全 文 ：第 30卷 ,第 6期 光　谱　实　验　室 Vol . 3 0 , No . 6
2 0 1 3年 1 1月 Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory November , 2 01 3
臭牡丹黄酮类化合物提取及其抗氧化作用①
① 湖南省自然科学基金项目 ( 12 JJ3019) ;湖南省科技厅计划项目 ( 2010GK3123、 2011FJ3167 ) ;湖南省教育厅重点科研基金项目
( 10A113) ;郴州市科技计划项目 (郴财教指 [2011 ]53号 ) ;湖南省重点建设学科资金资助项目
② 联系人 ,电话: ( 0735) 2653353;传真: ( 0735) 2653353; E-mail: dbhy88@ sina. com
作者简介:冯纪南 ( 1958— ) ,女 ,湖南省郴州市人 ,副教授 ,主要从事生物化学、天然产物化学方面的教学与科研工作。
收稿日期: 2013-06-13;接受日期: 2013-06-21
冯纪南　黄海英a　余瑞金b　邓 斌②
(湘南学院化学与生命科学系　湖南省郴州市苏仙北路 8号　 423000)
a(湘南学院教务处　湖南省郴州市苏仙北路 8号　 423000)
b (西北农林科技大学理学院　陕西省杨凌市国家农业高新技术产业示范区西农路 22号　 712100)
摘　要　研究臭牡丹中黄酮类化合物的最佳提取工艺条件及其抗氧化活性。 以提取时间、料液比、提
取温度、乙醇体积分数为主要影响因素 ,以黄酮类化合物提取率为考察指标 ,确定最佳提取工艺条件 ,并通
过对亚硝酸盐、超氧阴离子自由基、羟自由基的清除效果及对猪油的抗氧化研究其抗氧化活性。结果表明 ,
臭牡丹中黄酮类化合物的最佳提取工艺条件为提取时间 2. 0 h、料液比 1∶ 40( g /m L)、提取温度 70℃、乙醇
体积分数 70%的条件下提取效果最好 ,臭牡丹中黄酮类化合物在各抗氧化体系中均表现出较强的抗氧化
活性 ,且其作用具有剂量效应关系 ,其抗氧化活性均强于维生素 C。
关键词　臭牡丹 ;分光光度法 ;黄酮类化合物 ;提取工艺 ;抗氧化性
中图分类号: R282. 7; O657. 32　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1004-8138( 2013) 06-3215-06
1　引言
臭牡丹 ,异名大红袍 ,臭八宝 (《植物名实图考》 ) ,矮童子 (《分类草药性》 ) ,大红花 (《贵州民间方
药集》 ) ,臭风草等 ,为马鞭草科植物臭牡丹 (Clerodendrum bungei Steud )的全株。臭牡丹为常用的民
族药材 ,具有活血化瘀、消肿止痛、清热利湿、解毒等功效 [1 ] ,民间有用于治疗糖尿病 ,临床上广泛用
于治疗痈疽、疔疮、乳腺炎、关节炎、湿疹、崩漏等 [2 ]。现代研究表明臭牡丹含有多种矿物质和生物活
性物质 ,其中臭牡丹中含有的黄酮类化合物具有很多生物活性 ,如抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、抗
氧化、抗菌活性、抗骨质疏松、预防心血管疾病、免疫调节活性等 [2— 4 ] ,尤其是在医药和功能食品领
域受到广泛关注 ,也被消费者普遍接受。本文利用紫外分光光度法为测试手段 ,对臭牡丹中黄酮类
化合物的乙醇提取方法及其抗氧化作用进行了研究 ,旨在通过几个体外实验体系研究臭牡丹中黄
酮类化合物的抗氧化活性 ,以期提高臭牡丹的附加值 ,为使臭牡丹黄酮类化合物作为天然抗氧化剂
和功能性医药用品的开发利用提供一定实验参数和理论依据。
2　实验部分
2. 1　试剂与仪器
臭牡丹购置郴州市老百姓大药房 ,将新购臭牡丹放入 45℃烘箱中 ,热风烘烤 10h,粉碎后过 60
目筛 ,常温保存备用 ;芦丁对照品 (中国药品生物制品检定所 ,批号: 100080-200707) ; NaOH、
NaNO2、 Al( NO3 ) 3、Na2 S2O3· 5 H2O、 L-抗坏血酸 (维生素 C)、无水乙醇、盐酸、三氯甲烷、氯化亚铁、
三羟甲基氨基甲烷、水杨酸、对氨基苯磺酸、 N-1-苯基乙二胺盐酸盐等试剂均为分析纯。 实验用水
