全 文 ：温 室 黄 瓜 叶 部微 生 物 区 系＊
王振跃　汪　敏　高书锋　张　猛　袁虹霞　李洪连＊＊
(河南农业大学植物保护学院 , 郑州 450002)
摘　要　采用稀释分离法和消毒叶片研磨液培养法对温室黄瓜叶围和内生微生物进行了
分离 ,共分离到 248个菌株 ,初步鉴定出 13个属的叶围真菌 ,其中链格孢属(Alternaria)和
青霉属(Penicilium)真菌为优势类群;鉴定出 4个属的内生真菌 ,其中曲霉属(Aspergilus)
真菌为优势类群;10个属的叶围细菌 ,其中芽孢杆菌属(Bacilus)和黄单胞菌属 (Xan-
thomonas)细菌为优势类群;6个属的内生细菌 ,其中芽孢杆菌属和假单胞菌属(Pseudo-
monas)细菌为优势类群;6个属的叶围酵母菌 ,其中隐球酵母属(Cryptococcus)为优势类群;
已鉴定出 2 个属的叶围放线菌 , 分别为链霉菌属 (Streptomyces)和小多孢菌属
(Micropolpspora)。未分离到内生酵母菌和放线菌 。
关键词　黄瓜;叶围;内生菌;微生物区系
中图分类号　Q948.12　文献标识码　A　文章编号　1000-4890(2008)03-0425-04
Phylosphereandendophyticmicrofloraingreenhousecucumberleaves.WANGZhen-yue,
WANGMin, GAOShu-feng, ZHANGMeng, YUANHong-xia, LIHong-lian(ColegeofPlant
Protection, HenanAgriculturalUniversity, Zhengzhou450002, China).ChineseJournalofEcolo-
gy, 2008, 27(3):425-428.
Abstract:Thephylosphereandendophyticmicrofloraingreenhousecucumberleavesatdiferent
growthstagewereanalyzedbydilutingisolationwithselectivemedia.Atotalof248 microbial
strainswereisolated, and13 generaofphylospherefungiwithAlternariaandPeniciliumasthe
dominant, 4 generaofendophyticfungiwithAspergilusasthedominant, 10 generaofphylo-
spherebacteriawithBacilusandXanthomonasasthedominant, 6generaofendophyticbacteria
withBacilusandPseudomonasasthedominant, 6generaofphylosphereyeastswithCryptococcu
asthedominant, and2 generaofphylosphereactinomycetes(StreptomycesandMicropolpspora)
wereidentified.Noendophyticyeastsandactinomyceteswereisolated.
Keywords:cucumber;phylosphere;endophyte;microflora.
＊河南省教育厅科技攻关资助项目(2000210028)。
＊＊通讯作者 E-mail:honglianli@sina.com
收稿日期:2007-04-09　　接受日期:2007-11-12
　　植物在生长过程中 ,有大量的次生代谢产物从
