全 文 ： 1
基于响应面优化法的蚕蛹蛋白降血脂肽的酶解条件优化
杨玉英 1 王伟 2 张玉 2 张一帆 2 邬应龙 2
（1，四川农业大学食品学院，雅安，625014；
2，浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，杭州，310021；）


摘 要：基于响应面法优化对中性蛋白酶降解蚕蛹蛋白制备降血脂肽的酶解条件
进行了优化。得到制备蚕蛹蛋白降血脂肽的最佳酶解条件为：酶量 5.1%（w/w），
酶解时间 5h，酶解温度 52℃，酶解 pH=7.0，底/水比（w/v）=3.9%。在此条件
下，蚕蛹蛋白降血脂肽对 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶(HMGR)的抑
制率为 45.24%。建立了基于蚕蛹蛋白降血脂肽酶解条件的优化模型。验证实验
结果表明该模型的预测准确率达 97.31%。
关键词：响应面，酶解，蚕蛹蛋白，降血脂肽
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金（NO.31101390），浙江省自然科学基金
（LY13C200015 和 LQ13C200005）
作者简介：王伟（1979-)，男，博士，副研究员，研究方向：生物功能肽开发与应用。
通讯作者：*王伟, 副研究员。

The enzymatic hydrolysis condition optimization of
cholesterol-lowering silkworm pupa protein peptides based on
response surface methodology
Yang Yu-ying
1
Wang Wei
2
Zhang Yu

Zhang Yi-fan
2


Wu Ying-long
1

(1, College of Food Science, Sichuan University, Ya’an 625014, China;
2, Institute of Quality and Standard for Agriculture Products, Zhejiang Academy of Agricultural
Science, Hangzhou, 310021, China;)

Abstract:Optimization of the hydrolysis conditions of cholesterol-lowering silkworm
pupa protein peptides by response surface methodology was performed. The
网络出版时间：2014-05-20 15:08
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1759.TS.20140525.1242.006.html
2
optimized conditions were as follows: enzyme dosage 5.12%, hydrolyzing 5 hours at
the enzymolysis temperature 52℃ and pH=7.0 with a ratio of substrate/water (w/v)
3.91%,the HMGR inhibitory rate of cholesterol-lowering silkworm pupa protein
peptide reached 45.24%. A response surface optimized model based on the
cholesterol-lowering silkworm pupa protein peptide extraction conditions was
established. The verified test results showed the model with a 97.31% accurate rate.

Key words: response surface methodoly; hydrolyzing；silkworm pupa protein;
cholesterol-lowering peptides;