为自制二次蒸馏水。
UV -4802S型双光束紫外分光光度计 (上海优浦科学仪器有限公司 ) ; DF110型电子分析天平
(中国轻工业机器总公司常熟衡天公司出品 ) ; SX T06型索氏提取仪 (上海洪纪仪器设备有限公
司 ) ; FZ102型微型植物粉碎机 (天津市斯特仪表有限公司 ) ; S HZ-Ⅲ型循环水真空泵 (北京华旦仪
器科技发展有限公司 ) ; 202- 2型高温干燥箱 (中华人民共和国上海市实验仪器总厂 ) ; HH-4型恒
温水浴锅 (江苏常州国化仪器厂 )等。
2. 2　实验方法
2. 2. 1　芦丁校准曲线的绘制
采用 NaNO2-Al( NO3 ) 3-NaOH光度法 [5 ]。准确称取干至恒重的芦丁标准品 0. 0264g,用 70%乙
醇溶解 ,定容于 100mL容量瓶 ,得质量浓度为 0. 264mg /mL芦丁标准液。 准确吸取芦丁标准溶液
0. 0、 1. 0、 2. 0、 3. 0、 4. 0、 5. 0、 6. 0、 7. 0mL置于 25m L比色管中 ,用 70%乙醇溶液补充至 10mL,加入
5% NaNO2 0. 7mL,摇匀 ,放置 5min后 ;加入 10% Al(NO3 ) 3 0. 7mL摇匀 ,放置 6min后 ,加入质量
分数 4% NaOH溶液 5. 0mL,用 70%乙醇稀释至刻度 ,摇匀放置 10min,以第一管作为空白 ,在
510nm处测吸光度 ,用最小二乘法进行线性回归 ,得芦丁溶液质量浓度 y ( mg /mL)与吸光度值 ( x )
关系曲线的回归方程式为: y= 9. 7951x+ 0. 0111,R2= 0. 9993。
2. 2. 2　提取因素及其条件的确定
为全面考察乙醇提取法的工艺参数及最佳提取条件 ,研究中确定以提取时间、料液比、提取温
度、乙醇浓度四个影响因素进行 L 9 ( 34 )正交试验设计 ,通过测定臭牡丹供试品中的黄酮类化合物提
取率 ,确定最佳提取工艺条件。 试验确定的因素水平如表 1所示。
表 1　试验因素水平
水平 因素
A提取时间 (h ) B料液比 ( g /mL) C提取温度 (℃ ) D乙醇浓度 (% )
1 1. 5 1∶ 30 60 60
2 2. 0 1∶ 40 70 70
3 2. 5 1∶ 50 80 80
2. 2. 3　臭牡丹中黄酮类化合物的提取和测定
称取臭牡丹粉末 2. 000 g,加入一定体积和浓度的乙醇溶液作为提取剂 ,于恒温水浴中加热回
流提取 ,一定的时间后 ,停止加热 ,提取液静置分层 ,过滤除渣 ,用 70%的乙醇溶液定容至 100 mL
容量瓶中 ,作为待测溶液。准确吸取 5 mL待测液于 25 mL容量瓶中 ,按 2. 2. 1项下的方法操作 ,测
定其在 510nm处的吸光度 ,代入下列的回归方程式 ,计算出黄酮类化合物的提取率:
臭牡丹中黄酮类化合物提取率 (% ) = [提取液中黄酮类化合物的质量 /臭牡丹粉末质量 ]
100%。
2. 2. 4　臭牡丹中黄酮类化合物对亚硝酸盐清除作用的测定 [ 6]
取 3支 10mL比色管 a、b、c ,准确吸取 2mL浓度为 5μg /mL的 NaNO2溶液两份 ,分别加入 a、 c
管中。吸取一定量臭牡丹黄酮类化合物溶液 ,分别加入 a、b管中 ,反应 10min后 ,a、b、 c管中分别加
入 0. 4%对氨基苯磺酸溶液 2. 0mL,摇匀 ,静置 5min,再加入 0. 2%盐酸萘乙二胺 1mL,摇匀 ,静置
3216 光谱实验室 第 30卷
15min后于波长 538nm处测得吸光度 ,同时用等质量浓度的维生素 C代替样品作为阳性对照。以 b
管为参比测得 a管的吸光度 ,以二次蒸馏水为参比测得 c管的吸光度 ,并计算清除率 ( T1 )。
T 1 (% )= [ ( A0 - A ) /A ]× 100 ( 1)
式中: A0——未加黄酮类化合物亚硝酸钠的吸光度 ; A——加黄酮类化合物后亚硝酸钠的吸光度。
2. 2. 5　臭牡丹中黄酮类化合物对超氧阴离子自由基清除作用的测定 [ 7, 8]
取 0. 05mol /l Tris-HCl缓冲溶液 ( pH8. 2) 4. 5mL,置于 25℃水浴中预热 20min,分别加入
