全 文 ：现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2009, Vol.25, No.3
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亮叶杨桐叶总黄酮提取及抑菌活性的研究
袁尔东 1，肖仔君 2，刘本国 3，宁正祥 1，谢梅芳 1
（1.华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640）（2.韶关学院食品科学与工程系，广东 韶关 512005）
（3.河南科技学院食品学院，河南 新乡 453003）
摘要：从亮叶杨桐叶中提取黄酮类物质，通过响应面实验，确定其最适提取工艺条件为：水浴温度 70 ℃、乙醇浓度 63.04%、
液固比 19.58、提取时间 10 min，在该条件下的提取率为 95.58%。体外抑菌实验显示，亮叶杨桐叶总黄酮提取物对大肠杆菌、沙门氏
菌、李斯特菌、志贺氏菌及金黄色葡萄球菌的生长均有良好的抑制作用，并具有明显的剂量-效应关系。
关键词：亮叶杨桐；黄酮；提取；抑菌
中图分类号：TS202.3；文献标识码：A；文章篇号:1673-9078(2009)03-0305-04
Extraction and Antimicrobial Activity of Flavonoids from
Adinandra nitida Leaves
YUAN Er-dong1, XIAO Zi-jun2, LIU Ben-guo 3, NING Zheng-xiang1, XIE Mei-fang1
（1.College of Light Industry and Food Science, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China）
（2.Collgege of Food Science and Engineer, Shaoguan University, Shaoguan 512005, China）
（3.School of Food Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China）
Abstract: The extraction of flavonoid from Adinandra nitida leaves was studied. By response surface design, the optimum extraction
conditions were determined as follows: extraction temperature 70 ˚C, ethanol concentration 63.04 %, ratio of solvent to material 19.58, and
extraction time 10 min. Under those conditions, extraction rate of flavonoids in Adinandra nitida leaves reached 95.58 %. In vitro antimicrobial
experiments showed that the flavonoid extract could significantly inhibit the growth of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Shiga bacillus,
Salmonella typhimurium and Listeria in a dose-dependent manner.
Key words: Adinandra nitida; flavonoid; extraction; antimicrobial activity
亮叶杨桐（Adinandra nitida）主要分布于我国广
西、广东、贵州等省区，以其鲜嫩叶制成的一种代茶
产品——石崖茶（石芽茶），因其风味独特并具有消
炎解毒、降压、退热、止血、杀菌、镇痛等多种功效，
而广被人们青睐[1]。目前，在广西等地人工种植亮叶
杨桐的面积逐年扩大，但对其的开发利用还仅限于初
级茶叶加工，附加值较低。进入 21 世纪，天然、绿色
已成为一种时尚。天然黄酮类化合物因其较低的毒性
以及显著的抗氧化、降血脂、降血压、抗菌作用，而
受到人们的广泛关注。研究显示[2~3]，亮叶杨桐叶中黄
酮类化合物含量超过 20 %，在自然界十分少见，具有
广阔的开发应用前景。本文对亮叶杨桐叶中黄酮类物
质的提取和抑菌性能进行研究，以期为亮叶杨桐叶的
深度开发利用提供有益参考。
收稿日期：2008-09-24,
作者简介：袁尔东（1975-），女，讲师，硕士，主要从事为食品化学及天然
产物研究
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 原材料
亮叶杨桐叶：产于广西省平乐市，为 2007 年秋
采摘。
1.1.2 供试菌种
大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌
（Staphylococcus aureus）、志贺杆菌（Shiga bacillus）、
沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、单核增生李斯特
菌（Listeria）：广东省微生物研究所。
1.1.3 培养基
营养肉汤培养基：广东省环凯生物有限公司。
1.1.4 仪器与设备
旋转蒸发仪：RE-52，上海雅荣生化仪器公司；
高效液相色谱仪：美国 Waters 公司；恒温振荡器：
THZ-82，金坛市富华仪器有限公司。
DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2009.03.032