蚕蛹在我国资源丰富，是一种富含 18 种氨基酸的高质量蛋白，被联合国粮
农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）认定为高营养蛋白质来源。在中国，
食用蚕蛹具有悠久的历史，同时，中医也认为蚕蛹具有镇静、生津止渴等疗效。
蚕蛹也被中国卫生部确认为一种新的食物资源[1]。《本草纲目》载：蚕蛹味咸辛、
性平、无毒，人食可强身健身，入药可医多病，能补气养血、强腰壮肾、滋肺润
肠；《备急千金要方》载：蚕蛹性味咸温，主益精气[1]。大量研究证实，高蛋白
食品的功效多源于其中经生物蛋白酶降解而来的特定功能性肽段。在所有的生物
活性肽种类中，3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶（HMGR）抑制肽因其
具有良好的降低血脂的效果而备受关注。
HMGR 是目前已知的降血脂药物设计的最好靶标，已先后有 8 种 HMGR 抑
制剂(他汀类药物)获准上市,在降血脂药物市场上占有绝对的份额。但是，“拜斯
亭”事件使他汀类药物的安全性备受关注，特别是当他汀类药物与其它药物合用
时，会增加患疾病的危险性。所以对新型安全的 HMGR 抑制剂的需求十分迫切
[2-4]。周菊香[5]曾报道用蚕蛹肽喂养小鼠，研究其对小鼠生长的影响，结果认为蚕
蛹多肽具有降低血清胆固醇作用，使高胆固醇达到正常范围，并具有抗氧化作用，
这说明蚕蛹酶解肽中具有降低血脂功能的活性肽存在，值得进一步深入研究。
生物活性肽是近年来研究的热点。蚕蛹蛋白生物活性肽研究以我国的研究和
报道为主，杨安树等[6]酶解蚕蛹得到了免疫活性肽，吴琼英等[7]、贾俊强等[8]酶
解蚕蛹得到了 ACE 抑制肽。肖燕平等[9]、李高扬等[10]、赵钟兴等[11]均以 DPPH·自
3
由基清除能力为指标，研究了蚕蛹蛋白酶解制备抗氧化肽的最优条件。在已报道
的蚕蛹活性肽研究中，未见蚕蛹蛋白制备降血脂肽的酶解条件优化研究的相关报
道。本文基于响应面的方法，拟对蚕蛹蛋白降血脂肽的酶解条件进行优化研究，
为后续对蚕蛹蛋白降血脂肽的开发和利用提供制备基础，为蚕蛹蛋白的综合利用
提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 原料与仪器
蚕蛹蛋白粉 购自于南通福尔生物制品有限公司；中性蛋白酶（100AU/g）
购自于上海源叶生物科技有限公司；HMG-CoA 还原酶（HMGR） 浓度≥90%，
Sigma 公司；HMG-CoA 浓度≥90%，Sigma 公司；辛伐他汀 浓度≥97%，Sigma
公司；美伐他汀 浓度≥95%，Sigma 公司；NADPH 浓度≥98%，上海源叶生物
科技有限公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钠等 均为分析纯。
Dionex UltiMate 3000 加压毛细管色谱仪 美国 Dionex 公司；KQ-50B 型超
声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；HH.S21CR4 电热恒温水浴锅 上海锦
屏仪器仪表有限公司；EZ-2 真空离心浓缩仪 英国 Genevac 公司；DZF-6050
型真空干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；TDL-5-A 离心机 Anke 公
司;SHZ-82A 型水浴恒温振荡器 国旺仪器。
1.2 蚕蛹蛋白降血脂肽的制备
蚕蛹蛋白粉 10g(其中蛋白质含量为 75%，以纯蛋白 7.5g 计)，加入 250mL
具塞三角瓶中，加入 200mL 去离子水，搅拌均匀，90℃水浴加热 10min 使蛋
白质适度变性，然后冷却至 45℃，用 1mol/L 的 NaOH 或 HCl 溶液调 pH 至中性
蛋白酶的最适 pH7.0，然后加入蚕蛹蛋白粉质量 2%的中性蛋白酶，置于 45℃、
150r/min 的恒温振荡器中酶解 5h，快速升温至 90℃并保温 10min 进行灭酶。冷
却后 4000r/min 离心 15min，收集上清液，得蚕蛹蛋白肽，待测定 HMGR 抑制率
活性。
1.3 HMGR 抑制率的测定方法
1.3.1 色谱条件 Symmetry® C18 色谱柱 (5μm，4.6 mm×250mm)。流动相为: V
(K2HPO4-KH2PO4)：V ( 甲醇 ) = 85:15，pH =7.2，等度洗脱，流速 1.0mL/min；
4
检测波长 337nm；进样量 20μL； 柱温 25℃。
1.3.2 反应体系步骤 反应中各种组分的加入量及顺序如表 1 所示，反应温度
37℃水浴 20min，反应完成后加入 200μL 0.5mol/L NaOH 溶液终止反应，按 1.3.1
的色谱条件测量样品中 NADPH 的浓度。
表 1 反应体系组成成分
Table 1 The ingredient of reaction system
组别
反应缓冲液
(μL)
HMGR 溶液
(μL)
HMG-CoA
(μL)
抑制剂溶液
(μL)
NADPH
(μL)
空白组 80 0 10 0 10
酶对照组 70 10 10 0 10
抑制剂组 60 10 10 10 10
1.3.3 抑制率的计算