0. 1mL臭牡丹黄酮类化合物溶液和 0. 4mL 2. 5mmol /L邻苯三酚溶液 ,混匀后于 25℃水浴中反应
4min,加入 8mol /L HCl溶液两滴终止反应 ,于波长 299nm处测定吸光度 ,空白对照组以相同体积
的二次蒸馏水代替样品。同时用等质量浓度的维生素 C代替样品作阳性对照 ,并计算抑制率 ( T2 )。
T2 (% )= { [A空白 - ( A样品 - A背景 ) ] /A空白 }× 100 ( 2)
式中: A背景——每管样品同时做一个背景对照 ,按样品管同时加入相同量的样品、缓冲液、邻苯三酚
用二次蒸馏水代替。
2. 2. 6　臭牡丹中黄酮类化合物对羟自由基清除作用的测定 [ 9]
往 10mL试管中依次加入 2mmol /L FeCl2、 2mmol /L H2O2、 6mmol /L水杨酸各 1mL,摇匀 ,于
37℃水浴中反应 15min,于波长 510nm处测定吸光度 ( A0 ) ,再加入 0. 2mL不同质量浓度的样品提
取物 ,加二次蒸馏水至 10mL,摇匀 ,静置 10min,于波长 510nm处测定吸光度 ( A1 ) ,同时用等质量
浓度的维生素 C代替样品作阳性对照 ,并计算抑制率 ( T3 )。
T3 (% )= [ ( A0- A1 ) /A0 ]× 100 ( 3)
2. 2. 7　臭牡丹中黄酮类化合物在猪油中的抗氧化作用
采用烘箱储藏法测定提取物对猪油自氧化的抗氧化能力 [10 ]。称取臭牡丹黄酮粉 0. 01、 0. 05、
0. 10g ,各用 4mL无水乙醇溶解后分别加到 20g温热猪油中 ,搅匀 ,以不加臭牡丹黄酮类化合物粉
末 ,仅在 20g猪油中加入 4mL无水乙醇为对照样 ,在 70℃烘箱中强化保存 ,定时搅伴 ,在不同时间
取样测定猪油中的过氧化值 ( POV ) ,并以此来表示猪油的氧化速度 ,进而衡量臭牡丹黄酮类化合
物的抗氧化活性。 过氧化值的测定按滴定法进行样品的过氧化值 ( POV )计算 [11 ] ,即:
POV = { [ (V1- V2 )×M ]÷ m }× 100 ( 4)
式中: POV—— 样品的过氧化值 ( mmol· kg- 1 ) ; V1—— 试样消耗硫代硫酸钠标准溶液体积 ( mL) ;
V2—— 空白试验消耗硫代硫酸钠标准溶液体积 (mL) ; M—— 硫代硫酸钠标准溶液的物质的量浓度
( mol· L- 1 ) ; m——样品质量 ( g )。
3　结果与讨论
3. 1　提取臭牡丹中黄酮类化合物的最佳工艺选择
根据表 1,以提取时间 ( A )、固液比 (B )、提取温度 (C )和乙醇浓度 (D ) 4个因素为影响因素 ,以
黄酮类化合物提取率为考察指标 ,进行的 L9 ( 34 )正交试验 ,其结果如表 2所示。
由表 2可以看出 ,臭牡丹中黄酮类化合物的最佳提取工艺为 A2B2C2D2 ,即提取时间 2. 0h ,固液
比 1∶ 40(g /mL) ,提取温度 70℃ ,乙醇浓度 70% ,提取时间、料液比、提取温度、乙醇浓度 4个因素
对黄酮类化合物提取率影响的主次顺序为:固液比> 乙醇浓度> 提取温度> 提取时间。采用上述最
佳提取工艺条件进行 3次重复实验 ,得到的臭牡丹中黄酮类化合物提取率分别为 3. 353%、
3. 354% 、 3. 352% ,进而得出黄酮类化合物提取率的平均值为 3. 353% ,相对标准偏差 ( RSD)为
0. 138% 。由此可见 ,经过正交实验筛选出来的臭牡丹中黄酮类化合物提取工艺条件是最优的组合 ,
3217第 6期 冯纪南等:臭牡丹黄酮类化合物提取及其抗氧化作用
实验结果稳定可靠 ,具有良好的可操作性和重现性。
表 2　正交试验结果
序号 A B C D 黄酮提取率 (% )
1 1 1 1 1 1. 853
2 1 2 2 2 3. 180
3 1 3 3 3 1. 930
4 2 1 2 3 2. 253
5 2 2 3 1 2. 710
6 2 3 1 2 2. 405
7 3 1 3 2 2. 431
8 3 2 1 3 2. 460
9 3 3 2 1 2. 101
K 1 6. 963 6. 537 6. 718 6. 664
K 2 7. 368 8. 35 7. 534 8. 016