根系和叶片排出或渗出体外 ,这些代谢产物为各种
微生物的生长提供了充足的营养 ,在植物的根围和
叶围形成了特殊的微环境。长期以来 ,叶围微生物
的研究远远落后于植物根际微生物的研究 ,随着有
害生物的生物防治日益受到重视 ,叶围微生物及其
微环境问题的研究也取得了一些进展 。人们发现 ,
一些叶围特殊的附生菌对病原菌的定殖有极大的影
响(赵新华等 , 2000;王维香和文成敬 , 2004)。在植
物病害生物防治实践中 ,室内试验所表现的拮抗作
用与田间实际控制病原菌种群的能力相关性差(陈
文相和郭文硕 , 2003),这与植物所处的环境关系密
切 ,因而探明叶围微生物的群落种类对于叶部病害
的生物防治极其重要。近年来 ,一些学者先后对小
麦 、棉花 、甜菜 、桃树 、水稻 、苹果 、桑树 、烟草 、毛白
杨 、红松等植物叶围微生物进行了研究(陈文相和
郭文硕 , 2003),对露地黄瓜叶围煤污菌进行了分离
鉴定(张玉华等 , 1994)。
植物体内普遍存在着内生菌 ,植物内生菌与植
物之间存在着一种复杂的微生态关系(文才艺等 ,
2004;石晶盈等 , 2006),植物内生菌并不引起寄主植
物明显的症状 ,有的内生菌在一定条件下可成为拮
抗菌(Sturzetal., 1999;周成等 , 2002),内生菌生长
繁殖相对稳定 ,是很好的生防资源 ,有些内生菌还有
生态学杂志 ChineseJournalofEcology　2008, 27(3):425-428　　　　　　　　　　　　　
DOI :10.13292/j.1000-4890.2008.0113
促生作用(卢镇岳等 , 2006),有的已用于植物病害
的生物防治 (邹文欣和谭仁祥 , 2001;闫孟红等 ,
2004;苗则彦等 , 2006)。
黄瓜(Cucumissativus)是北方温室栽培的主要
蔬菜 ,因温室栽培环境湿度高 ,病害发生重 ,危害大 。
但温室高湿 、相对稳定的环境条件也为微生物生防
因子发挥稳定的生防作用创造了条件 。因此 ,本研
究的目的就是弄清温室黄瓜叶部微生物区系的种
类 ,这对于黄瓜叶部病害生防因子的筛选 、对于叶部
病害的生物防治具有重要意义 。
1　材料与方法
1.1　供试材料
选取河南农业大学科教园区温室试验田种植的
津优 3号黄瓜 (感病品种)和新世纪黄瓜(抗病品
种)叶片 ,生长期间不施用农药 ,种子由河南农业大
学豫艺公司提供;部分黄瓜叶片采自郑州郊区生产
温室。
分离所用培养基包括如下培养基:
1)分离真菌用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(马铃
薯 200g、葡萄糖 20g、琼脂 20g、H2O1 000ml)和马
丁氏培养基(葡萄糖 10.0 g、蛋白胨 5.0 g、KH2PO4
1.0g、MgSO4 0.5g、琼脂 20.0g、H2O1 000 ml),使
用前加入 1%的孟加拉红水溶液 3.3 ml· L-1和
1.5%的硫酸链霉素 0.3 ml· L-1。
2)分离酵母菌用豆芽汁培养基(黄豆芽 200 g、
蔗糖 27g、琼脂 20g、H2O1L、pH4.5)、酵母蛋白胨
葡萄糖培养基(葡萄糖 20 g、胰蛋白胨 20 g、酵母提
取物 10 g、H2O1 L、pH5.0 ～ 5.5)和 McClary培养
基(葡萄糖 1.0 g、KCl1.8 g、酵母汁 2.5 g、醋酸钠
8.2g、琼脂 20 g、H2O1 L)。
3)分离细菌用牛肉膏蛋白胨培养基 (牛肉膏
5.0g、蛋白胨 10.0 g、NaCl5.0 g、琼脂 20.0 g、H2O
1 ml、pH7.0)。
4)分离放线菌用精氨酸甘油琼脂培养基(精氨
酸 1 g、甘油 12.5 g、K2HPO4 1 g、MgSO4· 7H2O0.5