HMG-CoA + 2NADPH + 2H
+
MVA + H SCoA + 2NADP
+

加入抑制剂后, HMG-CoA 还原酶的活性受到抑制, 底物反应的量减少。因此,
可以利用 HPLC 测定反应前后 NADPH 量的变化来评价抑制剂对 HMG-CoA
还原酶的抑制率。计算公式为：
R = ( S 抑制剂- S 对照) / ( S 空白- S 对照)×100
式中, R 为抑制率 (% ); S 空白、S 对照和 S 抑制剂分别为空白组、酶对照组和抑
制剂组中 NADPH 的峰面积( mAU•min)。
1.4 单因素实验
1.4.1 酶用量对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率的影响
按 1.2 蚕蛹蛋白降血脂肽制备方法，蛋白酶用量以 1%、2%、3%、4%、5%
处理样品。按底/水比为 7.5g/200mL，酶解温度为 45℃，时间为 5h，pH 为 7.0
操作，分析不同酶用量对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率的影响。
1.4.2 酶解时间对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率的影响
按 1.2 蚕蛹蛋白降血脂肽制备方法，酶解时间分别为 3、4、5、6、7h。按底
HMG-CoA 还原酶
5
/水比为 7.5g/200mL，酶解温度为 45℃，酶用量为 2%，pH 为 7.0 进行酶解，分
析不同酶解时间对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率的影响。
1.4.3 酶解 pH 对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率的影响
按 1.2 蚕蛹蛋白降血脂肽制备方法，酶解体系的 pH 分别调节为 5.5、6.0、
7.0、8.0、8.5，按底/水比为 7.5g/200mL，酶解温度为 45℃，时间为 5h，酶用量
为 2%进行酶解，分析不同酶解 pH 对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率的影响。
1.4.4 酶解温度对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率的影响
按 1.2 蚕蛹蛋白降血脂肽制备方法，酶解温度分别为 35、40、45、50、55℃。
按底/水比为 7.5g/200mL，酶用量为 2%，时间为 5h，pH 为 7.0 进行酶解，分析
不同酶解温度对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率的影响。
1.4.5 底/水比对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率的影响
按 1.2 蚕蛹蛋白降血脂肽制备方法，以 1.5%、2.5%、3.75%、5%、7.5%、
10%的底/水（w/v）比处理样品。按酶用量为 2%，酶解温度为 45℃，时间为 5h，
pH为 7.0进行酶解，分析不同底/水比对蚕蛹蛋白降血脂肽HMGR抑制率的影响。
1.5 响应面优化法的中心点实验
以单因素实验中对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率影响最显著的因素为因
子，运用 DESIGN EXPERT 8.0 软件的 Central Composite Design 进行中心点实验
设计，根据单因素实验结果，选择对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率具有显著
影响的 3 个因素：底/水比（A）、酶用量(B)和酶解温度(C)，做三因素三水平响
应面分析实验，实验因素与水平设计见表 2。
表 2 因素水平编码
Table 2 Code and level of factors chosen