K 3 6. 992 6. 436 7. 071 6. 643
k1 2. 321 2. 179 2. 239 2. 221
k2 2. 456 2. 783 2. 511 2. 672
k3 2. 331 2. 145 2. 357 2. 214
R 0. 135 0. 638 0. 272 0. 458
3. 2　臭牡丹黄酮类化合物对亚硝酸盐的清除作用
由图 1可知 ,臭牡丹黄酮类化合物对亚硝酸盐具有较高的清除率 ,随着臭牡丹黄酮类化合物质
量浓度的提高 ,对亚硝酸盐的清除作用逐步增强 ,量效关系十分明显。在质量浓度相同的条件下臭
牡丹黄酮类化合物对亚硝酸盐的清除率明显优于维生素 C。
图 1　臭牡丹黄酮类化合物对亚硝酸盐的清除效果 图 2　臭牡丹黄酮类化合物对超氧阴离子
自由基的清除效果
3. 3　臭牡丹黄酮类化合物对超氧阴离子自由基的清除作用
由图 2可以看出 ,不同质量浓度的臭牡丹黄酮类化合物对超氧阴离子自由基均具有良好的清
除效果。与对亚硝酸盐的作用相似 ,随着黄酮质量浓度的升高 ,对邻苯三酚自氧化速率的抑制作用
越加明显 ,并且优于维生素 C对照品。当添加质量浓度为 0. 011mg /mL的臭牡丹黄酮类化合物时 ,
超氧阴离子自由基的清除率可达 93%。
3. 4　臭牡丹黄酮类化合物对羟自由基清除作用
由图 3可见 ,臭牡丹黄酮类化合物对羟自由基同样具有较强的清除作用。在相同质量浓度条件
下 ,臭牡丹黄酮类化合物与维生素 C相比 ,具有较强的清除羟自由基的能力。在实验考察的质量浓
3218 光谱实验室 第 30卷
度范围 0. 003— 0. 011mg /mL内 ,随着臭牡丹黄酮类化合物质量浓度的增加 ,体系对羟自由基的清
除作用加强 ;仔细观察 ,还会发现 ,当质量浓度处于 0. 003— 0. 007mg /mL范围内清除率的曲线变
化较为平缓 ,而当质量浓度大于 0. 007mg /mL时 ,清除效果增强更为明显。 当质量浓度为
0. 011mg /mL时 ,清除率可达 90. 0%。
3. 5　臭牡丹黄酮类化合物对猪油过氧化的抑制作用
由图 4可知 ,在猪油中添加臭牡丹黄酮类化合物后 ,所有试验组的 POV值均低于空白对照组。
随着时间的延长空白对照组的过氧化值增加明显 ,而添加了臭牡丹黄酮类化合物后其过氧化值增
加较缓 ,这说明臭牡丹黄酮类化合物对猪油具有良好的抗氧化作用 ,其抗氧化作用随添加的黄酮类
化合物质量分数增加而增强。
图 3　臭牡丹黄酮类化合物对羟基自由基的
清除效果
图 4　臭牡丹黄酮类化合物添加量对猪油的
抗氧化效果
4　结论
( 1)实验确定的臭牡丹中黄酮类化合物最佳提取工艺条件是提取时间 2. 0h,固液比 1∶ 40
(g /mL) ,提取温度 70℃ ,乙醇浓度 70%。
( 2) 臭牡丹中黄酮类化合物对实验体系中的亚硝酸盐、超氧阴离子自由基和羟自由基具有明
显的清除和抑制作用。 在一定范围内 ,清除和抑制效果随添加黄酮类化合物质量浓度的增加而增
强 ,且在相同浓度条件下 ,其抗氧化活性均强于维生素 C。
( 3)通过对猪油的抗氧化实验 ,表明臭牡丹中黄酮类化合物对油脂有明显的抗氧化作用 ,可抑
制油脂的氧化酸败 ,并随添加量的增加抑制效果增强。
参考文献
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Extraction of Fl avonoid Compound fromClerodendrum bungei.
and it’ s Antioxodant Property
FENG Ji-Nan　 HUAN G Hai-Yinga　 YU Rui-Jinb　 DENG Bin
( Depar tment of Chemist ry and Li fe Science,X iangnan University,Chenzhou 423000, P. R. China )
a( English Department , X iangnan University,Chenzhou 423000,P. R.China)
b(College of Sciences, Northwest A& F University ,Yangling , 712100, P. R. China )