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1.2 实验方法
1.2.1 亮叶杨桐叶中总黄酮含量的测定
研究显示[2~3]，亮叶杨桐叶中黄酮类化合物主要
包括山茶苷 A、山茶苷 B 和芹菜素等，其中山茶苷 A
的含量为最高，占总黄酮中 90 %以上，故可通过检测
山茶苷 A 的含量来检测总黄酮含量。
在先前的研究中，一般采用 AlCl3 显色法，以芦
丁为标准样来测定亮叶杨桐叶中总黄酮含量[1,4-5]，该
显色法是基于黄酮类化合物能和 Al3+相螯合生成黄色
的显色物（在 410~430 nm 的范围内有吸收峰）[6]。但
在本研究中，山茶苷 A 的溶液在加入 Al3＋后，紫外吸
收光谱并未像芦丁那样发生红移现象，这说明山茶苷
A 与 Al3＋不发生螯合作用[2]。因此采用 AlCl3显色法可
能无法反映亮叶杨桐叶中总黄酮含量。
由于国内外均无山茶苷 A 的商业标准品，本研究
采用经高速逆流色谱分离后再冷冻干燥后的山茶苷 A
晶体（经 HPLC、UV、IR、MS、NMR 鉴定为纯度极
高的单一成分）作为标准品，采用紫外分光光度法测
定总黄酮含量。虽然山茶苷 A、山茶苷 B、芹菜素在
260 和 330 nm 处均有最大吸收，但鉴于蛋白、酚酸、
核酸等在 260 nm 附近具有吸收，因此将检测波长确
定在 330 nm。
1.2.1.1 山茶苷 A 浓度-吸光度标准曲线的测定
取山茶苷 A 标样 11.4 mg 溶于一定量的甲醇中，
用甲醇定容至 100 mL，混合均匀，得山茶苷 A 的标
准溶液。分别取上述山茶苷 A 标准溶液 0、0.25 mL、
0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL 于 6 个 10 mL 容量瓶中，
用甲醇定容，混合均匀后，测定其在 330 nm 波长处
的吸光值，以含山茶苷 A 标准溶液 0 mL 的试液为空
白参比。以吸光度为横坐标、山茶苷 A 浓度为纵坐标
(μg/mL)，绘制标准曲线。
1.2.1.2 叶中总黄酮含量的测定
准确称取 W g（2~2.5 g）粉碎的样品，用滤纸包
好后放入索氏抽提器中，80 ℃下 150 mL 甲醇抽提 10
h。将所得甲醇提取液转入 250 mL 容量瓶中，用一定
量的新鲜甲醇液充分洗涤抽提器，洗液也转入 250 mL
容量瓶中，用甲醇定容，充分混合。准确量取 1 mL
上述溶液于 25 mL 容量瓶中，用甲醇定容，混合均匀。
准确量取该定容液 1 mL 于 10 mL 容量瓶中，用甲醇
定容，混合均匀，于波长 330 nm 处测定吸收值。在
山茶苷 A 浓度-吸光值的工作曲线上查出相应的浓度
Y (μg/mL)。样品中总黄酮的含量按以下公式计算：
%100
10001000
2502510%/ ×××
×××=
W
Y总黄酮含量
1.2.2 亮叶杨桐叶总黄酮提取工艺的优化
1.2.2.1 亮叶杨桐叶总黄酮的提取
称取一定量的经粉碎的亮叶杨桐叶样品，放入锥
形瓶中，加入一定体积、一定浓度的乙醇溶液，保温
振荡提取一段时间后趁热过滤。将滤液真空浓缩，烘
干得到亮叶杨桐叶总黄酮提取物。
1.2.2.2 响应面实验
选取水浴温度、乙醇浓度、提取时间、液料比等
可能影响总黄酮提取效果的因素，以总黄酮提取率为
指标值，采用 Design Expert 7.0 中的响应面实验设计
法（Response Surface Method，RSM），进行水浴温度、
乙醇浓度、提取时间、液料比等四因素共 30 个实验点
的实验，以优化提取工艺条件。
1.2.2.3 总黄酮提取率的计算
准确称取一定量的亮叶杨桐叶总黄酮提取物，定
容于一定体积的甲醇中，混合均匀，于波长 330 nm
处测定吸光值。在山茶苷 A 浓度-吸光度标准曲线上
查出相应的浓度，计算亮叶杨桐叶总黄酮提取物中的
总黄酮含量 Y（%）。总黄酮提取率按以下公式计算：
%100% ××
×=
XA
YB）总黄酮提取率（
其中，A 为原料质量（g），X 为原料的总黄酮含量（%）；
B 为亮叶杨桐叶总黄酮提取物的质量（g），Y 为亮叶杨桐叶总
黄酮提取物中的总黄酮含量（%）。
1.2.3 亮叶杨桐叶总黄酮提取物的抑菌活性测定
1.2.3.1 抑菌直径的测定
MHA 培养基灭菌后，每 100 mL 培养基中分别接
入 500 μL 的细胞密度为 108 cfu/mL 的五种指示菌株，
振匀后倒平板。冷却后在每个孔洞加入 50 μL 亮叶杨
桐叶总黄酮提取物的乙醇溶液，以乙醇为对照。 每个
平板做三个平行样，于 37 ℃培养箱中培养 24 h，量取
抑菌圈直径[7]。
1.2.3.2 抑制曲线的测定
将亮叶杨桐叶总黄酮提取物加入到培养液中，使
其终浓度分别为 0.00625、0.0125、0.025、0.0375 和
0.05 mg/mL，分别以 1%的接种量接入五种指示菌株，
于 37 ℃下培养，在不同的时间分别取样测定其 OD500
值，绘制抑制曲线[8]。
2 结果与讨论
2.1 亮叶杨桐叶总黄酮提取工艺条件的优化
影响亮叶杨桐叶总黄酮提取效果的因素包括水
浴温度、乙醇浓度、提取时间和液料比，根据前期单
因素实验结果，以总黄酮提取率为指标值，采用
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Design-Expert 7.0 软件设计了如表 1 所示的响应面实
验方案。表 2 为响应面实验的方差分析，其中水浴温
度和乙醇浓度对总黄酮提取率有显著影响，而在实验
设定的范围内提取时间和液料比的影响并不明显。
表1 响应面实验方案及实验结果
Table 1 Design and results of RSM experiment
编
号
提取时
间 /min
提取温
度/℃
液固
比
乙醇浓
度/%
总黄酮提取
率/%
1 25 50 20 70 90.09
2 25 50 20 40 88.14
3 40 50 20 70 90.64
4 10 70 30 40 90.75