因素
水平
-1 0 1
底/水比 A(%，w/v) 2.5 3.75 5
酶用量 B(%，w/w) 2 4 6
酶解温度 C(℃) 45 50 55
6
1.6 数据处理
本研究运用 DESIGN EXPERT 8.06 软件进行中心点实验设计，SPSS18.0 软件
进行统计分析。数据采用平均数±标准偏差以及百分数表示，各组数据均数间用
t 检验判断其差异显著性。p<0.05 为显著性差异，p<0.01 为极显著性差异。
2 结果与讨论
2.1 单因素实验
2.1.1 酶用量对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率的影响结果 由图 1
可知，随着酶用量的变化，蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率也会发生改变。当
酶用量为 4%时，抑制率最大，为 30.60%±2.61%，因此确定 4%是酶用量的最佳
条件。同时，随着酶用量的变化，HMGR 抑制率的最大差值为 18.08%。由蛋白
酶用量和 HMGR 抑制率的变化趋势可见，随着蛋白酶的用量增加，抑制率随之
增加，说明原蛋白中的多个活性肽段被不断降解下来，相应的功能性得以逐步体
现。然而，在酶用量增大到 3%时，抑制率出现了一定程度下降，可能是由于具
有抑制活性的大分子肽段被蛋白酶进一步降解，而降解后的肽段不具备 HMGR
抑制活性或者活性下降而导致的整体测定活性下降。酶用量的进一步增加到 4%，
使蛋白酶对底物蛋白的作用位点增多，增加了有活性肽段的得率，但当蛋白酶增
加到 5%时，HMGR 抑制活性显著从 30.60%下降到 17.83%，说明底物蛋白在大
量蛋白酶的作用下，在相同的酶解时间下会出现过度降解，有活性的肽段可能被
蛋白酶进行二次降解失活。上述分析说明，恰当的蛋白酶用量对 HMGR 抑制活
性具有显著影响。
7

图 1 酶用量对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率的影响
Fig.1 The effect of enzyme dosage on the HMGR inhibitory rate of cholesterol-lowering silkworm
pupa protein peptide

2.1.2 酶解时间对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率的影响结果 由图
2 可知，随着酶解时间的增加，蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率逐渐增加。当
酶解时间到达 5h 后，抑制率逐渐趋于稳定，故选择 5h 作为适宜酶解时间，其蚕
蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率为 27.99%±0.61%。同时，随着酶解时间的变化，
HMGR 抑制率的最大差值为 8.55%，酶解产物的活性提高了 30.10%。在固定的
蛋白酶添加量条件下，蛋白酶首先对底物蛋白的主体结构进行降解，随着酶解时
间的延长，具有活性的肽段得以逐步解离下来，HMGR 抑制活性逐步增加，但
是在底物蛋白的所有位点都基本降解完毕后，底物蛋白受蛋白酶的酶解作用结
束，酶解时间的延长将不再影响显著 HMGR 抑制活性。
8

图 2 酶解时间对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率的影响
Fig.2 The effect of enzymolysis time on the HMGR inhibitory rate of cholesterol-lowering
silkworm pupa protein peptide

2.1.3 酶解 pH 对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率的影响结果 由图
3 可知，随着酶解 pH 的增加，蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率逐渐增加。当酶
解 pH 为 7.0 时，抑制率最高为 30.55%±0.86%；之后则逐渐降低，为此选择 7.0
作为酶解 pH 的最佳条件。同时，随着酶解 pH 的变化，HMGR 抑制率从 11.41%
到 30.55%，最大差值达到 19.14%，酶解产物的活性提高了 62.65%。在固定的酶
用量和酶解时间等条件下，pH 值对 HMGR 抑制率影响明显，但是本研究采用的
是中性蛋白酶，从图 3 中可见，只有 pH 值在中性范围内，HMGR 抑制率的抑制
活性最高，这与蛋白酶活性的最适 pH 值条件有关。

9

图 3 酶解 pH 对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率的影响
Fig.3 The effect of pH value on the HMGR inhibitory rate of cholesterol-lowering silkworm pupa
protein peptide

2.1.4 酶解温度对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率的影响结果 由图
4 可知，随着酶解温度的增加，蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率逐渐增加。当
酶解温度到达 50℃时，抑制率最高为 36.07%±1.14%；之后则逐渐降低，为此选
择 50℃作为酶解温度的最佳条件。同时，随着酶解温度的变化，HMGR 抑制率
从 9.59%到 36.07%，最大差值为 26.48%，酶解产物的活性提高了 73.41%。每一
种蛋白酶都有其最适活性温度，本研究采用的中性蛋白酶，在 50℃时，蛋白酶
活性最强，酶解活性肽的得率最高。
10

