500，HPD600 型大
孔树脂(河北沧州宝恩吸附材料科技有限公司) ，聚
酰胺(中国医药集团上海化学试剂公司) ，木犀草素
对照品(中国食品药品检定研究院，批号 111520-
200504) ，楮叶于 2011 年 9 月采自江苏省南京市，由
江苏省中医药研究院黄一平研究员鉴定为落叶乔木
桑科植物构树 Broussonetia papyriferaL． Vent． 的叶，
所用试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 总黄酮的含量测定
2. 1. 1 标准曲线的绘制［9］ 精密称取木犀草素对
照品 3. 88 mg，置于 10 mL量瓶中，加 95%乙醇适量
使溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品储备液。精密
吸取储备液 0. 1，0. 2，0. 3，0. 4，0. 5，0. 6 mL，分别置
10 mL量瓶中，各加入 5% AlCl3 溶液 1 mL，用 95%
乙醇定容至刻度，摇匀，放置 30 min，以相应试剂为
空白，于 278 nm处测定吸光度(A) ，以 A 为横坐标，
对照品质量浓度为纵坐标，得回归方程 Y =
28. 57X － 1. 031(r = 0. 999 5) ，线性范围 3. 88 ～
23. 28 mg·L －1。
2. 1. 2 供试品溶液的制备 在前期研究基础上，取
楮叶样品粗粉 500 g，加 75%乙醇浸泡 6 h，以 4 mL·
min －1·kg －1的速度渗漉，收集 7 倍量渗漉液，减压回
收乙醇成相对密度 1. 05(60 ℃)的浸膏，加水冷藏，
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过滤除去油脂等杂质，取上样液，即得，冷藏备用。
2. 1. 3 样品测定 取待测液 1 mL，置 25 mL 量瓶
中，加 95%乙醇至刻度，摇匀，精密吸取 1 mL，置
10 mL量瓶中，按 2. 1. 1 项下方法自“各加入 5%
AlCl3 溶液 1 mL”至“于 278 nm 处测定 A”操作，计
算总黄酮含量。
2. 1. 4 精密度试验 取 11. 64 mg·L －1木犀草素对
照品溶液 6 份，按 2. 1. 3 项下方法测定，结果 A 的
ＲSD 0. 99%;取供试品溶液适量，按 2. 1. 3 项下方法
重复测定 6 次，结果 A 的 ＲSD 1. 03%，表明仪器精
密度良好。
2. 1. 5 重复性试验 取同批号楮叶药材，按 2. 1. 2
项下方法平行制备 6 份供试品溶液，按 2. 1. 3 项下
方法测定，结果 A 的 ＲSD 1. 63%，表明该方法重复
性良好。
2. 1. 6 稳定性试验 取同一供试品溶液适量，分别
于制备后 0，2，4，6，8，10，12 h 后按 2. 1. 3 项下方法
测定，结果 A 的 ＲSD 1. 37%，表明供试品溶液在
12 h内稳定。
2. 1. 7 加样回收率试验 精密量取已知含量的楮
叶样品溶液 1 mL，共 6 份，分别加入 11. 64 mg·L －1
木犀草素对照品溶液 1 mL，按 2. 1. 3 项下方法测定
A，计算平均回收率 98. 77%，ＲSD 1. 78%。
2. 2 大孔树脂纯化工艺考察
2. 2. 1 大孔树脂的预处理 取适量大孔树脂，加
95%乙醇浸泡 24 h 以上，充分溶胀后湿法装柱，用
95%乙醇洗脱至流出液加水混合(体积比 1∶ 2)不产
生白色浑浊为止，加水洗至无醇味，用 5%氢氧化钠
溶液 5 BV洗脱，加水洗至中性，用 5%盐酸 5 BV洗
脱，水洗至中性，备用。