g、NaCl1 g、ZnSO4 · 7H2O0.001 g、CuSO4· 5H2O
0.001 g、Fe2 (SO4 )3 · 6H2O0.01 g、MnSO4 · H2O
0.001g、琼脂 20.0g、H2O1L)和改良高氏一号培养
基(可溶性淀粉 20.0 g、KNO3 1.0 g、K2HPO4 0.5 g、
MgSO4· 7H2O0.5 g、NaCl0.5 g、琼脂 20.0 g、FeSO4
· 7H2O0.01g、H2O1 000ml),使用前加入 3%重铬
酸钾 3.3ml·L-1 ,以抑制细菌和真菌的生长。
1.2　黄瓜叶围微生物的分离
在黄瓜整个生育期中 ,分苗期 、开花期 、衰老期
分别对黄瓜抗病 、感病品种不同叶位的叶片进行随
机取样 ,每一叶位取 10片叶 。用直径 0.8 cm的打
孔器打取新鲜采集的黄瓜叶片 ,每叶打取 2片 ,共取
40个小圆片 ,置于 20 ml无菌水中充分振荡(摇床
170 r· min-1 , 2 h)(张玉华等 , 1994;周育等 ,
2006)。将摇匀的冲洗原液稀释成一系列的浓度:
原液 、10-1原液 、10-2原液 、10-3原液 、10-4原液 。
取上述各浓度样品液 0.5 ml,分别均匀涂布于
分离细菌和酵母菌的培养基平板上 ,将培养皿倒置
于 28℃的生化培养箱中 , 2 ～ 3d后检查 、计数;取上
述各浓度样品液各 0.5 ml,分别均匀混合于分离真
菌和放线菌的培养基 ,将分离真菌的培养皿倒置于
26℃的生化培养箱中 , 3 ～ 5 d后检查 、计数;将分离
放线菌的培养皿倒置于 28 ℃的生化培养箱中 , 5 ～ 8
d后检查 、计数(赵新华等 , 2000)。在平板上出现频
率≥20%的菌株 ,确定为优势类群。选取不同形态
菌落 ,转管培养 ,做进一步鉴定。
1.3　黄瓜叶片内生菌的分离
将采摘的新鲜黄瓜叶片经流水冲洗 2 h后 ,晾
干 ,用直径 0.8 cm的打孔器打取叶片 ,每叶取 2片 ,
共计 40个小圆片 ,用 70%的酒精表面消毒 1 min,
再用 15%的 H2O2表面消毒 3 min,无菌水冲洗 3次
(项勇等 , 2002;李艳琴等 , 2003),放入无菌研钵中
研碎 ,加入 10ml无菌水 ,梯度稀释 ,分离培养同上。
最后一次的冲洗液分别涂布于牛肉膏蛋白胨培养基
平板 、PDA平板 、豆芽汁蔗糖培养基 、YPD平板和改
良高氏 1号平板 ,检测表面消毒是否彻底。观察计
数时在平板上出现频率≥20%的菌株 ,确定为优势
类群 。根据菌落特征 ,将不同菌株分别转管培养 ,做
进一步鉴定。
1.4　微生物的鉴定
1.4.1　真菌　对分离到的真菌 ,主要依据真菌鉴定
手册 、真菌学及植物病原真菌学上面的检索表 ,鉴定
到属 。对一些常见的典型真菌 ,可依据菌丝分枝和
孢子形态直接鉴定到属 ,对于不产孢子的真菌 ,诱导
其产生孢子后鉴定。参阅相关文献(魏景超 , 1979;
戴芳澜 , 1987;喻璋和任国兰 , 1999;戴芳澜 , 2001)进
行鉴定。
1.4.2　细菌　根据常见细菌系统鉴定手册(东秀
珠和蔡妙英 , 2001)和伯杰细菌鉴定手册 (Buchan-
nan＆Gibbonr, 1984)依据细菌形态 、菌落颜色 、芽孢
426 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生态学杂志　第 27卷　第 3期　
染色 、革兰氏染色 、鞭毛染色和生理生化等特征 ,进
行鉴定 。
1.4.3　酵母菌　根据菌落颜色 、无性繁殖方式 、芽
殖方式 、掷孢子有无 、营养细胞形状 、子囊形状 、子囊
孢子形状 、节孢子形状 、麦芽汁中形成醭 、硝酸盐同