图 4 酶解温度对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率的影响
Fig.4 The effect of temperture on the HMGR inhibitory rate of cholesterol-lowering silkworm
pupa protein peptide

2.1.5 底/水比对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率的影响结果 由图 5
可知，随着底/水比的增加，蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率逐渐增加。当底/
水比到达 3.75%时，抑制率最高为 34.14±1.22%；之后则逐渐降低，为此选择 3.75%
作为底/水比的最佳条件。同时，随着酶解底/水的变化，HMGR 抑制率从 8.64%
到 34.14%，最大差值为 25.5%，说明酶解产物的活性提高了 74.69%。恰当的底
物蛋白浓度是发挥蛋白酶最佳酶解能力的关键，底物浓度过低，蛋白酶与蛋白底
物的酶切位点作用机会减少，酶解产物得率低。本研究在底/水比低于 3.75%时，
抑制率呈上升趋势，说明底物浓度增加的同时即增加了蛋白酶与酶切位点作用几
率，活性肽段得率随之增加。当浓度高于 3.75%时，活性随之下降，说明一方面
蛋白酶与酶切位点的作用几率增加，会出现过度降解现象，有活性的肽段可能被
降解为无活性组分。另外，由于底物浓度继续增加，蛋白酶在酶解体系中对底物
的作用区域受限，可能成为活性肽段得率降低的原因之一。
11


图 5 底/水比对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率的影响
Fig.5 The effect of substrate/water ratio on the HMGR inhibitory rate of cholesterol-lowering
silkworm pupa protein peptide

由以上的单因素实验结果可见，酶解温度、酶解的底/水比在单因素影响下，
HMGR 抑制率的最大差值已超过 20%，而酶解 pH 和酶解时间也接近 20%，在
本研究的蛋白酶种类选择预实验中，通过对中性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白
酶、胰蛋白酶及风味蛋白酶等多个蛋白酶，比较其酶解蚕蛹蛋白所得活性肽对
HMGR 抑制活性抑制率时，中性蛋白酶所得酶解肽的活性最强，而其最佳 pH 由
于蛋白酶特性关系，肯定在中性附近活性比较好，故 pH 本研究响应面中不作为
关键因子，而将酶用量作为中心点实验的关键因子。
2.2 响应面优化法的中心点实验结果
表 3 响应面分析实验设计与结果
Table 3 Design and results of response surface analysis test
实验号 A B C 抑制率（%）
12
1 -1.00 -1.00 -1.00 21.83
2 -1.00 1.00 0.00 42.29
3 0.00 0.00 1.68 42.26
4 0.00 0.00 0.00 44.54
5 0.00 0.00 0.00 44.30
6 1.00 1.00 -1.00 35.16
7 0.00 0.00 0.00 44.62
8 0.00 1.68 0.00 25.31
9 0.00 -1.68 0.00 22.30
10 -1.00 1.00 -1.00 28.41
11 1.00 -1.00 -1.00 33.53
12 1.00 -1.00 1.00 36.83
13 1.00 1.00 1.00 40.79
14 1.68 0.00 0.00 41.40
15 -1.68 0.00 0.00 33.02
16 -1.00 -1.00 1.00 30.55
17 0.00 0.00 0.00 45.44
18 0.00 0.00 -1.68 35.21
19 0.00 0.00 0.00 45.11
20 0.00 0.00 0.00 44.18
表 4 中心组合实验的方差分析结果
Table 4 The ANOVA results of central composite test
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 p>F
模型 1226.92 9 136.32 34.70 <0.0001
A 102.00 1 102.00 25.96 0.0005
B 61.46 1 61.46 15.64 0.0027
C 137.84 1 137.84 35.08 0.0001
A
2
104.71 1 104.71 26.65 0.0004
B
2
796.62 1 796.62 202.77 <0.0001
13
C
2
67.01 1 67.01 17.06 0.0020
AB 20.26 1 20.26 5.16 0.0465
AC 23.36 1 23.36 5.95 0.0349
BC 7.01 1 7.01 1.78 0.2111
残差 39.29 10 3.93
失拟项 31.74 5 6.35 4.20 0.0705
纯误差 7.55 5 1.51
总和 1266.21 19 R2=0.9690 R2Adj=0.9410

