全 文 ：高良姜叶枯病病原菌的分离和鉴定
陈旭玉，甘炳春，冯锦东* (中国医学科学院﹠北京协和医学院，药用植物研究所海南分所，海南省南药资源保护与开发重点实验室，
海南万宁 571533)
摘要 ［目的］明确高良姜叶枯病病原菌。［方法］病原菌从高良姜感病组织上分离并依据柯赫氏法则进行致病性测定，病原菌的鉴定
主要通过形态鉴定和 ITS序列分析。［结果］高良姜叶枯病病原菌确定为可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)，属子囊菌门(Ascomy-
cota)，座囊菌纲(Dothideomycetes)，葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales)，葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)，毛色二孢属(Lasiodiplodia)。
［结论］首次报道高良姜叶枯病病原菌为可可毛色二孢。
关键词 高良姜;叶斑病;可可毛色二孢
中图分类号 S573 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2014)16 －05031 －02
Isolation and Identification of the Pathogen of Leaf Blight of Alpinia officinarun Hance
CHEN Xu-yu，FENG Jin-dong et al (Hainan Provincial Key Laboratory of Ｒesources Conservation and Development of Southern Medi-
cine，Hainan Branch Institute of Medicinal Plant，Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College，Wanning，Hainan
571533)
Abstract ［Objective］ In order to identify the pathogen causing the A． officinarun leaf blight disease． ［Method］The pathogen was isolated
and purified from the infected A． officinarun according to koch＇Ｒule，and its pathogenicity to the host was tested． The pathogen was identified
according to its characters and rDNA ITS sequences analysis． ［Ｒesult］The pathogen was identified as Lasiodiplodia theobromae，belonged to
Ascomycota，Dothideomycetes，Botryosphaeriales，Botryosphaeriaceae，Lasiodiplodia． ［Conclusion］First reported leaf blight disease on A．
officinarun is L． theobromae．
Key words Alpinia officinarun;Leaf blight disease;Lasiodiplodia theobromae
基金项目 国家星火计划重大项目“海南经济林下间作技术集成与应用”。
作者简介 陈旭玉(1981 －) ，女，海南临高人，助理研究员，从事南药植
物保护研究。* 通讯作者。
收稿日期 2014-05-09
高良姜(Alpinia officinarum Hance)属姜科山姜属多年
生草本植物，以根茎入药，是一种常见的南药［1］。其性热、
味辛，具有温中、散寒、理气、止痛的功效［2］。高良姜主产于
广东、广西、福建、台湾、海南、云南等地，在海南陵水、万宁、
儋州等都有栽培［3 － 4］。海南种植的几块高良姜基地都发现
叶枯病，严重影响了高良姜的发展。发病的叶片多从叶尖
叶缘开始发病，病斑近圆形或不规则形，灰褐色，干斑病斑
黄褐色，中央有灰白色，病健交界处有明显的黄色晕圈和较
宽的褐色分界线。严重者整个叶片变黄干枯(图 1)。目前
国内外尚未见对高良姜叶枯病的研究，为了明确叶枯病的
病原菌和有效控制叶枯病的蔓延，笔者对高良姜叶枯病病
原菌进行研究，旨在为高良姜叶枯病的防治提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料 从海南省万宁市药用植物研究所海南分所南药
园等多个地点采集具有典型症状的高良姜叶枯病病叶，组织
分离法获得菌株，纯化后，转入试管保存备用。
1． 2 方法
1． 2． 1 病原菌分离与纯化。将具有典型症状的高良姜叶片
用清水清洗干净，用75%乙醇浸泡1 min，用无菌水冲洗3 ～4
次，再浸入 10%次氯酸钠中消毒 2 min，用无菌水冲洗 3 ～ 4
次。用解剖刀切下病健交界处在 PDA 培养基上培养，挑取
形态不同的单菌落于新培养基上培养。采用琼脂平板稀释
纯化法进行纯化，再将纯化的菌株分别转入试管斜面保存以
供测定。
1． 2． 2 病原菌致病性测定。将菌株的菌丝块分别接种于健
康无病的叶片，采用刺伤的接种方法，接种后保湿。以接种
无菌的琼脂块作为对照，逐日观察并记录其发病情况。
1． 2． 3 病原菌形态学观察。将柯赫法则验证后的菌株在
PDA 培养基上培养 30 d，观察菌落的颜色和形状，用显微镜
观察分生孢子梗、分生孢子的形态。
1． 2． 4 病原菌分子鉴定。使用 TIANGEN生化科技有限公
司植物基因组试剂盒(DP320-02)进行真菌 DNA 提取，具体
步骤参照其说明书。以真菌 DNA为模板，ITS1 /ITS4 为引物
进行 PCＲ 扩增。其序列为:ITS1:5 TCCGTAGGTGAACCT-
GCGG －3;ITS4:5TCCTCCGCTTATTGATATGC － 3。扩增反
应体系为:模板(真菌 DNA)0． 5 ～1． 0 μl，ITS1(10 μm)1 μl，