化 、发酵葡萄糖 、类淀粉化合物形成和肌醇同化等性
状 ,参阅中国真菌总汇(戴芳澜 , 2001)进行鉴定。
1.4.4　放线菌　根据孢囊的有无 、基质菌丝的有
无 、气生菌丝的有无 、孢子是否只产生在气生菌丝和
基质菌丝 、孢子是否成链或单生 、革兰氏染色 、细胞
壁类型等特征 ,参阅放线菌(Waksman, 1974)进行
鉴定。
2　结果与分析
2.1　黄瓜不同生育期叶部微生物分离结果
黄瓜不同生育期叶部微生物分离结果见表 1,
各种叶围微生物的数量随着生育期的延长而增加 ,
而内生真菌和细菌数量则相对稳定 , 变化不明显 。
没有分离到内生的酵母菌和放线菌。
表 1　黄瓜不同生育期叶部微生物分离结果(株)
Tab.1　 Isolatedresultofmicroorganismsindifferent
growthstagesofcucumber
生育期 真菌叶围 内生
细菌
叶围 内生
酵母菌
叶围 内生
放线菌
叶围 内生
苗 期 18 4 8 6 5 0 3 0
开花期 37 6 18 7 11 0 15 0
衰老期 46 6 22 7 12 0 17 0
2.2　黄瓜叶部真菌分离鉴定
共分离出黄瓜叶围真菌 101株 ,根据菌落特征 ,
初步归为 25种类型 ,经鉴定分别属于青霉属(Peni-
cilium)、毛壳属(Chaetomium)、链格孢属(Alternar-
ia)、木霉属(Trichoderma)、镰刀菌属(Fusarium)、顶
柱霉属(Acrocylindrium)、曲霉属(Aspergilus)、单头
孢霉属(Monotospora)、葡萄孢属(Botrytis)、枝孢霉
属(Cladosporium)、聚端孢霉属(Trichothecium)、根
霉属(Rhizopus)、长蠕孢属(Helminthosporium)等 13
个属 ,其中优势类群为:链格孢菌和青霉菌 。
共分离出黄瓜叶片内生真菌 16株 ,根据菌落特
征 ,初步归为 5种类型 ,经鉴定分别属于链格孢属 、
曲霉属 、枝孢霉属和镰刀菌属 ,优势类群为曲霉菌。
2.3　黄瓜叶部细菌分离鉴定
共从黄瓜叶片分离出叶围细菌 48株 ,根据菌落
特征 ,初步归为 15种类型 ,经鉴定分别属于黄杆菌
属(Flavobacterium)、葡萄球菌属(Staphylococus)、假
单胞菌 属 (Pseudomonas)、黄单 胞 菌属 (Xan-
thomonas)、芽孢杆菌属 (Bacilus)、不动细菌属
(Acinctobacter)、库特氏菌属 (Kurthia)、足球菌属
(Pediococcus)、欧文氏菌属 (Erwinia)、氮单胞菌属
(Azotobacter)等 10个属 ,其中优势类群为芽孢杆菌
(Bacilus)和黄单胞菌(Xanthomonas)。
共从黄瓜叶片分离出内生细菌 20株 ,根据菌落
特征 ,初步归为 8种类型 ,经鉴定分别属于芽孢杆菌
属 、假单胞菌属 、黄杆菌属 、土壤杆菌属(Agrobacteri-
um)、欧文氏菌属和黄单胞菌属等 6个属 ,其中优势
类群为芽孢杆菌和假单胞菌(Pseudomonas)。
2.4　黄瓜叶部酵母菌分离鉴定
共从黄瓜叶片分离出叶围酵母菌 28株 ,根据菌
落特征 ,初步归为 8种类型 ,经鉴定分别属于瓶形酵
母属(Pityrosporum)、毕赤酵母属 (Pichia)、酵母属
(Saccharomyces)、红酵母属(Rhadotorula)、隐球酵母
属(Cryptococcus)、酵母状外子囊属(Yeast-likeforms
ofTaphrina)等 6个属 ,其中优势类群为隐球酵母
(Cryptococcus)。未分离出内生酵母菌。
2.5　黄瓜叶部放线菌分离鉴定
共分离出黄瓜叶围放线菌 35株 ,根据菌落特