5 10 30 30 40 72.04
6 25 30 20 70 89.16
7 25 50 20 70 87.97
8 25 50 20 100 61.21
9 40 70 30 40 68.61
10 10 70 10 100 67.74
11 25 50 20 70 89.72
12 10 30 10 40 69.46
13 10 70 10 40 88.79
14 40 70 10 100 77.85
15 10 50 20 70 90.19
16 10 30 30 100 55.92
17 40 70 10 40 84.39
18 25 50 10 70 85.81
19 25 50 30 70 86.57
20 25 50 20 70 89.42
21 40 30 30 40 83.92
22 25 50 20 70 88.99
23 40 70 30 100 80.75
24 25 50 20 70 86.04
25 10 70 30 100 75.56
26 10 30 10 100 48.23
27 40 30 30 100 57.15
28 40 30 10 100 51.19
29 25 70 20 70 90.90
30 40 30 10 40 64.12
Design-Expert 7.0 软件给出的亮叶杨桐叶总黄酮
最适提取条件为提取时间 10 min、乙醇浓度 63.04 %、
水浴温度 70 ℃、液固比 19.58，在该条件下的提取率
为 95.58 %。
表2 响应面实验结果的方差分析
Table 2 ANOVA of the RSM experiment
项目 平方和 自由度 均方 F 值 Pro＞F
模型 4656.28 14 332.59 9.12 ＜0.0001
A 2×10-4 1 2×10-4 5.485×10-6 0.9982
B 999.79 1 999.79 27.42 0.0001
C 63.06 1 63.06 1.73 0.2082
D 1006.81 1 1006.81 27.61 ＜0.0001
AB 30.17 1 30.17 0.83 0.3774
AC 3.21 1 3.21 0.088 0.7707
AD 97.47 1 97.47 2.67 0.1229
BC 95.70 1 95.70 2.62 0.1260
BD 134.62 1 134.62 3.69 0.0739
CD 15.62 1 15.62 0.43 0.5227
A2 0.76 1 0.76 0.021 0.8873
B2 0.063 11 0.063 1.723×10-6 0.9674
C2 35.17 1 35.17 0.96 0.3416
D2 598.55 1 598.55 16.42 0.0010
残差 546.93 15 36.46
总差 5203.21 29
2.2 亮叶杨桐叶总黄酮提取物抑菌性能的分析
如表 3 所示，亮叶杨桐叶总黄酮提取物对沙门氏
菌、大肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核增
生李斯特菌均有一定的抑制效果，其中对革兰氏阴性
菌的抑制效果明显强于对革兰氏阳性菌的抑制效果。
表3 亮叶杨桐叶总黄酮提取物的抑菌效果
Table 3 Antimicrobial activity of the flavonoid extract
菌种 抑菌圈直径（mm）
对照 9.3
沙门氏菌 11.1±0.3
大肠杆菌 10.8±0.4
志贺氏菌 10.5±0.3
金黄色葡萄球菌 10.1±0.2
单核增生李斯特菌 10.1±0.3
为进一步分析不同浓度亮叶杨桐叶总黄酮提取
物对这五株肠道致病菌的抑制作用，本实验还对其抑
菌曲线进行了测定，结果如图 1～5 所示。亮叶杨桐叶
总黄酮提取物对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球
菌、李斯特菌和志贺氏菌生长均有较好的抑制作用，
并呈现出良好的剂量-效应关系。
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图1 亮叶杨桐叶总黄酮提取物对沙门氏菌生长的影响
Fig.1 Effect of the flavonoid extract on the growth of
Salmonella typhimurium
图2 亮叶杨桐叶总黄酮提取物对大肠杆菌生长的影响
Fig.2 Effect of the flavonoid extract on the growth of
Escherichia coli
图3 亮叶杨桐叶总黄酮提取物对志贺氏菌生长的影响
Fig.3 Effect of the flavonoid extract on the growth of Shiga
bacillus
图4 亮叶杨桐叶总黄酮提取物对金黄色葡萄球菌生长的影响
Fig.4 Effect of the flavonoid extract on the growth of
Staphylococcus aureus
图5 亮叶杨桐叶总黄酮提取物对单核增生李斯特菌生长的影
响
Fig. 5 Effect of the flavonoid extract on the growth of
Staphylococcus aureus
3 结论
根据响应面实验结果，确定亮叶杨桐叶总黄酮的
最佳提取工艺条件为，提取时间 10 min、乙醇浓度
63.04 %、水浴温度 70 ℃、液固比 19.58，在该条件下
的提取率为 95.58 %。体外抑菌实验显示，亮叶杨桐
叶总黄酮提取物对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄
球菌、单核增生李斯特菌和志贺氏菌的生长均有明显
的抑制作用，并呈现出良好的剂量-效应关系。
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