ITS4(10 μm)1 μl，2 × Master Mix 12． 5 μl，ddH2O 10 μl，PCＲ
扩增程序为:预变性 94 ℃ 5 min;变性 94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，
72 ℃ 45 s，35个循环;最后 72 ℃延伸 7 min。
2 结果与分析
2． 1 病原菌的致病性 通过菌块接种法，3 d后发现该病原
菌浸染的高良姜表现出与田间发病植株相同的症状，并从中
再次分离到该病原菌。而空白对照无症状出现(图 2)。
2． 2 病原菌鉴定 高良姜叶枯病原菌序列与 NCBI (ht-
tp:/ /www． ncbi． nlm． nih． gov)上相似序列比对结果表明，该
菌株与 Lasiodiplodia theobromae(JX275790)的序列相似性为
99%，结合形态特征，将该病原菌鉴定为可可毛色二孢
(Lasiodiplodia theobromae)。属子囊菌门(Ascomycota) ，座囊
菌纲(Dothideomycetes) ，葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales) ，葡
萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae) ，毛色二孢属(Lasiodiplo-
dia) ，病原菌孢子形态见图 3。
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2014，42(16):5031 － 5032 责任编辑 李占东 责任校对 李岩
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2014.16.068
图 1 高良姜叶枯病的症状
图 2 柯氏法则验证
3 结论与讨论
目前对高良姜的道地性、化学成分、药理作用等方面开
图 3 病原菌孢子形态
展了大量研究，但尚无高良姜病害的研究报道。为明确该病
病原菌和有效控制病害的发生，该研究对病原菌进行分离并
结合形态学特征和 DNA分子序列将该病原鉴定为可可毛色
二孢。可可毛色二孢是常见的病原菌之一，常引起枝枯病、
裂皮病，褐腐病、果腐病等［5 －9］，该研究首次报道高良姜叶枯
病病原菌确定为可可毛色二孢，为有效防治该病害和深入研
究提供基础。
参考文献
［1］吴开芬，陈河清．南药高良姜的驯化栽培［J］．中国热带农业，2005(4):
29．
［2］国家药典委员会．中华人民共和国药典:2010 年版一部［S］．北京:中
国医药科技出版社，2010:270．
［3］杨全，严寒静，庞玉新，等．南药高良姜药用植物资源调查研究［J］．广
东药学院学报，2012，28(4):382 －386．
［4］陈艳芬，江涛，唐春萍，等．高良姜总黄酮抗炎镇痛作用的实验研究
［J］．广东药学院学报，2009，25(2):188 －191．
［5］邹东霞，廖旺姣，黄乃秀，等． 8 种杀菌剂对桉树枝枯病病原菌室内毒力
测定［J］．林业科技开发，2013，27(1):38 －40．
［6］韩晓敏，梁良，张争，等．可可毛色二孢菌对白木香产生倍半萜诱导作
用［J］．中国中药杂志，2014，39(2):192 －195．
［7］王志龙，谭志文，何月秋，等．黄山栾树裂皮病和病原鉴定［J］．林业科
学，2012，48(10):95 －97．
［8］史国英，胡春锦，罗掉爱，等．毛葡萄穗轴褐腐病病原菌鉴定及其生物
学特性［J］．植物病理学报，2010，40(3):242 －249．
［9］董章勇，罗梅，宾淑英，等．沙田柚果腐病病原菌的鉴定与生物学特性
［J］．中国农学通报，2013，29(22):
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
125 －128．
(上接第 5023页)
［4］许时婴，张晓鸣，夏书芹，等．微胶囊技术［M］．北京:化学工业出版社，
2006．
［5］范光龙，张华．复凝聚薄荷油微胶囊的制备［J］．天津工业大学学报，
2009(5):14 －18．
［6］孙锋，邱芳萍，王志兵．复凝聚法制备香蕉油香精微胶囊技术的研究
［J］．中国调味品，2009(3):69 －71．
［7］李武明，张玲华，杨汝德．双歧杆菌的微囊化研究［J］．广东药学院学
报，1997(4):14 －17．
［8］李鹤，迟德富，宇佳，等．复凝聚法制备昆虫蜕皮激素微胶囊及其性能
［J］．化工进展，2010(9):1730 －1736．
［9］马丽杰，赵静．壳聚糖 /木质素磺酸钠复凝聚法制备生物农药微胶囊
［J］．北京化工大学学报:自然科学版，2006(6):51 －56．
［10］周小敏，于秋生，陈正行．复合凝聚法制备阿维菌素微胶囊［J］．江苏
农业科学，2013(6):104 －107．
［11］陆继锋，金劲松．复凝聚法制备农药微脱囊的研究［J］．安徽农业科
学，1999(3):201 －203．
［12］CHANG C P，LEUG T K，LIN S M，et al． Ｒelease properties on gelatin －
gum arabic microcapsules containing camphor oil with added polystyrene
［J］． Colloids and Surfaces B-Biointerfaces，2006，50:136 －140．
［13］韩路路，毕良武，赵振东，等．微胶囊的制备方法研究进展［J］．生物质
化学工程，2011(3):41 －46．
［14］许燕滨，杨汝德，陈惠音．双歧杆菌微胶囊特性研究［J］．四川食品与
发酵，1998(4):24 －26．
［15］游红，周兴苗，徐家文，等．抗紫外线降解苏云金芽胞杆菌微胶囊剂的
制备工艺［J］．华中农业大学学报，2009(3):281 －285．
［16］JOHNSON F S． Averagelatitudinal variation in ultraviolet radiation at the
earth’s surface［J］． Photochem Photobioll，1976，23:179 －188．
［17］王利平，代林远，李鹏．苏云金芽孢杆菌研究进展［J］．中国畜牧兽医，
2011(9):224 －227．
2305 安徽农业科学 2014 年