征 ,初步归为 16种类型 ,已鉴定 2种类型 ,分别属于
链霉菌属(Streptomyces)和小多孢菌属(Micropolpspo-
ra)。其余叶围放线菌待鉴定 。未分离出内生放
线菌 。
分离内生菌的黄瓜叶片用 70%的酒精表面消
毒 1 min,再用 15%的 H2O2表面消毒 3min,无菌水
冲洗 3次后 ,最后一次的冲洗液分别涂布于牛肉膏
蛋白胨培养基平板 、PDA平板 、豆芽汁蔗糖培养基
平板 、YPD平板和改良高氏 1号平板上培养 1周后 ,
平板上没有微生物长出 ,表明表面消毒效果可靠 ,内
生菌分离结果可信 。
3　结论与讨论
研究表明 ,在温室黄瓜叶片内外存在着大量的
微生物 ,且叶围各类微生物的数量均随着植株生育
期的延长而增加 , 共分离鉴定出 13个属的叶围真
菌 ,其中链格孢属和青霉属为优势属;4个属的内生
真菌 ,曲霉属为优势属;10个属的叶围细菌 ,芽孢杆
菌属和黄单胞菌属为优势属;个属的内生细菌 ,芽孢
杆菌和假单胞菌为优势类群;6个属的叶围酵母菌 ,
隐球酵母属为优势属;鉴定出 2个属放线菌。未分
427王振跃等:温室黄瓜叶部微生物区系
离到内生酵母菌和放线菌 。
张玉华等(1994)在山东 8个地市的露地黄瓜
叶围分离到 6个属的霉污菌 ,即链格孢属 、枝孢属 、
短枝霉属 (Aureobasidium)、附球孢属(Epicoccum)、
腐质霉属(Humicola)和弯孢霉(Curcularia),其中链
格孢属和枝孢属为优势属 ,后面的 4个属在温室黄
瓜叶围均未分离到 ,而在室内分离到的多数属和优
势属与露地的分离结果也不相同 ,这种差异可能与
植株的栽培方式 、环境条件有关 ,因此在生物防治时
要充分考虑到这种差异。
从温室黄瓜叶片分离到内生细菌 6个属 ,这与
田雪亮和单长卷(2006)对黄瓜种子及幼苗内生细
菌的分离结果是基本一致的 ,不同的是 ,本研究多分
离到一个黄杆菌属 ,他们比本研究多分离到一个短
小杆菌属(Curtobacterium)。不同地理环境 、气候条
件 、生境 、品种以及同一植物的不同组织的内生菌组
成都有较大差别 (邹文欣和谭仁祥 , 2001),其种群
数量主要取决于植物种类 、基因型 、组织 、生育期和
外界环境条件等因素(田雪亮和单长卷 , 2006)。本
研究表明 ,在环境相对稳定的温室条件下黄瓜不同
生育期叶片内生菌的种类和数量是相对稳定的 。
本研究首次从黄瓜叶围分离到 6个属的酵母菌
和 35株放线菌 ,这些菌株对黄瓜叶部病原的拮抗作
用 、在黄瓜叶部定殖性能 、防病效果及对黄瓜生长的
影响 ,目前正在进行研究 ,并筛选出 2个对黄瓜灰霉
病菌和炭疽病菌有很强拮抗作用的生防菌株(另文
发表)。
在植物不同部位 ,如叶片 、叶柄 、茎 、根等的内生
菌种类是不同的(Blodgetetal., 2000)。本试验分
离到的内生菌 ,仅仅是黄瓜叶片组织中能在供试培
养基上生长的菌株 ,要明确黄瓜其它部位及叶片组
织中所有内生菌的种类 ,还有待于进一步的工作并
尝试其它分离 、培养和鉴定方法 ,如采用更多种类的
培养基 、厌氧条件培养或分子生物学鉴定方法等 。
由于工作量大及条件所限 ,对分离到的大多数菌株
只鉴定到属 ,未对所有菌株进行系统鉴定 ,鉴定工作
还有待进一步开展。
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作者简介　王振跃 , 男 , 1958年生 , 副教授。主要从事植物
病害综合治理研究 , 发表论文 20余篇。 E-mail:wzy.01@
163.com
责任编辑　张雪姝
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