Abstract　 An optimal ex t raction processing fo r flavonoid compound from Clerodendrum bungei.
w as studied. and the antioxidant activi ty of f lav onoids compound w as determined. The effects of
factors including ex traction time, material-liquid ratio, ex t raction temperature, and ethanol
concentration w ere explored by orthogonal experiments to optimize the ex traction processing of
f lavonoids on the basis of the evaluation of f lav onoids yield. The antioxidant activi ty of f lav onoids w as
evaluated by scavenging rates on nit ri te, superoxide anion f ree radicals as w ell as hydroxyl f ree
radicals, and antioxidant effect on pork fat. The results showed that the optimal ex t raction conditions
for f lav onoids were ex t raction time of 2. 0h, material-liquid ratio of 1∶ 20 ( g /mL) , ex t raction
temperature of 70℃ , and ethanol concentration of 70% . The flavonoids from Clerodendrum bungei.
exhibi ted st rong scavenging capability on nit rite, superoxide anion free radicals and hydroxy l f ree
radicals. Meanwhile, the flavonoids from Clerodendrum bungei. had st rong antioxidant ef fect on pork
fat. The antioxidant activi ty of f lavonoids f rom Clerodendrum bungei . w as stronger than v itamin C.
Key words　 Clerodendrum bungei . ; Spect rophotometric Method; Flavonoid; Compound;
Ex traction Process; Antiox odant
《光谱实验室》 30年 ( 1984- 2013)歇业回顾
1　高效、保质、宽容的办刊特色 ;
2　出版宗旨只有一个:交流学术 ;
3　主编要名副其实 ,既要“主”也要“编”;不赞成挂名主编和挂名编委 ;
4　坚持自负盈亏是科技学术刊物改革的关键 ;
5　科技期刊宜“民办”、期刊社 (编辑部 )要成为法人单位 ;
6　中国知网、美国化学文摘 ( CA)等收录 ; 2011年 6218种统计源期刊中被引频次为第 749名 (影响因子
为第 1389名 ) ; 50种物理学期刊中为第 9名 (影响因子为第 15名 )—— 《中国期刊引证报告》 (扩刊版 );
7　每期发表论文 100余篇 ,页码 500页以上 ; 2011年 6218种统计源期刊中发文量为 396名 ; 50种物理
学期刊中为第 4名—— 《中国期刊引证报告》 (扩刊版 );
8　得到中国科学院前院长卢嘉锡的肯定和支持。
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