2. 2. 2 大孔树脂型号筛选 采用静态吸附法，将 7
种处理好的树脂抽滤至不滴水为准，精密称取各树
脂 5 g，置 100 mL具塞锥形瓶中，加入样品液 50 mL
(总黄酮质量浓度 5. 5 g·L －1)后于震荡器上，频率
120 次 /min，间隔 1 min振荡 1 次，共 2 h，静置 20 h，
使其达到饱和吸附，吸取上层液测定总黄酮含量，计
算树脂饱和吸附量。将经静态饱和吸附总黄酮后的
树脂滤出，吸干表面水分，精密加入 60%乙醇 50 mL
同上法振荡 2 h后滤出，测定洗脱液总黄酮含量，计
算洗脱率［10］，见表 1。结果表明中等极性和极性的
大孔树脂对楮叶总黄酮的静态饱和吸附量较弱极
性、非极性和氢键型树脂高，其中 HPD450 型树脂静
态吸附量最大;在静态洗脱中 HPD450，HPD500，
HPD600 型树脂洗脱率均 ＞ 85%，综合考虑，选取
HPD-450 型树脂。
饱和吸附量 =(总黄酮初始质量浓度 －吸附后总黄酮
质量浓度)×吸附液体积 /树脂量;
洗脱率 =洗脱液总黄酮质量浓度 ×吸附液体积 /饱和吸
附量 × 100%
表 1 楮叶总黄酮的大孔树脂静态吸附考察(n = 3)
树脂型号 树脂吸附类型 饱和吸附量 /mg·g － 1 洗脱率 /%
聚酰胺 氢键 30. 03 77. 07
D101 非极性 30. 50 81. 18
AB-8 弱极性 32. 27 73. 04
HPD400 中等极性 40. 87 78. 86
HPD450 中等极性 43. 93 88. 25
HPD500 极性 38. 27 88. 00
HPD600 极性 36. 72 89. 17
2. 2. 3 洗脱剂浓度考察 精密称取已处理好的
HPD-450 型树脂 5 g，共 7 份，分别置于 100 mL具塞
锥形瓶中，各精密加入 2. 1. 2 项下供试品溶液
50 mL，按 2. 2. 2 项下方法震荡，使其达到饱和吸附，
分离树脂，吸干表面水分。对应加入体积分数为
30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇溶液
各 50 mL，同法震荡洗脱 2 h 后过滤，测定洗脱液中
总黄酮质量浓度，计算洗脱率分别为 64. 37%，
73. 61%，92. 23%，89. 90%，80. 08%，83. 05%，
71. 18%，故选择 50%乙醇为洗脱剂。
2. 2. 4 上样液质量浓度考察 将不同质量浓度的
样品溶液(5. 5，4. 4，3. 3，2. 2，1. 1 g·L －1)分别通过
湿体积 20 mL的 HPD450 型树脂柱，以 1 BV·h －1的
流速进行动态吸附，分别上样 40 mL，收集流出液，
加去离子水 2 BV洗脱，合并两部分流出液，测定总
黄酮质量浓度，计算动态吸附率(P)分别为 78. 2%，
86. 12%，87. 34%，89. 49%，90. 87%，综合考虑，故
选择上样液质量浓度 4. 4 g·L －1。
P =(C0Vy － CeVe)/C0Vy × 100%
式中 C0 为上样液质量浓度，Vy 为上样体积，Ce
为流出液中总黄酮质量浓度，Ve 为流出液体积。
2. 2. 5 径高比考察 选择径高比分别为 1 ∶ 10，
1∶ 8，1∶ 6，1∶ 4的树脂柱 4 根，湿法装入 HPD450 型树
脂 20 mL，各加入 4. 4 g·L －1样品溶液 40 mL 以 1
BV·h －1的速度过柱，用去离子水 2 BV 洗脱，合并两
部分流出液，测定总黄酮质量浓度，计算总黄酮 P
分别为 90. 01%，89. 58%，82. 37%，75. 93%，故选
择径高比 1∶ 8。
2. 2. 6 吸附流速考察 取 4. 4 g·L －1样品溶液