由表 4 的方差分析结果可知，模型的 R2=0.9690，实验结果与中心点组合实
验设计相吻合，拟合模型：
抑制率（%）=45.49+2.73A+2.12B+3.18C-2.70A2-7.43B2-2.16C2-1.59AB-1.71AC+0.94BC 式
（1）
采用 Design-Expert 8.06 软件作图，各因素对 HMGR 抑制率影响的响应面见
图 6。由图 6 的三维曲面图，可以直观地反应两个因素之间对响应值的交互作用。
从响应面的最高点可以看出，在所选择的因素取值区间内存在极值。从底/水比
与酶用量的交互作用曲面图可知，随着蛋白酶用量的增加，HMGR 抑制率呈现
增加后降低的趋势。在固定的酶用量条件下，随着底/水的增加，HMGR 抑制率
也呈现增加后逐渐降低的趋势，这与单因素试验结果吻合。同样，底/水比与酶
解温度以及酶用量与酶解温度的交互作用对 HMGR 抑制率的影响均与单因素试
验结果吻合。比较三个因素的两两交互作用图，A（底/水比）与 B(酶用量)以及
A（底/水比）与 C（酶解温度）的交互作用对 HMGR 抑制率的影响较大，表现
为曲面比较陡，而在选定的取值区间内，C（酶解温度）和 B(酶用量) 的交互对
HMGR 抑制率的影响不明显，曲面图表现为相对平缓，曲面响应值变化小。这
与模型方差分析结果的 AC 与 AB 两项 p>F 值均小于 0.05，具有显著性意义吻合。
中心组合实验设计中，中心点的蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 平均抑制率为
44.70%。通过模型预测的最佳提取条件为底/水比 3.9%，酶用量 5.1%，酶解温度
52℃；该预测模型的最佳 HMGR 抑制率为 46.49%。按模型预测的最佳条件重复
实验 3 次，实际抑制率平均值为 45.24%，与模型预测结果的吻合率达 97.31%，
14
以同样的检测方法，具有降血脂作用的药物辛伐他汀和美伐他汀分别在浓度为
0.2mg/mL 时，HMGR 抑制率分别为 78%和 27%。此时底物的水解度为 60.12%。
其作者在利用蚕蛹蛋白通过双酶水解制备抗氧化肽的研究中，所得最优条件下的
水解度为 73.29%，说明同一蛋白底物在不同的蛋白酶作用下，所得产物所具有
的生物活性不同，最优条件下的底物水解度也不相同[12]。







15



图 6 A、B、C 各因素交互作用对蚕蛹蛋白降血脂肽 HMGR 抑制率的影响
Fig.6 Effect of the interactions between A,B,C on HMGR inhibitory rate of cholesterol-lowering
silkworm pupa protein peptide


16
3 结论
蚕蛹多肽具有诸多生物功效，不同酶解条件下所得多肽活性具有显著差异。
本研究选择中性蛋白酶，通过单因素实验和响应面中心点组合试验，逐步优化了
蚕蛹蛋白降血脂肽的酶解条件。其最佳酶解条件为底/水比 3.9%，酶用量 5.1%，
酶解温度 52℃，酶解时间 5h，酶解 pH=7.0。在此条件下，蚕蛹蛋白降血脂肽的
HMGR 平均抑制率为 45.24%。此外，还建立了基于蚕蛹蛋白降血脂肽酶解条件
的优化模型。验证实验结果表明该模型的预测准确率达 97.31%。采用优化的酶
解条件酶解蚕蛹蛋白降血脂肽，其 HMGR 抑制率较单因素试验得到了提高。


参考文献
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