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潘晓微，等:大孔树脂分离纯化楮叶总黄酮的工艺优选
40 mL通过 HPD450 型大孔树脂柱(树脂体积
20 mL，径高比 1∶ 8) ，分别以 1，2，3 BV·h －1的流速
进行动态吸附，用去离子水 2 BV 洗脱，合并两部分
流出液，测定总黄酮质量浓度，计算总黄酮 P 分别
为 89. 77%，76. 24%，62. 79%，故选择吸附流速
1 BV·h －1。
2. 2. 7 上样量考察 取 4. 4 g·L －1样品溶液 200 mL
以 1 BV·h －1的速度通过 HPD450 型大孔树脂柱(树
脂体积 20 mL，径高比 1∶ 8) ，收集流出液，每 1 BV收
集 1 份，共收集 10 份，测定流出液中总黄酮含量，绘
制泄漏曲线，结果见图 1，表明上样体积在120 mL(6
BV)内泄露较少，即上样总黄酮质量达 528 mg 时，
累积吸附量达 505. 10 mg时出现明显泄露。
图 1 楮叶总黄酮的 HPD450 型大孔树脂泄漏曲线
2. 2. 8 水洗用量考察 量取 HPD450 型大孔树脂
20 mL湿法装柱，精密量取楮叶样品溶液 120 mL按
优选的工艺上样、过柱，吸附完全后加水 10 BV洗脱
杂质，以 1 BV·h －1的流速进行动态吸附，收集洗脱
液，每 1 BV为 1份，测定每份洗脱液中总黄酮质量浓
度分别为 0. 284，0. 367，0. 681，0. 923，0 ～ 0 g·L －1，表
明水洗用量为 5 BV时，树脂表面的总黄酮溶液及多
糖已基本除尽，故确定水洗用量 5 BV。
2. 2. 9 洗脱流速考察 取 4. 4 g·L －1的总黄酮样品
溶液 120 mL，以 1 BV·h －1流速上样，充分吸附，加去
离子水 5 BV冲洗，用 50%乙醇 10 BV 分别以 1，2，
3，4 BV·h －1速度洗脱，收集洗脱液，测定总黄酮质
量浓度，计算洗脱率分别为 92. 11%，83. 47%，
72. 34%，66. 73%，故采用 1 BV·h －1的流速洗脱。
2. 2. 10 洗脱剂体积的考察 将 4. 4 g·L －1的样品
溶液 120 mL通过 HPD450 型大孔树脂柱(树脂体积
20 mL，径高比 1∶ 8) ，以 1 BV·h －1流速进行动态吸
附，用去离子水 5 BV 洗脱除杂后，用 50% 乙醇
10 BV以 1 BV·h －1的流速洗脱，每 1 BV为 1 份收集
洗脱液，共收集 10 份，测定每份洗脱液中总黄酮含
量，绘制洗脱曲线，结果见图 2，表明当用 50%乙醇
160 mL 洗脱时，总黄酮已经基本被洗脱完全，故确
定 50%乙醇的洗脱体积 8 BV。
图 2 楮叶总黄酮的 HPD450 型大孔树脂洗脱曲线
2. 3 验证试验 取 4. 4 g·L －1的上样液 3 份，每份
120 mL(6 BV) ，按优选的纯化工艺进行 3 次验证试
验，结果总黄酮纯度由精制前的 30. 65% 提高至
75. 75%，总黄酮保留率达 79. 89%，除杂率达
64. 88%，说明优选的工艺稳定可行。
3 讨论
在前期对楮叶质量标准的研究中，由于木犀草
素含量较高，故选择木犀草素为指标成分，以反映楮
叶总黄酮的含量。试验研究表明采用中等极性的大
孔树脂对楮叶总黄酮的富集效果优于极性、弱极性、
非极性及氢键吸附型树脂，其中 HPD450 型树脂的
纯化效果最好，经验证试验表明优选的纯化工艺稳
定可行，该工艺具有操作简单、重复性好等优点，具
有较好的推广应用前景。
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